耐凍剤を用いずに凍結されたマウス骨髄組織に由来する細胞を用いた核移植に関する研究

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このかやたけ
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1 Mem. Institute of Advanced Technology, Kinki University No. 15 : 9 16(2010) 耐凍剤を用いずに凍結されたマウス骨髄組織に由来する細胞を用いた核移植に関する研究中尾丹美 1 加藤博己 2 安齋政幸 2 三谷匡 2 鈴木淳夫 2 1, 松本和也 2 1, 佐伯和弘 2 1, 細井美彦 2 1, 2 入谷明要約本研究ではマウスの耐凍剤を用いずに凍結された骨髄組織から回収された細胞を用いて体細胞核移植 (somatic cell nuclear transfer; SCNT) を行い永久凍土中から発見される動物遺物のような耐凍剤を用いずに非常に長期間不安定な環境下で凍結保存された生物の細胞を SCNT に用いることが可能か否か検討したまず耐凍剤を用いずに凍結保存されたマウスの骨髄細胞の回収と DNA の断片化状態を確認した回収された骨髄細胞を Hoechst で染色し観察したところ核の存在が確認されたコメットアッセイ及びフローサイトメトリーの結果から耐凍剤を用いずに凍結保存された骨髄細胞では多くの細胞の DNA が断片化していることが確認された次に回収した骨髄細胞を核ドナー細胞として SCNT に用いたその結果マウス新鮮骨髄細胞および 80 凍結骨髄細胞を用いた再構築卵子が胚盤胞期にまで発生した (16.9% 及び 1.9%) 以上の結果より耐凍剤を用いずに凍結保存された骨髄細胞は凍結保存されることにより DNA に大きな障害を受けていることが確認されたが SCNT の核ドナー細胞として利用できる可能性も示された緒言近年マウスの副睾丸精巣または個体全体を耐凍剤を用いずに凍結保存しそれらの組織または個体から回収した精子を顕微授精法に用いて正常産子を得たことが報告された 1) また Wakayama らは耐凍剤を用いずに 20 で 16 年間凍結保存されたマウス個体から回収した細胞を用いた核移植胚から一度胚性幹 (ES) 細胞を作製しその ES 細胞を核ドナー細胞に用いることでクローンマウスの作製を報告した 2) Hoshino らは耐凍剤を用いずに 80 で 10 年間凍結保存されたウシ精巣から回収された生きた細胞を培養して増殖させその細胞を SCNT に用いてクローンウシの作製に成功している 3) しかし死亡後相当の時間を経過した生物に由来しかつ耐凍剤を用いずに比較的高温の不安定な環境下で凍結保存された細胞を SCNT の核ドナー細胞として用いる場合その再構築卵子がどのような発生をするかは不明であるそこで本研究では骨組織によって守られているために比較的組織が残りやすいと考えられる骨髄組織に由来する細胞を耐凍剤を用いずに凍結保存したマウス大腿骨より回収し DNA の断片化状態を解析したまた回収した骨髄細胞を核ドナー細胞として用いた SCNT を行い耐凍剤を用いずに長期間不安定な環境下で凍結保存された生物の細胞を SCNT に用いることが可能か否かを検討した 1. 近畿大学大学院生物理工学研究科和歌山県紀の川市西三谷近畿大学先端技術総合研究所和歌山県海南市南赤坂 14-1

2 10 Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University No. 15 (2010) 材料および方法使用動物供試サンプルとして成熟週齢に達した B6C3F1(C57BL/6N C3H/HeN) 雌マウス ( 日本チャールスリバー株式会社 ) から摘出した大腿骨より回収した骨髄組織由来細胞を用いた SCNT に供するレシピエント卵子は成熟週齢の B6D2F1(C57BL/6N DBA/2N) の雌マウス ( 日本エスエルシー株式会社 ) より回収したなお本実験に際して実験の立案や実験動物に関わる取り扱いについては近畿大学動物実験規定に準じて実施した細胞の回収骨髄細胞の回収には大腿部より摘出した大腿骨から直ちに回収した新鮮骨髄細胞大腿骨を 25 冷凍庫にて約 1 年間凍結保存した後に回収した骨髄細胞及び大腿骨を 80 ディープフリーザーにて約 1 年間凍結保存した後に回収した骨髄細胞を用いた骨髄細胞は大腿骨内から 1 PBS(-) で満たした 1mL シリンジに付けた 26G の針で削ぎ落とし溶出して回収された細胞懸濁液は次の処理を行うまで氷上に保管した 25 で凍結保存した骨髄細胞 80 で凍結保存した骨髄細胞はそれぞれ大腿骨を約 1 年間凍結し 37 で融解した後同様の方法で回収した回収細胞における生死細胞の確認回収した骨髄細胞は細胞懸濁液が 5 倍に希釈されるようトリパンブルーを添加して染色し倒立顕微鏡を用いて細胞の生死を観察したまた Hoechst 溶液を細胞懸濁液に添加して回収した骨髄細胞核を染色し蛍光顕微鏡を用いて観察したコメットアッセイ法による DNA 断片化の検査方法は TREVIGEN ComeAssay TM 及び CometAssay TM Silver Staining Kit に従い行った回収した骨髄細胞を低融点アガロースと共にスライド上に展開した Lysis Solution 及び Alkali Solution(DW 49.75mL NaOH 0.6g 200mM EDTA 250μL; ph > 13) により細胞を溶解し DNA を変性させた電気泳動 (31V 12 分間 ) を行った後固定 (DW 30μL Methanol 50μL Acetic Acid 10μL 10 Fixation Additive 10μL) 染色(CometAssay TM Silver Staining Kit) を行い倒立顕微鏡下で観察したフローサイトメトリーによる DNA 断片化の測定操作は Block らの方法を修正して行った 4) 回収した骨髄細胞を RNase A で処理し TNE buffer(20mm Tris 1mM EDTA 100mM NaCl; ph 7.4) で懸濁した細胞懸濁液に Acid-Detergent Solution(0.1% Triton X N HCl 0.15N NaCl; ph 1.2) 及び Acridine Orange Staining Solution(126mM Na2HPO4 37mM citric acid 0.15N NaCl 1mM EDTA 22.1μM acridine orange; ph 6.0) を添加し FACSCalibur を用いて解析した SCNT SCNT 操作は常法に従い行った 5) 過剰排卵処理を行った B6D2F1 雌マウスの卵管膨大部より卵子を回収し 0.1% Hyaluronidase で処理することにより卵丘細胞を除去した卵子の除核及び細胞の注入には

11 倒立型蛍光微分干渉顕微鏡にピエゾマイクロマニピュレーターを取り付けたものを用いた減数分裂中期停止染色体 - 紡錘糸複合体を除核用ピペットで吸引し除核した核ドナー細胞には回収した骨髄細胞を用い除核した卵子に注入した細胞を注入して約 1 時間後に倒立顕微鏡で SCNT 卵子を観察し早期染色体凝集 premature chromosome condasation;

3 11 倒立型蛍光微分干渉顕微鏡にピエゾマイクロマニピュレーターを取り付けたものを用いた減数分裂中期停止染色体 - 紡錘糸複合体を除核用ピペットで吸引し除核した核ドナー細胞には回収した骨髄細胞を用い除核した卵子に注入した細胞を注入して約 1 時間後に倒立顕微鏡で SCNT 卵子を観察し早期染色体凝集 premature chromosome condasation; PCC が起きていることを確認したそして mczb-ca2+ free 培地に 10mM Sr2+ と 5μg/mL Cytochalasin B を添加した培地で 3 時間活性化処理を行い続いて mczb 培地に 5μg/mL Cytochalasin B を添加した培地で 3 時間培養した活性化処理後の卵子は KSOM 培地で 37 6% CO2 インキュベーター内にて胚盤胞期細胞注入後 96 時間まで培養した SCNT 卵子及び SCNT 胚の染色 SCNT 卵子及び SCNT 胚の核染色には Hoechst を用いた mczb 培地 500μL に Hoechet solution 50μL を添加した染色液で 10 分間染色しその後 SCNT 卵子及び SCNT 胚を蛍光顕微鏡を用いて観察した結果回収した骨髄細胞の観察回収した骨髄細胞の可視光像トリパンブルー染色像及び Hoechst による核染色像を示した図 1 温度に関係なく凍結骨髄細胞は新鮮骨髄細胞と比較して萎縮しており大腿骨 1 本から回収することができる細胞が少なく生存していた細胞は少なかった新鮮骨髄細胞 ; 478/ ± 3.7% a c a,b,c: 25 凍結骨髄細胞 ; 57/ ± 1.3% b 80 凍結骨髄細胞 ; 324/ ± 2.6% P < 0.05 が各細胞において核を確認することができた b c d e f g h i a a 図 1 マウス骨髄細胞像回収後 a-c の a 新鮮骨髄細胞 b 25 凍結骨髄細胞 c 80 凍結骨髄細胞トリパンブルー染色 d-f による d 新鮮骨髄細胞 e 25 凍結骨髄細胞 f 80 凍結骨髄細胞 Hoechst g-i による g 新鮮骨髄細胞 h 25 凍結骨髄細胞 i 80 凍結骨髄細胞

4 12 Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University No コメットアッセイによる骨髄細胞の DNA 断片化状態の観察図 2 はコメットアッセイによる骨髄細胞の DNA の断片化状態を示した断片化状態の比較として新鮮な骨髄細胞に約 1J/cm2 の紫外線を照射した骨髄細胞を同様に解析した新鮮骨髄細胞と比較して 25 及び 80 凍結骨髄細胞は共に DNA の断片化が進んだ細胞が多いことが観察された紫外線照射処理骨髄細胞は新鮮骨髄細胞と比較して DNA が断片化している細胞と DNA が断片化していない細胞が共に観察されたしかし温度に関わらず凍結保存した骨髄細胞と比較して DNA の断片化した細胞は少ないことが観察された a b c d 図 2 マウス骨髄細胞のコメットアッセイによる像 a 新鮮骨髄細胞 b 紫外線照射処理新鮮骨髄細胞 c 25 凍結骨髄細胞 d 80 凍結骨髄細胞フローサイトメトリーによる骨髄細胞の DNA 断片化状態の解析図 3 及び表 1 に FACS 装置を用いたフローサイトメトリーによる骨髄細胞の DNA の断片化状態の測定結果を示した断片化状態の比較として新鮮な骨髄由来細胞に約 1J/cm2 の紫外線を照射した骨髄細胞を同様に解析した DNA が断片化していないもしくは断片化の程度が小さい細胞は新鮮骨髄細胞で 98.0 ± 0.2% 紫外線照射処理新鮮骨髄細胞で 78.9 ± 1.5% 80 凍結骨髄細胞で 31.6 ± 2.4% であり 25 凍結骨髄細胞においては回収することができた細胞が少ない為測定した細胞数が少ないものの DNA が断片化していない細胞の割合は 23.9 ± 3.3% であった温度に関わらず凍結骨髄細胞は新鮮骨髄細胞及び紫外線照射処理骨髄細胞と比較して DNA が断片化していない細胞の割合が有意に少なかった P < 0.05

5 13 図 3 マウス骨髄細胞のフローサイトメトリーによる解析結果グラフの X 軸は赤色蛍光強度を Y 軸は緑色蛍光強度を表すドット 1 つ 1 つが細胞を表し緑赤それぞれの蛍光強度に応じてグラフ上にプロットされる R2 領域にプロットされている細胞が骨髄細胞でありこの R2 領域にプロットされている骨髄細胞のうち赤色蛍光の割合が大きい細胞の DNA の断片化の大きい骨髄細胞が属する領域を frag で示しているほとんど蛍光を発していない領域に存在するものはバクテリアなど骨髄細胞以外のものである (a) 新鮮骨髄細胞 (b) 紫外線照射処理新鮮骨髄細胞 (c) 25 凍結骨髄細胞 (d) 80 凍結骨髄細胞 R2 frag R2-frag % (R2-frag) ave.% (R2-frag) ± SE 新鮮骨髄細胞紫外線照射処理新鮮骨髄細胞 ± 0.2 a ± 1.5 b -25 凍結骨髄細胞 ± 3.3 c -80 凍結骨髄細胞 ± 2.4 c 表 1 フローサイトメトリーによる DNA が断片化した骨髄細胞の割合 a,b,c: P < 0.05

6 14 Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University No SCNT 卵子の発生能の検討表 2 には骨髄細胞を核ドナー細胞とした SCNT 卵子の発生率を示した新鮮な骨髄細胞を核ドナー細胞とした SCNT 卵子は 17% の卵子が胚盤胞期胚まで発生した 80 凍結骨髄細胞の核を移植した SCNT 卵子も低率ながら胚盤胞期胚まで発生した 1.9% また 25 凍結骨髄細胞を用いた SCNT 卵子は 4 細胞期胚まで発生し 1.2% その後発生が停止した図 4 には新鮮骨髄細胞を核ドナー細胞として用いた胚盤胞期胚の透過光像ならびに Hoechst による核染色像 80 凍結骨髄細胞を核ドナー細胞として用いた胚盤胞期胚の透過光像ならびに Hoechst による核染色像を示した 80 凍結骨髄細胞由来胚盤胞期胚は新鮮骨髄細胞を核ドナー細胞として用いた胚盤胞期胚と比較して形態が歪であり細胞数が少なかった表2 マウス骨髄細胞由来再構築卵子ならびに胚の発生成績 a b c d 図 4 マウス骨髄細胞を用いた核移植後における胚盤胞期胚の観察新鮮骨髄細胞由来胚盤胞期胚の a 透過光像 b Hoechst による核染色像 80 凍結骨髄細胞由来胚盤胞期胚の c 透過光像 d Hoechst による核染色像

7 15 考察骨髄細胞を核ドナー細胞として用いた核移植の結果より耐凍剤を用いずに凍結保存された骨髄細胞を核移植した SCNT 卵子の発生率は新鮮な骨髄細胞を核ドナー細胞とした SCNT 卵子と比較して低かった死亡したマウスを個体のまま凍結しその後回収した精子を顕微授精して産子を得ることに成功している Ogonuki らの報告においても胚の発生及び産子への発生は極めて低率であり耐凍剤を用いずに凍結保存しその後回収した精子には形態学的構造的に損傷があると報告している 1) 今回実施したコメットアッセイ及び FACS 装置を用いたフローサイトメトリーで得た結果から耐凍剤を用いずに凍結保存した骨髄細胞は凍結保存することにより形成された氷晶による障害を受け DNA が損傷していることが示されたウシの死亡個体より回収した精子をウシの成熟卵子に顕微注入し発生した胚を受容ウシに移植した結果正常な産子を得たという報告 6) や耐凍剤を用いずに凍結保存された個体から ntes 細胞を樹立しその ntes 細胞を移植することでクローンマウスの作製が報告 2) されているまた Hoshino らは死んだウシの精巣を耐凍剤を用いずに凍結保存してその精巣から回収した細胞を培養し培養細胞を SCNT に用いてクローンウシの作製を成功させている 3) 今回実施した DNA の断片化の解析においても耐凍剤を用いずに凍結保存された骨から回収した骨髄細胞の多くは DNA に損傷を受けていることが確認されたが核ドナー細胞として用いることにより SCNT 卵子の発生を確認することができたこれらの結果から耐凍剤を用いずに凍結保存された骨から回収した骨髄細胞を用いた SCNT の可能性が示された一般に骨は他の軟組織に比較して動物個体の死後も残りやすくその内部にある骨髄組織は保存が良い傾向にあるさらにそのような細胞を異種間核移植に用いることにより稀少動物の保護に結び付けられる可能性も考えられる参考文献 1. Ogonuki N., Mochida K., Miki H., Inoue K., Fray M., Iwaki T., Moriwaki K., Obata Y., Morozumi K., Yanagimachi R. and Ogura A.:Spermatozoa an Spermatids Retrieved from Frozen Reproductive Organs or Frozen Whole Bodies of Male Mice Can Produce Normal Offspring. PNAS, 103(35), , Wakayama S., Ohta H., Hikichi T., Mizutani E., Iwaki T., Kanagawa O. and Wakayama T.: Production of Healthy Cloned Mice from Bodies Frozen at 20 for 16 years. PNAS, 105(45), , Hoshino Y., Hayashi N., Taniguchi S., Kobayashi N., Sakai K., Otani T., Iritani A. and Saeki K.: Resurrection of a Bull by Cloning from Organs Frozen without Cryoprotectant in a 80 Freezer for a Decade. PLoS ONE, 4(1), 1-6, Block A.L., Bauer K.D., Williams T.J. and Seidenfeld J.:Experimental Parameters and a Biological Standard for Acridine Orange Detection of Drug-induced Alterations in Chromatin Condensation. Cytometry, 8(2), , Wakayama T., Perry A.C.F., Zuccotti M., Johnson K.R. and Yanagimachi R.:Full-term Development of Mice from Enucleated Oocytes Injected with Cumulus Cell Nuclei. Nature, 394, , Goto K., Kinoshita A., Takuma Y. and Ogawa K.:Fertilisation of Bovine Oocytes by the Injection of Immobilized,Killed Spermatozoa. THE Veterinary Record, 127(21), , 1990

8 16 Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University No. 15 (2010) 英文要旨 Studies on Nuclear Transfer Using Cells from Mouse Bone Marrow Tissue Frozen without Cryoprotectant Nakao A. 1,Kato H. 2,Anzai M. 2,Mitani T. 2,Suzuki A. 2, Matsumoto K. 1, 2,Saeki K. 1, 2,Hosoi Y. 1, 2 and Iritani A. 1, 2 Abstract We studied whether cells from animals frozen without cryoprotectant for long period under uncertain environment like animal remains excavated from permafrost could be used as donor cells for somatic cell nuclear transfer(scnt)through SCNT using murine bone marrow cells frozen without cryoprotectant. First, we retrieved bone marrow cells from mouse thigh bones frozen without cryoprotectant and examined their DNA fragmentation. It was confirmed there were nuclei in bone marrow cells regardless of freezing by staining with Hoechst Comet assay and flow cytometry showed much DNA fragmentation in cells frozen without cryoprotectant. Subsequently we used retrieved bone marrow cells as donor cells for SCNT. As a result, reconstructed both oocytes with fresh bone marrow cell and frozen bone marrow cell at 80 developed to blastocyst-stage(16.9%, 1.9%, respectively). These results showed bone marrow cells frozen without cryoprotectant were damaged but still they are able to be used as donor cells for SCNT. 1. Division of Biological Science, Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kinki University, Kinokawa, Wakayama, , Japan 2. Institute of Advanced Technology, Kinki University, Kainan, Wakayama, , Japan

<Original Papers>凍結されたウシ骨髄組織からの効率的な細胞核回収方法の開発

<Original Papers>凍結されたウシ骨髄組織からの効率的な細胞核回収方法の開発 Mem. Institute of Advanced Technology, Kinki University No. 16 : 59 66(2011) 59 凍結されたウシ骨髄組織からの効率的な細胞核回収方法の開発近藤健二 1 加藤博己 2 安齋政幸 2 三谷匡 2 鈴木淳夫 2 1, 松本和也 2 1, 佐伯和弘 2 1, 細井美彦 2 1, 2 入谷明要約本研究ではマンモス骨髄組織からの効率的な細胞核の回収方法を開発するために