Rでゲノム・トランスクリプトーム解析

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1 版 スライド 8 までは自習 当日はスライド 9 から始める予定 スライド 3-86 は当日省略予定 講習会後に各自で復習してください 第 3 部 :NGS 解析 ( 中 ~ 上級 ) ~ トランスクリプトームアセンブリ 発現量推定 ~ 東京大学 大学院農学生命科学研究科アグリバイオインフォマティクス教育研究プログラム門田幸二 ( かどたこうじ ) kadota@iu.a.u-tokyo.ac.jp

2 利用プログラムの簡単な解説 Bowtie (Langmead and Salzberg, Nat Methods, 0) マッピングプログラム 忘れたらココを思い出してね Bridger (Chang et al., Genome Biol., 05) de novo トランスクリプトームアセンブラ DDBJ Pipeline (Nagasaki et al., DNA Res., 03) マッピングや de novo アセンブリを行ってくれるウェブツール ( クラウド解析環境 ) FaQCs (Lo and Chain, BMC Bioinformatics, 04) Quality Control 用プログラム クオリティフィルタリングやアダプター除去が主目的 FastQC Quality Control 用プログラム アダプターの混入など NGS データのクオリティチェックが主目的 QuasR (Gaidatzis et al., Bioinformatics, 05) ( 主に ) マッピングからカウント情報取得まで行ってくれる R パッケージ Rockhopper (Tjaden, B., Genome Biol., 05) バクテリア用 de novo トランスクリプトームアセンブラ TIGAR (Nariai et al., BMC Genomics, 04) トランスクリプトーム発現量推定用プログラム FPKM 値とカウント情報が主な出力 Trinity (Grabherr et al., Nat Biotechnol., 0) de novo トランスクリプトームアセンブラ

3 は に沿って行います 3

4 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 4

5 おさらい paired-end Illumina HiSeq データ (SRR6668) サンプルは Lactobasillus casei A ( 第 3 回 W) ゲノム配列既知 Ensembl Bacteria (release ) 当時はコンティグレベル ( 第 3 回 W; 第 回の図 ) ファイル名 :Lactobacillus_casei_a.GCA_ dna.toplevel.fa.gz (genome.fa) Ensembl Bacteria (release 30) 頃は染色体レベル ( 第 5 回 W3) ファイル名 :Lactobacillus_casei_a.GCA_ dna.toplevel.fa.gz オリジナルのリード数 ( 第 3 回 W3 と W4) sra ファイルのリード数は 35,073,834 FASTQ ファイルのリード数は 34,755,996 bzip 圧縮 FASTQ ファイルで合計約 5GB サブセット ( 最初の 00 万リード ) の取得 ( 第 4 回 W6) gzip 圧縮 FASTQ ファイルで合計約 40MB forward 側 (SRR6668sub_.fastq.gz): リード長は 07 bp reverse 側 (SRR6668sub_.fastq.gz): リード長は 93 bp FaQCs 実行 ( 第 5 回 W; ),000,000 リード 977,0 リード ( 第 5 回 W-3) forward 側 (QC..trimmed.fastq.gz): リード長ばらばら reverse 側 (QC..trimmed.fastq.gz): リード長ばらばら FastQC 上で見られる Illumina adapter は消滅状態 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらい FaQCs と FastQC はゲノム配列既知 or 未知とは無関係なので アダプター配列除去部分は一律にやるところ 07 bp 93 bp 5

6 おさらい de novo トランスクリプトームアセンブリ ( 第 5 回 W5 と W6; 前半 ) バクテリア用のアセンブラRockhopperを実行して変な結果に遭遇した paired-end(qc..trimmed.fastqとqc..trimmed.fastq):0 transcript or contig (W5-) single-end (forward 側のみ ; QC..trimmed.fastq): transcript (W6-) single-end (reverse 側のみ ; QC..trimmed.fastq):43 transcripts (W6-4) ゲノムマッピング ( 第 5 回 W3からW5; 後半から 前半 ) de novo transcriptome assembly をやって うまくいかなかった原因が ゲノムへのマッピングでわかったというストーリー展開に結果的になっている マップされる側 :Lactobacillus_casei_a.GCA_ dna.toplevel.fa.gz マップする側 :paired-end の gzip 圧縮 FASTQ ファイル (SRR6668sub_.fastq.gz と SRR6668sub_.fastq.gz) この結果は重要ではない QC..trimmed.fastq.gz と QC..trimmed.fastq.gz QuasR パッケージでやってみたら偶然原因が判明した ( 第 5 回 W5-5) 乳酸菌に由来しない配列を多く含む領域 (forward 側の 00-07bp 付近 ; f 問題 ) が見つかった 6

7 おさらい 3 トリミング ( 第 5 回 W6; 前半 ) 問題の箇所をトリムしたらうまくいきましたねという話だが ここまでは Linux テクやこういうこともあるという事例紹介が主目的 FaQCs 実行前の forward 側 (SRR6668sub_.fastq.gz) のみに適用 (W6) forward 側 (hoge_.fastq.gz): リード長は bp トリム後のデータで再解析 ( 第 5 回 W7 と W8; 前半 ) Rockhopper でアセンブリ再実行 ( 第 5 回 W7) paired-end (hoge_.fastq.gz と SRR6668sub_.fastq.gz):0 794 transcripts (W7-4) QuasR でマッピング再実行 ( 第 5 回 W8) トリミングの効果で乳酸菌ゲノム配列へのリードのマップ率が % と劇的に改善 FastQC 段階で f 問題に気づくことはできた ( 第 5 回 W9; 前半 ) --nogroup オプションつきで FastQC を実行し Kmer_Content 項目を眺めるのも大事 7

8 おさらい de novo トランスクリプトームアセンブリ ( 第 5 回 W5 と W6; 前半 ) バクテリア用のアセンブラRockhopperを実行して変な結果に遭遇した paired-end(qc..trimmed.fastqとqc..trimmed.fastq):0 transcript or contig (W5-) single-end (forward 側のみ ; QC..trimmed.fastq): transcript (W6-) single-end (reverse 側のみ ; QC..trimmed.fastq):43 transcripts (W6-4) ゲノムマッピング ( 第 5 回 W3からW5; 後半から 前半 ) 3 常識的にはここの論理展開は矛盾している de novo transcriptome assemblyをやるのは 通常リファレンスゲノム配列がない場合 それゆえ Rockhopperの失敗原因を3ゲノムマッピング結果から突き止めるという流 れは通常ない ( 近縁種へのマッピングなどの手段を除く ) マップされる側 :Lactobacillus_casei_a.GCA_ dna.toplevel.fa.gz マップする側 :paired-end の gzip 圧縮 FASTQ ファイル (SRR6668sub_.fastq.gz と SRR6668sub_.fastq.gz) この結果は重要ではない QC..trimmed.fastq.gz と QC..trimmed.fastq.gz QuasR パッケージでやってみたら偶然原因が判明した ( 第 5 回 W5-5) 乳酸菌に由来しない配列を多く含む領域 (forward 側の 00-07bp 付近 ; f 問題 ) が見つかった 8

9 問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ ( 第 5 回 W5 と W6; 前半 ) 近縁種などゲノム配列を利用せずに de novo transcriptome assembly でそこそこのアセンブリ結果を得るための思考回路や手順を解説 バクテリア用のアセンブラ Rockhopper を実行して変な結果に遭遇した paired-end(qc..trimmed.fastq と QC..trimmed.fastq):0 transcript or contig (W5-) single-end (forward 側のみ ; QC..trimmed.fastq): transcript (W6-) single-end (reverse 側のみ ; QC..trimmed.fastq):43 transcripts (W6-4) 9

10 問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ ( 第 5 回 W5 と W6; 前半 ) もちろん実質的には答えが既知の状態ではある つまり forward 側の00-07bp 付近をトリムすれば794 transcripts 程度にはなる ( 第 5 回 W7-4) というのがつの到達目標である 我々は 過去にf 問題を経験した ので の無様 な結果と 3FastQC の結果をじっくり眺めて解析戦略を練る バクテリア用のアセンブラ Rockhopper を実行して変な結果に遭遇した paired-end(qc..trimmed.fastq と QC..trimmed.fastq):0 transcript or contig (W5-) single-end (forward 側のみ ; QC..trimmed.fastq): transcript (W6-) single-end (reverse 側のみ ; QC..trimmed.fastq):43 transcripts (W6-4) FastQC 段階で f 問題に気づくことはできた ( 第 5 回 W9; 前半 ) --nogroup オプションつきで FastQC を実行し Kmer_Content 項目を眺めるのも大事 3 0

11 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算

12 事前準備 このあたりです

13 事前準備 詳細は省くが ディレクトリを作成し FaQCs 実行結果ファイルをコピーし 3 ファイル名を短く変更しているだけ 次の 3 枚のスライドで実際の作業を示す 何らかの理由で がうまくいかない場合やファイルがない場合は ~/Desktop/backup のもので代用してください 3 3

14 事前準備 詳細は省くが ディレクトリを作成し 4

15 事前準備 詳細は省くが ディレクトリを作成し FaQCs 実行結果ファイルをコピーし 5

16 事前準備 詳細は省くが ディレクトリを作成し FaQCs 実行結果ファイルをコピーし 3 ファイル名を短く変更しているだけ 3 6

17 ちなみに コード部分を全選択 (Internet Explorer の場合は CTRL + ALT + 左クリック ; またはトリプルクリック ) して Bio-Linux のターミナル画面上でペーストしても構いません スライドを見るだけ 7

18 ちなみに 赤下線部分で示されているように # から始まる行の部分で そんなコマンドはない と怒られるだけで 最後の状態は同じです 8

19 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 9

20 FastQC (Bio-Linux のコピペ実行結果のターミナル画面だと見づらいので ) 左上のコピペ用コード部分で説明 -q は 途中経過を表示させないオプション 画面が流れて全体像がわかりづらくなるのでつけているだけ 通常利用時はつけない --nogroup オプションをつけることで Kmer Contents 項目の結果を正確に評価する ( のが目的 ) 3FastQC 実行結果は 共有フォルダに保存するよう指定している 3 0

21 FastQC 赤枠部分のコピペ実行結果はこんな感じ 赤下線部分の html ファイルが FastQC 実行結果 forward 側 reverse 側

22 FastQC 実行結果 f 共有フォルダ上にある forward 側 (data.fq.gz) の FastQC 実行結果を眺める リード数は 977,0 個 3 リード長は bp の範囲 4 目的は Kmer Content 項目 赤枠の部分が赤色なので 立ち止まって眺めるべきところ ( 第 6 回 W4-) 3 4

23 FastQC 実行結果 f Kmer Content 項目の全体像 99-0 塩基目あたりにピークが集中しているので 3Overrepresented sequences 項目では既知のアダプター配列は見えなくなっているものの のあたりに -adapter オプションつきの FaQCs( 第 5 回 W-) でも取りきれていないプライマー配列などが存在するかもしれない と判断する 3 3

24 FastQC 実行結果 r reverse 側 (data.fq.gz) の FastQC 実行結果を眺める リード数は 977,0 個 3 リード長は bp の範囲 4 目的は Kmer Content 項目 赤枠の部分が赤色なので 立ち止まって眺めるべきところ ( 第 6 回 W4-) 3 4 4

25 FastQC 実行結果 r Kmer Content 項目の全体像 のあたりにピークがあるものの リードの両端にはないようなので reverse 側はたぶん大丈夫だろう ( 解析サンプルに由来しない配列はなさそう ) と判断する 5

26 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 6

27 Rockhopper おさらい paired-end (data.fq.gz と data.fq.gz) で Rockhopper を実行し 以前と同じ結果 ( 第 5 回 W5-) になるかを確認しておく 赤枠内をコピペ paired-end (data.fq.gz と data.fq.gz) としてメモリを GB (000MB) にして実行するところ 欠席者はクラスパスの設定ができていないのでエラーが出ると思われます のスライド 60 あたり ( 第 5 回 W7) を参考にして ~/.zshrc ファイルをいじってください 7

28 Rockhopper おさらい paired-end (data.fq.gz と data.fq.gz) としてメモリを GB にして実行 赤枠がターミナル上に出力されている途中経過 3 のあたりの数値は 第 5 回 W5- と同じなので安心 3 8

29 Rockhopper おさらい 無事計算終了 結果はRockhopper_Results ディレクトリに格納される ( 第 5 回 W5-) 9

30 Rockhopper おさらい 3transcripts.txt がアセンブリ結果 4 summary.txt が赤枠とほぼ同じ内容でした

31 Rockhopper おさらい summary.txtの 行頭と 行末の8 行分を表示 Rockhopper 実行時のターミナル画面上の出力と完全に同じではないかと思い 次のスライドで確認 3

32 Tips:diff Rockhopper 実行時にターミナル画面上に出力されるものを result.txt に保存 diff コマンドは つのファイルの差分を出力する 比較している つのファイルが全く同じ場合には何も起こらない 3

33 Tips:diff Rockhopper 実行時にターミナル画面上に出力されるものを result.txt に保存するところまで 計算は一瞬で終わるが result.txt は確かにできている 33

34 Tips:diff diff 実行結果は何も起こらなかった つまり result.txt と summary.txt の中身は全く同じ 34

35 Tips:diff 3Rockhopper の実行がほぼ一瞬で終わった理由は おそらく最初に intermediary 中のファイルなど以前の実行ログを見に行って 全く同じファイル名やパラメータのものがあれば それを返すようにしているのであろうと解釈する なぜ intermediary と判断したか? それはログファイルが Rockhopper_Results 直下に見当たらないこと intermediary という名前が中間ファイル貯蔵庫っぽい響きだったから 真偽は不明 3 35

36 確認 以前の結果の影響をなくすため 一旦削除してから再実行 rm 実行時の r オプションはディレクトリ削除時に利用 ( 第 3 回 W8-4; 第 4 回 W7-7 や W9-3) 36

37 確認 赤枠以降のコードもコピペ ( 以前の実行結果が全てなくなっているので当たり前といえば当たり前だが ) アセンブリ実行にそれなりに時間がかかった diff の結果は不変 37

38 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 38

39 情報抽出 (grep) ( このあたりはヒトによって大分流儀が異なるが ) つのアセンブリ結果から 行分のみで 全体像を把握したい場合には grep が便利 ( 第 3 回 W6-; W8-; W9; 第 4 回 W9-9) grep は 指定した文字列を含む行を出力するコマンド ここでは number of assembled transcripts という文字列を含む行を表示させている 赤枠が実行結果 39

40 情報抽出 (grep) single-end で forward 側 (data.fq.gz) のみ reverse 側 (data.fq.gz) のみの Rockhopper を実行し 配列数 ( 転写物数 ) を表示 40

41 情報抽出 (grep) コピペ実行結果 4

42 情報抽出 (grep) 赤枠の grep 実行結果に注目! 入力ファイルは result*.txt としているので 該当する 3 つのファイルの結果が返されている 3 配列数は forward 側のみが 個 ( 第 5 回 W6-) reverse 側のみが 43 個 ( 第 5 回 W6-4) paired-end が 0 個 ( 第 5 回 W5-) という結果 いずれも以前の結果と全く同じで安心 3 4

43 目的 :de novo transcriptome assembly でそれなりのアセンブリ結果を得る 前提条件 : ゲノム配列は未知 手段 : 末端塩基をトリムしてはアセンブリ を繰り返し行う 評価基準 : 配列数 これまでのまとめ de novo トランスクリプトームアセンブリ バクテリア用のアセンブラ Rockhopper を実行して変な結果に遭遇した paired-end(data.fq.gz と data.fq.gz):0 transcript single-end (forward 側のみ ; data.fq.gz): transcript single-end (reverse 側のみ ; data.fq.gz):43 transcripts FastQC forward 側 (data.fq.gz) は 99-0 塩基目あたりに k-mer のピークが集中していた reverse 側 (data.fq.gz) は リードの両端付近には k-mer のピークはなかった 43

44 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 44

45 当面の目標 de novo トランスクリプトームアセンブリ 以前の経験からpaired-endでうまくいかなった主な原因はforward 側にあると判断 3FastQC 実行結果から おそらく問題は5 末端ではなく3 末端のほうにあるだろうという思考回路のもとで とりあえず forward 側のみでトリミングからアセンブリまでの具体的な戦略を練る バクテリア用のアセンブラ Rockhopper を実行して変な結果に遭遇した paired-end(data.fq.gzとdata.fq.gz):0 transcript single-end (forward 側のみ ; data.fq.gz): transcript single-end (reverse 側のみ ; data.fq.gz):43 transcripts FastQC forward 側 (data.fq.gz) は 99-0 塩基目あたりに k-mer のピークが集中していた reverse 側 (data.fq.gz) は リードの両端付近には k-mer のピークがなかった 3 forward 側 07 bp 93 bp reverse 側 45

46 トリミング トリミングは fastx_trimer を利用する とりあえず第 5 回 W6- と同じようなコードで動作確認をしておさらい が fastx-trimmer 実行部分 赤枠部分をコピペ 46

47 トリミング コピペ実行結果 が fastx-trimmer 実行部分 47

48 トリミング トリミング 実行前と 実行後の最初の 4 行分 ( つまり リード分の情報 ) を比較 0 塩基ごとに赤の縦棒を入れている 確かに 99 塩基目まで残すという (-l 99) オプション通りの結果になっていることがわかる 48

49 トリミング ちなみに の部分はただの文字列なので トリミング前後で不変 ( 第 5 回 W6-4) 49

50 fastx-trimmer トリミングの主なターゲットは リードの 3 末端なので l( エル ) オプションは必須 しかし リードの 5 末端もトリムして様々な組み合わせを試したいので 50

51 fastx-trimmer fastx-trimmer h でオプションの利用法を眺める -f が 5 末端側のトリムに相当すると判断 5

52 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 5

53 fastx-trimmer f -l -f 3 は 3 塩基目から残すという意味であり 最初の 塩基分をトリムすることに相当する この場合 の -l 99 の指定が -f に影響されるのかどうかが気になる ( 結論としては独立 ) 53

54 fastx-trimmer f -l コピペ実行結果 -f 3 で最初の 塩基分をトリムすることと の -l 99 は無関係 オリジナルのリードのポジションで残す範囲の指定と考えればよい 54

55 fastx-trimmer l のみ の -l 99 のみの結果 ( 比較用 ) 55

56 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 56

57 様々なトリム条件 種類のトリム条件で作成した trim.fq.gz を入力として Rockhopper を実行し 配列数を得る基本形 forward 側の 3 末端をトリムしない場合と 04 bp 以上のリードを 04 bp になるまで 3 末端をトリムする場合 赤枠を丸々コピペすると 3 の quote が原因で変なことになる のを経験してもよい quote> となっても CTRL + C で脱出可 3 57

58 様々なトリム条件 コピペ実行結果 04 bp 以上のリードを 04 bp になるまで 3 末端をトリムすることで 3 配列数が 個に増えたことがわかる 3 58

59 様々なトリム条件 トリム後に残す範囲を計 8 通り分作成して コピペ実行 約 8 分 例えば は オリジナルのリードポジションで 3-04 番目の塩基以外をトリムするオプション 59

60 様々なトリム条件 計算終了後の状態 計算中は 配列数に相当する数値を ( それほど気合いは入れずに ) 眺めて結果の全体像や 条件あたりの所要時間を大まかに把握しておく また エラーメッセージが出ていないかも見る 60

61 結果の全体像を把握 ls でファイル名をざっくり眺めて 様々な条件でトリムした結果ファイル群のみをうまく表現できる ワイルドカード (3 ここでは *) を考える もちろんファイル名を眺めるだけでどのような条件でトリムしたかが一目でわかるように意味を持たせるのも重要であり 作る段階で考えておくのが普通 3 6

62 結果の全体像を把握 結果の解釈 がトリム条件で がアセンブリで得られた配列数 ( コンティグ数 ; 転写物数 ) 6

63 結果の全体像を把握 今解析しているのは forward 側リード と 3 で指定した範囲外のトリムを 計 0 条件 ( 動作確認用の 条件と一気にやった 8 条件 ) で行ったときに どれだけアセンブリがうまくいったかを調べようとしている 数が多ければ多いほどいいというものでもないが 全くアセンブルされないのはおかしいという考えのほうがこの場合は優先 forward 側 07 bp 3 93 bp reverse 側 3 63

64 結果の全体像を把握 と が似た傾向であることから リードの 35 側のトリミングがアセンブリ結果に与える寄与度は 43 側に比べて低いと判断 forward 側 07 bp bp reverse 側 64

65 結果の全体像を把握 5 側の 塩基目を残す ( 全くトリムしない ) ほうが 3 塩基目から始める ( 最初の 塩基をトリムする ) よりも配列数が増える という判断をとあたりを眺めて下す これは395と98 塩基まで残す 条件であるが コンティグ数の大小関係が(77 > 73) と(704 < 705) で逆転しているので 一応 99 塩基目まで残す条件あたりもやったほうがいいかも などと考える 3 65

66 様々なトリム条件 3 97 と 99 塩基まで残す条件の追加 および 塩基目から始める ( 最初の 塩基をトリムする ) 条件も行う これはコピペせずにスライドを眺めるだけ 約 6 分 66

67 様々なトリム条件 3 コピペ実行後に ls した結果 -lt オプションをつけたおかげで作成時間順にソートされる こうすることで さきほどコピペ実行したものと そうでないものを分けることができる ここでも 3 作成時間や 4 ファイルサイズを一応眺めてチェック 赤枠分が見えないだけだとわかっていれば をやってもよい

68 結果の全体像を把握 3 で表示させるものを result_0* に限定して ls grep 時に さらに の赤下線で 塩基まで残す結果に限定 赤下線一番左の 39 は 90.txt から 99.txt というファイル名のものに限定するという意味 [0-9] は 9.txt でも 97.txt でも 0-9 の範囲内の数値 つであればなんでもよいという意味 ( 第 6 回 W-0; W3-4) 68

69 結果の全体像を把握 3 で表示させるものを result_0* に限定して ls grep 時に さらに の赤下線で 塩基まで残す結果に限定 赤下線一番左の 39 は 90.txt から 99.txt というファイル名のものに限定するという意味 [0-9] は 9.txt でも 97.txt でも 0-9 の範囲内の数値 つであればなんでもよいという意味 ( 第 6 回 W-0; W3-4) 実行結果と見比べるとわかりやすいでしょう 3 69

70 結果の全体像を把握 塩基目以降を残す ( 塩基目をトリム ) 場合は 塩基目と 3 塩基目以降の結果の中間であることを確認できた また リードの 3 末端側のみ 99 塩基目まで残した場合に 最も配列数が多くなる (73 個 ) ことも分かった 70

71 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 7

72 他の結果もチェック おさらい Total number of assembled transcripts を含む行の結果では リードの 3 末端側のみ 99 塩基目まで残した場合に 最も配列数が多かった (73 個 ) 赤枠は 5 末端のトリム位置の違いで区別しやすくしたいだけ 7

73 他の結果もチェック Perfectly aligned reads を含む行の結果は マップされたリード数とその割合に関するもの リードの 5 末端側を 塩基目から残す場合 (64%) は 3 それ以外の 塩基目 (70%) および 3 塩基目 (7%) から残す場合に比べて極端に減ることがわかった 配列数も重要だが この数は発現解析時に効いてくるので無視できない 3 73

74 他の結果もチェック Total number of assembled bases を含む行の結果は 総塩基数に関するもの ( ゲノムの場合はゲノムサイズに相当 ) 最も総塩基数が多かったのは -99 塩基目を残した場合 総合的に見て が一番いいだろうと思いつつ 一応これまでの結果をファイルに保存してホスト OS 上で整形してまとめる 74

75 ファイル保存して整形 詳細は省くが これまで行った 3 種類の文字列を含む行情報を hoge_*.txt という名前で共有フォルダに保存 75

76 ファイル保存して整形 まとめた結果 -99 塩基目の部分を残すのがいいかなと私は判断 実はこれって 第 5 回 W8-7 ( のスライド 85) で妄想した記憶が残っているのも多少はあるが ゲノム配列を使わずとも同様な結論を論理的に導き出せる例として重要 実際の作業としては のメインターゲットのデータ解析進行速度を妨げない程度に や 3 などの他のいくつかの候補も含めて同時並行でその後の解析を行う 3 76

77 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 77

78 ベストな条件で forward 側の99 塩基目まで残すのは固定で 塩基目 塩基目 33 塩基目から残すという計 3つの条件でpaired- endアセンブリを実行 ここで reverse 側は何も行わない data.fq.gzを入力として与えている コピペ実行 約 6 分 3 78

79 ベストな条件で コピペ実行後の状態 赤枠部分が結果の全体像を眺めているところ 3 79

80 ベストな条件で マップされたリード数や 総塩基数は pairedend でも確かに 0_f_099 がイメージ通りの相対的な関係だった しかし 3 配列数が 0_f_099 よりも 0% ほど少ない (739 個 vs. 66 個 ) のは 無視できない違いな気がする 悩ましいが一応まとめる

81 これまでのまとめ 赤枠部分がさきほど行った paired-end のアセンブリ結果 8

82 これまでのまとめ reverse 側を加えてpaired-endにすることで 総塩基数がforward 側のみのsingle-endに比べて劇的に増加していることがわかる 配列数は 3paired-endは4single-endに比べて若干全体的に減っていることから 総塩基数との関係を踏まえ 配列あたりの平均長が3 倍程度伸びていると解釈できる paired-endにする利点がよくわかる結果といえる 4 3 8

83 これまでのまとめ どれがいいかはこの段階でも悩ましいですが やはりマップされたリード数や総塩基数の観点から ですかねえ 83

84 アセンブリ評価系 スライドを見るだけ 様々なプログラムが他にもあります の IFRAT は 得られた配列の確からしさを評価するプログラム群を提供していたような 84

85 この後の展開は 乳酸菌データについては バクテリア専用の Rockhopper がいいに決まっているだろうが 念のため 有名な Trinity をインストールしてやってみたら バクテリア用でもないのに配列数が相当増加したという衝撃の結果をお話 次に第 5 回でも紹介した 3Bridger を使おうと思ったがサンプルデータ実行段階でこけたという話 3 85

86 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 86

87 Trinity ここからダウンロードできるようなのでクリック スライドを見るだけ Grabherr et al., Nat Biotechnol., 9: , 0 87

88 Trinity ページ下部に移動すると Trinity の昔のバージョンもダウンロード可能なようだが 最新版のダウンロードが基本なので とりあえず 3tar.gz のやつをダウンロードすべく windows の場合は右クリックで ショートカットのコピー した後からが次のスライド 約 70MB もあるので ~/Downloads にダウンロード済み 3 88

89 ( ダウンロードと ) 解凍 wget のところはコメントアウト (#) しています 次のスライドは のコピペとほぼ同じ 89

90 解凍 場所は ~/Downloads Trinity ver...0 の tar.gz ファイルが存在する状態からスタート 3 解凍コマンドを実行 リターンキーを押す 3 90

91 解凍後 解凍終了後の状態 赤下線部分の trinityrnaseq-..0 というディレクトリが作成されていると解釈する エラーは出てないっぽい 9

92 解凍後 trinityrnaseq-..0 ディレクトリに移動して ls タブ補完を有効利用 9

93 README README ファイルがあったので more で表示 赤下線の Makefile を見つけたので 基本は make なのだろう と思いつつ README の記述に従い 3 の Trinity ウェブサイト再訪 3 93

94 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 94

95 Install よく見ると に Installing Trinity と書いてあるので とりあえずクリック 95

96 Install make だけでよさそう は prerequisite (gcc ver. 4.3 以上 Java-.7 以上 ) に関する記載 make で失敗したら prerequisite の可能性も考えるというスタンスもありかも 96

97 Install make 実行 約 4 分 97

98 Install 無事終了 Properly というポジティブな副詞なのでインストール成功と解釈する 98

99 Install 後の確認 ls lt でソートして表示 この 3 つが更新または新規作成されたようだ 他は何も変わっていないのが気になるが 99

100 Install さきほどの make で行ったことは 赤枠内の 3Inchworm と Chrysalis を作成するためのものだと解釈すれば納得できる 3 00

101 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 0

102 実行法を調べる Trinity の実行方法を調べるべく Running Trinity をクリック 0

103 実行法を調べる 下にスクロールしていって オプションやら基本的な利用法をざっと眺める 03

104 実行法を調べる 私がスクロールをやめて眺めるのは 利用例のところ メモリと CPU 数に気を付ければよい 3Trinity というコマンドが実行プログラムだと判断 3 04

105 Install 後の確認 Trinity が確かにあった ( 緑色だからそれで判断してもよいが ) 実行権限 (x; エックス ) が自分にあることを一応確認 ウェブページ中の他の記述内容も合わせることで Trinity の実体が 3Inchworm( シャクトリムシ ), Chrysalis( サナギ ), Butterfly( チョウ ) なのだろうと想像する Grabherr et al., Nat Biotechnol., 9: , 0 05

106 パスを通す Trinity プログラムのパスを通す 次のスライドは のコピペとほぼ同じ 06

107 パスを通す ~/bin へのパスは第 6 回 W-3 ( のスライド 56) で通したので ここにファイルを置くだけでよい のパスを通す作業の 前と 3 後で where Trinity 実行結果の違いがわかる のやり方は間違いです コピーではなくシンボリックリンクを貼れば スライド までのエラーを回避できます (0608 修正 ) 3 07

108 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 08

109 色々試しながら実行 赤枠部分をコピペ paired-end ファイルがあるディレクトリに移動して Trinity の基本形を実行しようとしている 3 赤字のコメント行部分でエラーが出るが気にしない 3 09

110 色々試しながら実行 ディレクトリ変更して Trinity を実行すると すぐにエラーメッセージが出て終了する 赤下線部分のネガティブな単語を見て 失敗しているのだと気づく 0

111 色々試しながら実行 COMMON.pm というのが原因らしい.pm は perl module 関連ファイル ふとこのようなメッセージを克服した過去の記憶が蘇る ( 第 4 回 W5-6)

112 色々試しながら実行 当時は実行ファイル ( この場合は Trinity) の相対パス指定 ( 第 4 回 W5-7) で問題が解決した 赤下線で示すように当時の成功体験を頼りにそれを踏襲して再度トライ

113 色々試しながら実行 さっきと違う! うまくいったようだ 3

114 色々試しながら実行 約 分後の状態 Phase というところになったようだ 順調 4

115 色々試しながら実行 さらに約 30 秒後の状態 Jellyfish というプログラムが動いているようだ この状態のままでフリーズ ( 何も変化がなくなる ) しているので ここまで見届けたら CTRL + C で強制終了し この状態から脱出する ちなみに仮想環境のメモリを 4GB にしていると動きます 5

116 色々試しながら実行 CTRL + C で脱出した後の状態 の 番左側の ^C が CTRL + C に相当する部分 重い計算をしているためか 反応が鈍い 気長に待つべし 6

117 強制終了時の注意 のような感じで Trinity 実行時に作成されたものを削除しておくべし! 理由 : それらが残っているがために その後うまくいくコマンドを打っても失敗する場合がある ( 私はこれで何度かハマった経験があります ) 7

118 削除 私はこんな感じで削除しましたが 最終的に目的を達成できればなんでもいいです 8

119 色々試しながら実行 全く非論理的な展開だが のコメント部分に書いてあることが全て まるで説明のつかない意味不明なことも起こりうるという例です をコピペ実行 約 85 分 9

120 途中経過 コピペ実行から約 分後の状態 こういうエラーメッセージが出ることもあるようですが 気にしなくていいです 0

121 途中経過 コピペ実行から約 分後の状態 前回はいつまで経っても出なかった赤枠部分が出て驚くが これまでと違う hopeful な状況に対して素直に喜ぶ

122 途中経過 3 確かコピペ実行から約 3 分後の状態 Inchworm という見たことのある単語のフェーズに入ったようだ 順調

123 途中経過 4 (8: 頃スタートなので ) 確かコピペ実行から約 5 分後の状態 のところが 00% になるまで延々と続く 9:7 頃に が 30% に達したので そこまでが 時間強 そこから先は比較的サクサクパーセンテージが上がっていく 3Number of Commands の数値 (307) はヒトによって異なるらしい 3 3

124 終了時の状態 (8: 頃スタートで )9:47 に終了したので このときは約 85 分 Trinity のアセンブリ結果ファイルは trinity_out_dir ディレクトリ内にある Trinity.fasta 4

125 確認 確認 確かに trinity_out_dir が存在する 5

126 確認 赤枠内のコードを一気にコピペした結果 得られた配列数 ( 転写物数 ;,603 個 ) の多さに衝撃を受ける 総塩基数は,74,60 45,9 =,678,39 bp と一般的な乳酸菌を含むバクテリアのゲノムサイズに近い値 これは転写物の総塩基数なので多過ぎ というのが率直な感想 しかしこの中から 様々なフィルタリングによって落とされていくので 初期値としてはこれくらいでもいいのかもしれない アセンブリ結果もヒトによって異なるようだ 例えば,300 個とか 6

127 確認 4 ちなみに ls 実行結果の赤枠内には 実行ログファイルはなさそう.timing というファイルを見つけ この中に計算時間情報が含まれているのだろう と思い 実際にそうであることを確認したりする ( おそらくこれが事実上のログファイル ) 3 Rockhopper と同じく 常に Trinity.fasta という同じファイル名になるので 次のアセンブリ結果で上書きされないように つ上のディレクトリ上に Trinity.fasta でコピー 4 が同じものです ( アセンブリ失敗したヒト用 ;~/Desktop/backup にもあり ) 3 7

128 色々試しながら実行 3 参考 今回取り扱っている SRR6668 を含む最近の RNA-seq は strand 情報もわかるような実験プロトコルで行われるようです このようなデータの場合は 3--SS_lib_type FR オプションを Trinity 実行時に追加するようです ここはコピペ実行しないで! 3 Borodina et al., Methods Enzymol., 500: 79-98, 0 8

129 色々試しながら実行 3 参考 ここも眺めるだけ 結論としては 色々試すのは重要ですね ということ 先に をコピペ実行し 分ほどで計算終了しておかしいと思う そして 直前のアセンブリ結果と同じ数値情報が得られたら 先に 3 をやらないといけないのだと学習します 3 9

130 色々試しながら実行 3 参考 コピペ実行結果 配列数は 3,090 総塩基数は,85,449 47,86 =,777,63 bp ここもおそらくヒトによって異なるだろう 30

131 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 3

132 apt-get でインストール 参考 apt-get でインストールする前の状態をおさらい ver...0 がインストールされている スライド 0 で出たような ERROR メッセージが出ることもあるが気にしない スライドを見るだけ 3

133 apt-get でインストール trinityというキーワードを含むソフトウェア名参考をリストアップ 正式名称がtrinityrnaseqであることを確認し 3apt-getでインストールを実行 4rootのパスワードはpass409 見るだけ

134 apt-get でインストール 参考 何か聞かれているが 基本的に思考停止して y でよい 34

135 apt-get でインストール ( 東大有線 LAN 環境だからかどうかは不明だ参考が ) 数分でインストール完了 E: Failed to fetch http: とか E: Unable to fetch some などと出ることもある この場合はホスト OSがOKでも ゲストOSがネットワークにつながっていないこともあるのでそれが理由 こういうときは 大抵ゲストOSのFirefoxもつながらないので納得できる 対策 : 時間を空けるとか 一旦ゲストOSの再起動を行うとか 35

136 apt-get でインストール 参考 パスが通っているかを確認 /usr/bin/trinity が追加されたようだ 36

137 apt-get でインストール 参考 依然として Trinity のみではバージョン情報は表示されないが のフルパスを利用すればいいと学習 37

138 apt-get でインストール 参考 apt-get 経由でインストールした Trinity は ver..0.6 である 最新版 (ver...0) がインストールされない現象は sra-toolkit のときと同じ ( 第 7 回 W4-3; スライド 53) 一般論としては 最新版だとうまく動かないこともある ( 追加 ) 38

139 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 39

140 この後の展開は 乳酸菌データについては バクテリア専用のRockhopper がいいに決まっているだろうが 念のため 有名なTrinityをインストールしてやってみたら バクテリア用でもないのに配列数が相当増加したという衝撃の結果をお話 次に第 5 回でも紹介した3Bridgerを使おうと思ったがサンプルデータ実行段階でこけたという話が当日だったが Bridgerが必要とする boostパッケージ ( が古いバージョンになったおかげで ) をapt- get 経由でインストールしたらうまくいくという情報が受講生から寄せられました よって Bridgerの後継である4BinPacker もこのやり方でうまくいくはずです ( 追加 )

141 Bridger スライドを見るだけ Bridger のサイトに行き 最新版 (r04--0) をダウンロード Windows の場合は右クリックで ショートカットのコピー Mac の場合は リンクをコピー で URL 情報を取得 Chang et al., Genome Biol., 6: 30, 05 4

142 Bridger お約束の手順で解凍 4

143 Bridger ディレクトリ変更し ls Makefile があるので make でインストールするのが基本なのだろうと妄想 3INSTALL というファイルがあるので 4more で確認

144 more INSTALL のあたりを眺めて インストールの基本は./configure: make; make install という 3 つの呪文を唱えればいいと学習 詳細については README だと書かれているので README を見にいく q で抜ける 44

145 less README less README 45

146 less README Bridger の less README 中 Installation のあたりまでどうにか辿り着く Boost というものをインストールしないといけないらしいので まずはこれに集中しよう 46

147 Boost linux boost で検索した結果 の日本語の記述内容から概要をつかみ 3 が本家サイトなのだろうと予想し 3 をクリック 3 47

148 Boost よくわからないがとりあえず Download 48

149 Boost 最新版は ver..6.0 Download 49

150 Boost 講習会では ~/Downloads にダウンロード済み 約 85MB 50

151 Boost ダウンロードから解凍までの一連の手順 は tar.bz 解凍のお約束の呪文 コピペ 5

152 Boost tar.bz 解凍後の状態 5

153 less README Bridger の less README 今はこのあたりに対応 次は./bootstrap.sh と打てばいいようだ スライドを眺めるだけ 53

154 ./bootstrap.sh 確かに bootstrap.sh は存在する 言われるがままにコマンドを実行 約 0 秒 54

155 ./bootstrap.sh 実行後./bootstrap.sh 終了後の状態 赤枠内 特に に着目 Bridger の less README の./b と同じなので安心する 55

156 続 :less README Bridger の less README の./b 部分を眺める の赤下線部分を自分で指定しないといけないらしい 例えば 3 のように指定するらしい 3 56

157 自分に置き換える czheng は ユーザ名 iu に対応する 3 の boost ディレクトリが 4 に対応するのかはよくわからないので もうちょっとマニュアルを見る

158 自分に置き換える find?! どっちにしろ の./b install が成功したら include と lib というサブディレクトリができるよ と書いているので 3 の boost ディレクトリ内に include と lib ディレクトリがなければ ここを指定してもいいだろうと判断した 3 58

159 自分に置き換える boost ディレクトリに移動したので 今はココ 3 include と lib というファイルもディレクトリもないことを確認したので のフルパスを 4 のところに書くことに決めた

160 ./b install つ上の階層に移動しているのは./b install を 3 の場所で行うから を実行 約 5 分 3 60

161 ./b install 実行後 ( 時間はかかるが ) 特にエラーメッセージが出ることもなく終了 6

162 include と lib の確認 boost ディレクトリ中に 確かに include と lib ができている 6

163 続 :less README Bridgerの less README で次の項目に移行 LD_LIBRARY_PATHという環境変数 (environment variable) をセットする 手段はつ つは環境設定ファイル (~/.bash_profile or ~/.profile) に書き込むやり方 3そしてもうつは そのターミナル上でのみ有効な指定方法 3 63

164 続 :less README ここでは を採用する Bio-Linux のデフォルトは zsh なので.zshrc に書き込むやり方を示す ( 第 4 回 W0-3; 第 5 回 W7-) に対応するのは /home/iu/downloads/boost 6_0/boost 64

165 LD_LIBRARY_PATH 第 5 回 W7- のやり方を踏襲して echo で必要な情報を ~/.zshrc に書き込む 書き込み前と 3 書き込み後の最後の 5 行分を表示して確認 3 65

166 LD_LIBRARY_PATH source して有効にしている 66

167 続 :less README Bridger の less README で次の項目 (. Building Bridger) に移行 の部分をみればわかるが less README を開いているターミナルと インストールを実行しているターミナルの つを切り替えながらやっています 67

168 続 :less README の部分は もうやってるんですけど とは突っ込まない 若干古いバージョンになっているが このあたりはイチイチ突っ込まないのもお約束 3 の Configure Bridger に移行 3 68

169 configure Bridger のディレクトリに移動して ls で configure があることを確認し 3--with-boost オプションつきで実行 約 分 3 69

170 configure 実行後 無事終了 70

171 続 :less README Bridger の less README で次の項目 ( make) に移行 赤枠部分は --prefix オプションをつけずに boost を実行してうまくいった場合の話らしい 今回は --prefix オプションをつけたので 無関係と判断 7

172 make make 約 分 7

173 make 実行後 無事終了 73

174 続 :less README Bridger の less README で次の項目 ( インストール確認 ;test) に移行 基本はこれを打って確認するだけのようだ 74

175 ./Assemble -h を実行 75

176 ./Assemble -h 実行後 画面が一気に流れるが 確かに README ファイル中に で書かれている通り 赤枠のような Usage( 利用法 ) が表示される 76

177 続 :less README Bridger の less README で次の項目 (small data で Bridger 実行 ) に移行 で確認するようだ 77

178 run_me.sh Bridger ディレクトリに戻り ls 3 確かに sample_test ディレクトリが存在する

179 run_me.sh sample_test ディレクトリに移動し ls 3 確かに run_me.sh ファイルが存在する 4 中身を確認 5 行目の #!/bin/bash ve がシェルスクリプトであることを明示する役割を果たしている ( 第 4 回 W-3)

180 ./run_me.sh コマンドの実体はこれだけ Trinity とオプション名も同じでわかりやすい その都度打ち込めばいいじゃないかと思うかもしれないが このようにしてファイルに残しておくのが一般的./run_Me.sh を実行 80

181 Error で終了 Error が出たようです 8

182 原因の特定を試みる ls lt で直近に作成されたものを確認 bridger_out_dir というディレクトリができているようなので 8

183 原因の特定を試みる ls lt で直近に作成されたものを確認 bridger_out_dir というディレクトリができているようなので 3 中身を確認 4Assemble.log というログファイルが確かにある

184 原因の特定を試みる 5bridger_out_dir ディレクトリにある Assemble.log の中身を確認 赤枠がエラーメッセージで RawGraphs というディレクトリを作成できない らしい

185 原因の特定を試みる ここにある できているのにできていないとエラーを吐いて終了しないでください 85

186 Bridger のまとめ インストール自体は成功しても サンプルデータの実行でコケルことはときどきあります 尚 Bridger の後継プログラムである BinPacker も よくわからないエラーに遭遇して実行できませんでした 頑張ってエラーの解決を試みるヒト 諦めて別のプログラムの利用に切り替えるヒト 好きな道へどうぞ 86

187 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 87

188 発現量推定 トランスクリプトーム配列と RNA-seq データを入力として 発現量を得る流れを最後に行います 大抵の場合 カウント情報も出力に含まれるので カウントデータ取得目的としても利用可能 スライドを見るだけ 88

189 TIGAR TIGAR のインストールから利用の流れを説明します うまくいかなかった場合でも日本語でやりとりできるのが何よりです スライドを見るだけ Nariai et al., BMC Genomics, 5: S5, 04 89

190 TIGAR TIGAR の github サイトにアクセス 90

191 TIGAR right panel 上にある Download Zip というのをクリックして jar ファイルをダウンロードせよ と書いてある のことかと思いつつ クリックすると 9

192 TIGAR right panel 上にある Download Zip というのをクリックして jar ファイルをダウンロードせよ と書いてある のことかと思いつつ クリックすると 3 確かに Download Zip を発見したので右クリックでここの URL 情報を取得 ( スライドを見るだけ 3 9

193 解凍 講習会では ~/Downloads にダウンロード済みなので unzip で解凍 tigar-master というディレクトリが作成されて 33 つのファイルができたと解釈 4 これが最新版だろう

194 Github と照合 って と同じだなと判断 94

195 Github と照合 README.md の中身って 赤枠内の記述内容と同じではないか?! ココにも README.md と書いてあるし 95

196 Github と照合 3head で最初の数行を表示して確認 赤枠部分を比較して予想通りと確信 こんな感じで 独特な見栄えで最初はわかりづらい ( 個人の感想です )github のノリに慣れていく 3 96

197 README.md Github サイト上の README.md を眺めながら 基本的な利用法 (Usage) を学んでいく Usage の赤下線部に java jar Tigar_.jar と書いている これは Tigar_.jar のクラスパス ( 第 5 回 W4-4; W7-) を設定した後の話ではないかと昔の記憶をたどる 97

198 動作確認 ここでは java jar Tigar_.jar の相対パス指定 で動作確認 うまく動いているようだ 98

199 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 99

200 推奨パイプライン TIGAR の推奨パイプラインに従って行う Step は トランスクリプトーム配列の準備 ここでは Trinity 実行結果ファイル (Trinity.fasta) を用いる 00

201 Step 実際の作業はこちら 赤枠内をコピペ 発現量推定を行いたいトランスクリプトーム配列ファイル (Trinity.fasta) の場所に移動し 配列数や総塩基数のおさらいをしている Trinity 実行結果はヒトによって異なる 以降の解析結果が同じでないと不安なヒトは wget のコメントアウト (#) を外し 同じリファレンスを用いましょう 0

202 Step 配列数は,603 個 総塩基数は,74,60 45,9 =,678,39 bp だったことを確認 0

203 推奨パイプライン マッピングプログラム bowtie 用のインデックスを作成 これは BLAST 実行前にデータベース側の配列を前処理するのと同じような作業という理解でよい Langmead and Salzberg, Nat Methods, 9: 357-9, 0 03

204 Step 実際の作業はこちら 赤枠内をコピペ Trinity.fasta を入力として bowtie-build プログラムを実行するわけだが 実行結果ファイルの拡張子の左側を trenitey として rof というディレクトリに保存するように指定している 04

205 Step 3bowtie-build 実行部分 約 5 秒 3 05

206 Step bowtie-build 実行が無事終了したので rof ディレクトリの中身を確認 拡張子の左側の trenitey の意味がわかったのではないでしょうか 06

207 推奨パイプライン 3 マッピングプログラム bowtie を実行 paired-end の場合 07

208 Step3 bowtie のバージョンや実行時のオプション情報を調べ TIGAR の推奨オプション情報から 自分の環境に合わせたオプションを選択 -x は./rof/trenitey がインデックスだと認識させるのに必要 08

209 Step3 bowtie のバージョンは..4 Bio-Linux にプレインストールされているので使える bowtie のオプションを表示 ここで -p が CPU 数 -k が複数個所にマップされたリードの最大レポート数 (-k 00 で 00 か所分まで表示 ) であることなどが分かる 09

210 Step3 bowtie h 実行後の状態 0

211 Step3 bowtie 実行本番 出力ファイルは test.sam 約 5 分

212 Step3 bowtie 実行終了後の状態

213 Step3 Bowtie によるマッピング結果の解釈 全 977,0 リード中 98,849 リード (95.05%) もマップされていることに対し 驚いている 理由は 3forward 側ファイルとしてトリムなしの data.fq.gz を与えて実行したから マップされる側のリファレンス配列も data.fq.gz を入力とした Trinity 実行結果ファイルだからかもしれない 3 3

214 Step3 ちなみに この 98,849 リード (95.05%) は 回だけマップされたリード ( time) ということなので おそらく uniquely mapped reads ということなのだろう 8,087 リード (.87%) が multi-mappers と判断した プログラムによって表現方法が異なりますが 慣れです 4

215 Step3 ls でファイルサイズを確認 656MB 結構デカいですね 5

216 推奨パイプライン 4 TIGAR を実行 paired-end の場合 6

217 Step4 TIGAR を実行 出力ファイルは test_out.txt 約 5 分 7

218 Step4 実行直後の状態 8

219 Step4 終了後の状態 エラーは出ていないようだ 9

220 Contents 乳酸菌 RNA-seq データ解析のおさらいと問題設定 de novo トランスクリプトームアセンブリ 事前準備 FastQC Rockhopper おさらい 情報抽出 様々なトリム条件で Rockhopper を実行 トリミング fastx-trimmer f l 様々なトリム条件 様々な基準でアセンブリ結果を評価 ベストな条件で paired-end アセンブリを実行 Trinity 解凍 インストール 実行方法を調べてパスを通す 色々試しながら実行 apt-get Bridger 解凍して README を眺めつつ Boost と Bridger のインストール サンプルデータでコケル 発現量推定 TIGAR のダウンロード 解凍 動作確認 推奨パイプラインに従って実行 結果の解釈 FPKM (RPKM) 値を手計算 0

221 出力ファイル形式 出力ファイル (test_out.txt) の形式についての説明 全部で 5 列からなる FPKM 値が目的の発現量情報 Z は マップされたフラグメント数 paired-end なので fragment という表現になる single-end のときのマップされたリード数の paired-end 版という理解でよい 3THETA は 全フラグメントに対する Z の割合という理解でよいが 事実上使うことはない 3

222 出力ファイル確認 出力ファイル (test_out.txt) の最初の 5 行分を表示

223 出力ファイル確認 目的の発現量情報に相当する FPKM 値 マップされたフラグメント数 (Z) 3 全フラグメントに対する Z の割合 (THETA) 4ID 情報は リファレンス配列 (Trinity.fasta) の description 行に記載されているものと同じ 4 3 3

224 出力ファイル確認 つまりリファレンス配列 (Trinity.fasta) の description 行の赤下線部分と同じ 4

225 FPKM 値を手計算 参考 FPKM 値は マップされたフラグメント数 (Z) とこの列の総和 ( フラグメント数の総和 ) および 3 配列長 (LENGTH) 情報を用いて手計算可能 3 5

226 FPKM 値を手計算 参考 3 列目にあるマップされたフラグメント数 (Z) の総和は で計算可能 6

227 FPKM 値を手計算 参考 3 列目にあるマップされたフラグメント数 (Z) の総和は 97, この計算結果を確かめたければ 自分で test_out.txt をホスト OS 上のエクセルなどで開いて 3 列目の総和を計算すればよい 7

228 FPKM 値を手計算 参考 赤枠部分の実行結果 の転写物の FPKM 値計算結果 (7.64) は ピタリと一致 のスライド 9(RPKM 補正 ) の計算式と同じことに気づく 教科書 p3-37 8

229 FPKM 値を手計算 参考 FPKM 値は この転写物上にマップされたフラグメント数に対して 9

230 FPKM 値を手計算 参考 FPKM 値は この転写物上にマップされたフラグメント数に対して マップされた総フラグメント数が だった場合 (fragments per one million) 30

231 FPKM 値を手計算 参考 FPKM 値は この転写物上にマップされたフラグメント数に対して マップされた総フラグメント数が だった場合 (fragments per one million) および 3 配列長が 000 bp だった場合 (fragments per one kilobase) で補正した値です 3 3

232 発現量推定 TIGAR は RapMap 論文や 3 手法比較論文中でも高評価です スライドを見るだけ 3 3

233 おまけ 講習会では FPKM 値を得る目的で TIGAR を用いたが Z 値はいわゆるカウント情報に相当するもの それゆえ TCC を用いた発現変動解析を引き続いて行いたい場合は のカウント情報を用います つまり トランスクリプトーム配列へのマッピング (bowtie) からカウント情報取得 (TIGAR) および発現変動解析 (TCC) の一連の流れを bowtie -> TIGAR -> TCC で行うこともできます 33