図 1. 乳癌の内分泌療法とその耐性機序 AIはより適切なホルモン療法として, 閉経後患者の進行再発治療や術後補助療法で抗エストロゲン剤より優先されることとなった卵巣機能の遮断は閉経前 ER 陽性乳癌に対する有効な治療戦略の一つであるが, エストロゲン枯渇耐性の獲得は ER 陽性乳癌でホルモン療法

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けんじのしろ
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1 内分泌甲状腺外会誌特集１乳癌薬物療法の新展開乳癌のアロマターゼ阻害剤耐性機序東北大学大学院医学系研究科分子機能解析学分野* 横浜労災病院乳腺外科** 林慎一* 木村万里子*, ** Resistant mechanisms of aromatase inhibitors in breast cancer Department of Molecular and Functional Dynamics, and Center for Regulatory Epigenomics and Diseases, Tohoku University Graduate School of Medicine*, Department of Breast Surgery, Yokohama Rosai Hospital** Shin-ichi Hayashi* and Mariko Kimura*,** エストロゲン受容体 ER 陽性乳癌ではホルモン療法が有効であるもののおよそ３分の１は再発する再発のメカニズムは数多く研究されてきたが完全に解明されたわけではなくホルモン療法耐性特にアロマターゼ阻害剤 AI 耐性は代替的な細胞内ERシグナルの獲得が関係すると考えられている筆者らは癌組織検体と癌細胞株でERの転写活性をモニタリングすることでそのメカニズムを研究してきたエストロゲン応答配列 ERE- GFPアデノウィルス試験ではAI無効例は多様なER活性を示し抗エストロゲン剤への感受性も様々であったがこれは耐性には複数の機序が存在することを示唆しているまた ERE-GFP導入ER陽性乳癌細胞株からAI耐性を模倣する６種類の異なるタイプの耐性株を樹立しリン酸化依存性やアンドロゲン代謝物依存性など複数の代替的なER活性化経路がAI耐性に関わることを明らかにしたフルベストラントやmTOR阻害剤への反応も個々の耐性株で異なっていたこれらの結果はER陽性乳癌の分類をさらに細分化することがホルモン療法だけでなく新しい分子標的薬などの治療選択に極めて重要であることを示唆している Key words エストロゲン受容体 estrogen receptor アロマターゼ阻害剤 aromatase inhibitor ホルモン療法 hormonal therapy アンドロゲン androgen mtor mtor ストロゲン剤治療でありもう一つはエストロゲンの合成はじめにを阻害するアロマターゼ阻害剤 AI によるエストロゲエストロゲンは乳癌の進行に中心的な役割を果たしておン枯渇療法であるこれらのホルモン療法は乳癌の予後をりエストロゲンシグナルを阻害するホルモン療法はきわ著しく改善した約70 の乳癌はERα発現腫瘍でありめて有効でありかつ重要である現在ホルモン療法には ERαを標的とするホルモン療法の対象となる ER陽性乳２つの治療戦略が存在する図 1 一つはエストロゲン癌におけるホルモン療法は重篤な有害事象を伴わない非常受容体α ERα に競合的に結合し作用を阻害する抗エに有効な治療法であり進行再発乳癌だけでなく補助療法の局面でも広く使用されている１しかしながら一定数の再発は避けられずホルモン療法耐性特にタモキシ別冊請求先宮城県仙台市青葉区星陵町２-１東北大学大学院医学系研究科分子機能解析学分野 address shin@med.tohoku.ac.jp 68 林慎一フェン TAM 耐性に対する臨床試験が数多く行われている２一方 AIは様々な場面においてTAMに勝ることが大規模臨床試験で証明されている３そのため日本内分泌甲状腺外科学会雑誌第32巻第２号

図 1. 乳癌の内分泌療法とその耐性機序 AIはより適切なホルモン療法として, 閉経後患者の進行再発治療や術後補助療法で抗エストロゲン剤より優先されることとなった卵巣機能の遮断は閉経前 ER 陽性乳癌に対する有効な治療戦略の一つであるが, エストロゲン枯渇耐性の獲得は ER 陽性乳癌でホルモン療法耐性が進展し, 腫瘍がより悪性化する上で重要なステップといえるエストロゲン枯渇耐性の機序は,

2 図 1. 乳癌の内分泌療法とその耐性機序 AIはより適切なホルモン療法として, 閉経後患者の進行再発治療や術後補助療法で抗エストロゲン剤より優先されることとなった卵巣機能の遮断は閉経前 ER 陽性乳癌に対する有効な治療戦略の一つであるが, エストロゲン枯渇耐性の獲得は ER 陽性乳癌でホルモン療法耐性が進展し, 腫瘍がより悪性化する上で重要なステップといえるエストロゲン枯渇耐性の機序は, いくつかの施設でエストロゲンを除去した培地で長期間培養された細胞を用いて研究されてきた [4~6] これまでの報告では, 耐性株は MAPKや PI3K/Aktシグナル経路とのクロストークや膜 ERの関与 [7] によってエストロゲン過敏性を獲得することが示唆されているしかし, 正確なメカニズムは十分理解されているとはいえず, また耐性に関係する他のメカニズムが存在するかという点も含め, 多くの疑問が残されている筆者らはエストロゲン応答配列 ( ERE-) GFPアデノウィルス試験で再発検体を解析し, ER 活性と抗エストロゲン剤への感受性は各症例によって異なることを見出した [8] この問題に取り組むため, われわれは ER 陽性乳癌細胞株 MCF-7,T47Dを用いてAI 治療を模倣するいくつかの培養条件からコロニーを単離し, 複数の細胞株を樹立した MCF-7,T47Dには以前確立した定常的に ERE- GFPレポーター遺伝子を組み込んだ細胞を親株として使用した [9] この細胞は ER 活性を反映して GFPが発現するため, 生細胞において蛍光をみることで ER 活性を評価することができるこのシステムを用いて AI 耐性を模倣する6 種類のクローン株を樹立し, その性質を解明した今回われわれはこれらの複数の AI 耐性メカニズムを概観し, AI 耐性乳癌に対する次治療としてのフルベストラントや mtor 阻害剤の有効性にも触れる再発乳癌におけるAI 治療後のER 活性 AI 無効化における ERの関与を解明するため, AI 治療後の再発腫瘍の ER 活性を筆者らが開発した ERE-GFPアデノウィルス試験で分析した [8~10] 10 例中 5 例では有意な ER 活性を示し, そのほとんどはフルベストラントなどの抗エストロゲン剤に対して程度の差はあれ, 感受性をもっていた ( 未投稿データ ) この結果, 再発例において AI 耐性の機序は単一ではなく, 二次ホルモン療法の感受性も様々であることが示されたこれは臨床において観察される治療反応性とよく一致する複数のAI 耐性機序をモデル化する細胞の樹立 AI 耐性機序の研究では,ERE-GFPを組み込んだMCF-7 ( E10), T47D( TE8) から異なる耐性機序を示す6 種類の耐性株を樹立した ( 図 2 ) これらの耐性株の特徴を解明することで, AI 耐性の機序は3つのカテゴリーに分類されることが明らかになった ( 図 3 ) まず第 1にアロマターゼに依存しない経路によるエストロゲン生合成やエストロゲン様作用をもったアンドロゲン代謝産物の供給によって,AIの効果が回避されるもの(Type4,5 細胞 ) である第 2に細胞内リン酸化シグナル経路を経由した ERのエストロゲン非依存的活性化に関係するもの ( Type1 細胞 ), そして三番目は ER 非依存的に増殖するメカニズムを獲得するもの ( Type2, 3, 6 細胞 ) である以下これらのメカニズムについて解説する ERに対するアロマターゼ非依存的リガンドの合成第一の耐性メカニズム ( Type4 細胞 ) の例では, E10 細胞は3カ月間ステロイド除去かつテストステロン添加の条日本内分泌甲状腺外科学会雑誌第 32 巻第 2 号 69

3 図 2. 樹立した耐性機序の異なる 6 種類の乳癌細胞株図 3. エストロゲン非依存性 (AI 耐性 ) のメカニズム OATP:organic anion transporter peptides, STS:steroid sulfatas e 件で培養された ( AI 治療条件を模倣している ) 生存細胞のなかから GFP 発現をモニターすることで ER 活性を示す安定的なバリアントを選択したこのバリアント細胞株ではアンドロゲンや 5α-androstane-3β,17 β-diol(3 β -diol) によってエストロゲン応答配列が誘導され, 細胞が増殖した [ 11] この細胞株では HSD3B1の発現が上昇, アンドロゲン受容体 ( AR) の発現が低下してアンドロゲン過剰条件へ適応し,3β-HSD type1によってジヒドロテストステロン ( DHT) が 3β-diolに変換されていることが判明した異所性の HSD3B1 発現や ARの抑制の結果, アンドロゲン過剰条件へと適応したものである間質細胞との共培養で局所的なアンドロゲンからのエストロゲン産生を模倣したところ, この細胞株では親株 E10より AIに対する感受性が低かったこの結果から, アンドロゲン代謝物はエストロゲン様効果をもち, 生存や増殖をサポートしていることが示唆された ( 図 3A ) さらにわれわれは, 原発乳癌でもこのメカニズムが機能しているものがあり, 補助ホルモン療法への感受性に関与している可能性が認められた [ 12] ER 陽性乳癌におけるアンドロゲン代謝物依存的細胞増殖は AI 耐性機序において, なんらかの役割を果たしていることが示唆される細胞内リン酸化シグナル経路によるERの活性化 MCF-7-E10 細胞を3カ月ステロイド枯渇培地で培養すると, 生存細胞内に ERE-GFPの発現がみられる細胞とみられない細胞のコロニーが出現した生細胞でGFPをみながらこれらを単離し, 別々にクローン化することでエストロゲン枯渇耐性 ( EDR) 細胞株を樹立し, その結果, 高い ER 活性をもつ3つのバリアントと ER 活性をもたない3 つのバリアントが得られた [ 13] ERE-GFP 陽性の3つの EDR 細胞株では ERの過剰発現といくつかの ER 標的遺伝子の高い発現がみられたさらに, 細胞内リン酸化シグナル経路の解析では, 他の報告と同様, リン酸化 ERα(Ser167) とAkt(T308) の著しい変化が認められた [14~16] 包括的リン酸化プロテオミクスでも同じく, Akt 経路が ERα のリン酸化に寄与する可能性が示された結果として, PI3K/ 70 日本内分泌甲状腺外科学会雑誌第 32 巻第 2 号

図 4. ER 陽性乳癌の治療標的 Akt 経路によって ERがリン酸化されて活性化することがこの細胞の増殖に重要であることが示唆された ( 図 3B ) ER 非依存的増殖メカニズムの獲得一方, GFP 陰性細胞株の3つのバリアントは ER 活性を失っており, 前述の3つのGFP 陽性細胞と同様にクローン化すると,c-Jun N-terminal kinase(jnk)

4 図 4. ER 陽性乳癌の治療標的 Akt 経路によって ERがリン酸化されて活性化することがこの細胞の増殖に重要であることが示唆された ( 図 3B ) ER 非依存的増殖メカニズムの獲得一方, GFP 陰性細胞株の3つのバリアントは ER 活性を失っており, 前述の3つのGFP 陽性細胞と同様にクローン化すると,c-Jun N-terminal kinase(jnk) の恒常的活性化が示されたこれは ERE-GFP 陰性 EDR 細胞でみられ, JNK 阻害剤によって抑制された IGF-1R 特異的阻害剤は JNKのリン酸化を消失させたことにより, 新しいシグナル経路である IGF-IR/JNK 経路が ER 非依存的 MCF-7 細胞の増殖に重要であるようだ ( 図 3C ) これらの結果により ER 陽性乳癌細胞は同時に2つ以上の耐性機序を獲得しうることが示唆されたこれは複数の耐性メカニズムが一つの腫瘍内で同時に出現しうることを示しており, 患者個人においても異なる耐性メカニズムが同時に存在しうることを意味するさらに, われわれは AI 耐性として別種の ER 陽性乳癌細胞株であるT-47Dから, 前述の耐性株とは異なる安定的バリアント細胞を樹立した [ 17] 本耐性細胞株では ARと PSAが過剰発現し, エストロゲンによっては増殖が刺激されず, ERの発現もみられなかったこれらの細胞ではアンドロゲンによって著しく増殖が誘導された加えて, マイクロアレイの結果から, 親株に比してバリアント細胞ではアンドロゲン誘導性遺伝子発現プロファイルが著しく高発現していることが認められた ( 図 3D ) そこで,21 例の原発巣と AI 耐性後の転移巣のペア検体で免疫染色を行い, 免疫染色結果では PSAと Ki67が有意に上昇し, ERとプロゲステロン受容体 ( PgR) がいくつかの症例では転移巣において原発巣より低下していることを観察した [ 17] ER 陽性乳癌でも症例によっては ER 依存性から AR 依存性へと腫瘍細胞が変化することで AI 耐性が出現することが示唆された AR 阻害剤は特定の患者群では有効である可能性が示唆された AI 耐性乳癌の治療戦略臨床的に AI 耐性を獲得した乳癌の多くは ER 陽性を維持しており, 現在, AI 耐性乳癌には抗エストロゲン剤であるフルベストラントが多くの場合で使用されているフルベストラントはタモキシフェン同様, 抗エストロゲン剤として ERの機能を阻害すると同時に, タモキシフェンと異なり, ERを分解する作用も有する [ 18] フルベストラントの第 3 相臨床試験である CONFIRM 試験は閉経後 ER 陽性進行再発乳癌を対象に, フルベストラントを2 種の濃度群 ( 250mg 対 500mg) で比較した試験であり, フルベストラント 500mgは忍容性の点で問題なく, 全生存 ( OS) を延長するという結果であった [19] フルベストラントは前述の AI 耐性乳癌細胞株のなかで, ER 陽性を保っている Type1,4,5 細胞には強い増殖抑制効果を示したのに対し, ER 陰転化したType2,3,6 細胞には無効であったつまり, ER 依存性 AI 耐性機序 ( アロマターゼ非依存的リガンド供給やエストロゲン非依存的 ER 活性化 )( 図 1 ) はフルベストラントに感受性をもっているが, ER 非依存的 AI 耐性機序 ( ER 非依存的増殖 ) では無効であることを示す結果であったこれまでの AI 耐性獲得後の乳癌治療はホルモン剤の単剤投与が治療の柱であったが, 基礎研究の結果から AI 耐性乳癌に対する臨床上の治療戦略を考えると, ERが陽性のままであれば, ERシグナル経路と他の増殖推進経路を同時に標的とすることが重要であると考えられる ( 図 4 ) なかでも ER 陽性乳癌では PIK3CAの変異が 28~ 47% みられており [20],PI3K/Akt/mTOR 経路は ERシグナル経路日本内分泌甲状腺外科学会雑誌第 32 巻第 2 号 71

5 との間にクロストークが存在すること, また AI 耐性乳癌ではしばしば PI3K/Akt/mTORシグナル経路の亢進がみられていることから, この経路は重要なターゲットであると考えられている mtor 阻害剤エベロリムスは, 非ステロイド型 AI 耐性の進行再発乳癌において, ステロイド型 AIエキセメスタンとの併用によりエキセメスタン単剤投与と比較し無増悪生存期間を有意に延長する結果となった ( BOLERO2 試験 )[ 21] 同薬剤は全生存では差がつかなかったものの [22], その臨床効果は病勢のコントロールに有益であると報告されている [ 23] AIとエベロリムスの併用は, ホルモン剤と分子標的治療の併用という新たな標準治療の先駆けとして注目され, 現在は同様の薬剤の臨床試験が多く組まれているなかでも, PI3Kを標的とする阻害剤は有効性が期待される薬剤であり, 特にサブユニット特異的 PI3K 阻害剤は汎 PI3K 阻害剤と比較し, 薬剤効果と有害事象の忍容性の点で優れた効果を発揮すると考えられている [ 24] 問題は, ER 陽性乳癌では多くの症例で PI3CAの遺伝子変異がみられるにも関わらず, それが PI3K 阻害剤効果のバイオマーカーにはなっていないことである [25] エベロリムスにおいても同様にバイオマーカーの特定は問題となっており, 基礎研究において, 著者らの PI3K/Akt/mTORシグナル経路が亢進している全てのタイプの AI 耐性細胞に対しても, エベロリムスは高い抗腫瘍効果を示したが, 臨床的にはより薬剤効果の期待できる患者群を選別するマーカーによる治療適用が必要であると考えられるその他, 細胞周期抑制剤やHDAC 阻害剤, プロテアソーム阻害剤など異なるコンセプトに基づいた薬剤も新規治療ターゲットとして検討されているなかでも, CDK4/6 阻害剤 Palbociclibは閉経後 ER 陽性進行再発乳癌における一次治療として, AI 剤レトロゾール単剤と比較し, 併用療法で有意に無増悪生存期間を延長した ( PALOMA-1 試験 )[ 26] しかし, 同試験で設定されたバイオマーカーによる薬剤効果の期待できる群の選別は想定と逆の結果となり, バイオマーカー研究の難しさを露呈することとなった [26] さらに,IGF,MET,Src,MAPKなど他のシグナル経路 [24,27] をターゲットにする阻害剤もまた, 多くは抗エストロゲン剤との併用で臨床試験が施行され始めてきているしかし, 標的の増加がホルモン療法を進歩させるとは単純にいえず, 基礎研究において ER 陽性乳癌の治療標的候補となる薬剤は非常に多く報告され, 各種分子標的治療薬はホルモン療法耐性乳癌に対する有望な戦略の一つと期待されてはいるが, バイオマーカーによる治療対象の選別や, より効果的な薬剤の組み合わせの決定など, 臨床でより効果的に使用するには多くの課題が残されている本邦でも既に, mtor 阻害剤エベロリムスは AI 剤エキセメスタンとの併用で適応可能となったが, 今後, AI 耐性乳癌治療においては内分泌治療薬と分子標的薬の併用が主流となると思われるしかし, どのような順序で, どのように各種内分泌治療薬と新規分子標的薬を組み合わせたら良いのか, 大規模な臨床試験だけでなく, in vitro, in vivo 両面からの細胞内での作用機序を考慮した基礎研究も重要であろう新たなコンパニオンバイオマーカーを見出し, いかに費用対効果を挙げ, 患者の利益に繋げていくか, さらなる基礎と臨床の連携した研究が必要とされる文献 1. Strasser-Weippl K, Goss PE : Advances in adjuvant hormonal therapy for postmenopausal women. J Clin Oncol 23 : , Riggins RB, Schrecengost RS, Guerrero MS, et al. : Pathways to tamoxifen resistance. Cancer Lett 256 : 1-24, Baum M, Buzdar A, Cuzick J, et al. : Anastrozole alone or in combination with tamoxifen versus tamoxifen alone for adjuvant treatment of postmenopausal women with earlystage breast cancer : results of the ATAC (Arimidex, Tamoxifen Alone or in Combination) trial efficacy and safety update analyses. Cancer 98 : , Yue W, Wang JP, Conaway MR, et al. : Adaptive hypersensitivity following long-term estrogen deprivation : involvement of multiple signal pathways. J Steroid Biochem Mol Biol 86 : , Sabnis GJ, Jelovac D, Long B, et al. : The role of growth factor receptor pathways in human breast cancer cells adapted to long-term estrogen deprivation. Cancer Res 65 : , Martin LA, Farmer I, Johnston SR, et al. : Elevated ERK1/ ERK2/estrogen receptor cross-talk enhances estrogenmediated signaling during long-term estrogen deprivation. Endocr Relat Cancer 12(Suppl1) : S75-84, Santen RJ, Song RX, Masamura S, et al. : Adaptation to estradiol deprivation causes up-regulation of growth factor pathways and hyper sensitivity to estradiol in breast cancer cells. Adv Exp Med Biol 630 : 19-34, Gohno T, Seino Y, Hanamura T, et al. : Individual transcriptional activity of estrogen receptors in primary breast cancer and its clinical significance. Cancer Med 1 : , Yamaguchi Y, Takei H, Suemasu K, et al. : Tumor-stromal interaction through the estrogen-signaling pathway in human breast cancer. Cancer Res 65 : , Matsumoto M, Yamaguchi Y, Seino Y, et al. : Estrogen signaling ability in human endometrial cancer through the cancer-stromal interaction. Endocr Relat Cancer 15 : , Hanamura T, Niwa T, Nishikawa S, et al. : Androgen metabolite-dependent growth of hormone receptor-positive 72 日本内分泌甲状腺外科学会雑誌第 32 巻第 2 号

6 breast cancer as a possible aromatase inhibitor-resistance mechanism. Breast Cancer Res Treat 139 : , Hanamura T, Niwa T, Gohno T, et al. : Possible role of the aromatase-independent steroid metabolism pathways in hormone responsive primary breast cancers. Breast cancer Res Treat 143 : 69-80, Fujiki N, Konnno H, Kaneko Y, et al. : Estrogen response element-gfp (ERE-GFP) introduced MCF-7 cells demonstrated the coexistence of multiple estrogen-deprivation resistant mechanisms. J Steroid Biochem Mol Biol 139 : 61-72, Cambell RA, Bhat-Nakshatri P, Patel NM, et al. : Phosphatidylinositol 3-kinase/AKT-mediated activation of estrogen receptor alpha : a new model for anti-estrogen resistance. J Biol Chem 276 : , Castano E, Vorojeikina DP, Notides AC : Phosphorylation of serine-167 on the human oestrogen receptor is important for oestrogen response element binding and transcriptional activation. Biochem J 326 : , Yamashita H, Nishio M, Kobayashi S, et al. : Phosphorylation of estrogen receptor alpha serine 167 is predictive of response to endocrine therapy and increases postrelapse survival in metastatic breast cacer. Breast Cancer Res 7 : R , Fujii R, Hanamura T, Suzuki T, et al. : Increased androgen receptor activity and cell proliferation in aromatase inhibitor-resistant breast carcinoma. J Steroid Biochem Mol Biol 144 : , Miller TW : Endocrine resistance : what do we know? Am Soc Clin Oncol Educ Book, Di Leo A, Jerusalem G, Petruzelka L, et al. : Final overall survival : fulvestrant 500mg vs 250mg in the randomized CONFIRM trial. J Natl Cancer Inst 106 : djt337, Zardavas D, Phillips WA, Loi S : PIK3CA mutations in breast cancer : reconciling findings from preclinical and clinical data. Breast Cancer Res 16 : 201, Baselga J, Campone M, Piccart M, et al. : Everolimus in postmenopausal hormone-receptor-positive advanced breast cancer. N Engl J Med 366 : , Piccart M, Hortobagyi GN, Campone M, et al. : Everolimus plus exemestane for hormone-receptor-positive, human epidermal growth factor receptor-2-negative advanced breast caner : overall survival results from BOLERO-2. Ann Oncol 25 : , Diaby V, Adunlin G, Ali AA, et al. : Using quality-adjusted progression-free survival as an outcome measure to assess the benefits of cancer drugs in randomized-controlled trials : case of the BOLERO-2 trial. Breast Cancer Res Treat 146 : , Zardavas D, Baselga J, Piccart M : Emerging targeted agents in metastatic breaset cancer. Nat Rev Clin Oncol 10 : , Musgrove EA, Sutherland RL : Biological determinants of endocrine resistance in breast cancer. Nat Rev Cancer 9 : , Cadoo KA, Gucalp A, Traina TA : Palbociclib : an evidence-based review of its potential in the treatment of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press) 6 : , Johnston SR, Schiavon G : Treatment algorithms for hormone receptor-positive advanced breast cancer : going forward in endocrine therapy---overcoming resistance and introducing new agents. Am Soc Clin Oncol Educ Book, 2013 日本内分泌甲状腺外科学会雑誌第 32 巻第 2 号 73

関係があると報告もされており卵巣明細胞腺癌において PI3K 経路は非常に重要であると考えられる PI3K 経路が活性化すると mtor ならびに HIF-1αが活性化することが知られている HIF-1αは様々な癌種における薬理学的な標的の一つであるが卵巣癌においても同様であるそこで本研究で

関係があると報告もされており卵巣明細胞腺癌において PI3K 経路は非常に重要であると考えられる PI3K 経路が活性化すると mtor ならびに HIF-1αが活性化することが知られている HIF-1αは様々な癌種における薬理学的な標的の一つであるが卵巣癌においても同様であるそこで本研究で ( 様式甲 5) 氏名髙井雅聡 ( ふりがな ) ( たかいまさあき ) 学位の種類博士 ( 医学 ) 学位授与番号甲第号学位審査年月日平成 27 年 7 月 8 日学位授与の要件学位規則第 4 条第 1 項該当 Crosstalk between PI3K and Ras pathways via 学位論文題名 Protein Phosphatase 2A in human