生体適合性ポリマー中の吸着水解析－吸着水の状態・水和構造・運動性－

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1 The TRC News, (August 2016) 生体適合性ポリマー中の吸着水解析 - 吸着水の状態 水和構造 運動性 - 構造化学研究部中田克 石田宏之 要旨医療機器材料に広く用いられているポリビニルピロリドンを対象として その水溶液を示差走査熱量測定や NMR 測定を用いて ポリマーと相互作用した水の状態 構造 運動性を評価した ポリマーと相互作用した水にはさまざまな状態の水が存在しているが 分析の観点からどのようにアプローチできるかについて紹介する 1. はじめに人工腎臓などの医療機器において抗血栓性や低生体刺激性のような 生体適合性 は重要な性能の一つである しかし 生体適合性の発現メカニズムは未だ解明されておらず 医療分野における重要なテーマとなっている ポリマー材料表面の近傍では ポリマーと相互作用した吸着水層が形成されている 吸着水はポリマーからの相互作用距離によって近傍水と中間水に分類される また ポリマー表面から遠く離れ ポリマーと相互作用していない水は自由水として存在し 通常のバルク水と同様の挙動をとっている 一方 血液中のタンパク質は周囲を取り囲む水分子との相互作用 ( 溶媒和 水素結合 ) によって安定な折り畳み構造を保っている 医療機器のポリマー材料表面でタンパク質の水和水は表面近傍の吸着水を介して接触し その際に水和水の構造が乱れることで タンパク質の折り畳み構造が壊れ タンパク質同士の凝集 変性が生じ その後変性タンパク質への細胞の接着 活性化が起こることで血栓が形成されると考えられる ( 図 1) したがって ポリマー材料表面における吸着水 特に中間水の状態が 生体適合性の発現に大きく寄与しているとして注目されている 1) 中間水と生体適合性発現メカニズムの関係については今後の解決すべき課題であるが 本稿ではその課題まで追究はせず 中間水がタンパク質の水和水が近傍水との接触を妨げることで生体適合性が発現する という仮説に基づき ポリマーが中間水をどれくらい保有できるか その中間水の状態 ( 構造 運動性 ) はどのようなものか の観点から示差走査熱量 (DSC) 測定および核磁気共鳴 (NMR) 測定を用いた分析アプローチ方法について紹介する 対象ポリマーは 生体適合性ポリマーとして広く医療機器に用いられているポリビニルピロリドン (PVP) を用いた 図 1 ポリマー表面の吸着水と血栓形成メカニズム 2. PVP とタンパク質の相互作用 PVP と水分子の相互作用の評価方法について紹介する 1

2 前に まず PVP とタンパク質の相互作用を等温滴定カロリメトリー (ITC) によって評価した結果を紹介する ITC は分子間の相互作用にともなう熱変化を調べ 結合の強さ ( 結合定数 K d ) 結合比 n エンタルピー変化 H およびエントロピー変化 S を測定する手法である H S の熱力学的プロファイルから分子間の結合様式を推定することができる 対象タンパク質としてウシ血清アルブミン (BSA) を採用して BSA と PVP の相互作用を評価した 図 2 に等温滴定曲線 図 3 に ITC の結果得られた熱力学的プロファイルを示す 図 2 BSA 水溶液への PVP 水溶液の等温滴定曲線 定される なお この結果は上述のタンパク質の水和水構造が乱れることで タンパク質がポリマーへ吸着する仮説を支持するものである 3. PVP と水分子の相互作用上述のようにポリマーと相互作用した水分子は近傍水 中間水 自由水に分類される 自由水はポリマーとは相互作用しておらず 周囲を水分子に取り囲まれた通常の水として振る舞っている水である したがって 通常の水と同様に 0 ºC 以下で周りの水と強く水素結合を形成して氷晶化 ( 凍結 ) し 分子運動も止まる 一方 近傍水はポリマー近傍でポリマーと強く相互作用しており そのため通常の水のような綺麗な水素結合を形成することができず 低温でも凍結せず 分子運動も止まらない すなわち不凍水として存在している 低温 の定義は研究分野や測定手法などでさまざまであるが本稿では-60 ºC でも凍結しない水を不凍水として定義する 中間水は自由水よりも強く 不凍水よりも弱く ポリマーと 中間的な相互作用 をしている水として定義される 0 ~ -60 ºC の範囲で凍結 融解する水 あるいは同温度域で分子運動が止まったり 動き出したりする水を中間水として定義する 図 3 PVP と BSA の相互作用における熱力学的プロファイルその結果 K d = M n = 0.86 H = 8.2 kj mol -1 -T S = kj mol -1 であった 結合様式としてはエントロピー増加が支配的な相互作用であり すなわち PVP や BSA の脱水和や BSA の構造崩壊による PVP-BSA 間の疎水性相互作用によって結合すると推 2 図 4 水の状態のイメージこのようにポリマーと相互作用した水分子は その相互作用の強さに起因して融点や運動性が変化しており DSC 測定では水の凍結 融解時の熱収支の観点から NMR 測定では 水分子の運動性の観点から水分

3 子の状態 量を評価することができる DSC や NMR の他に一般的な中間水の分析としては 赤外やラマン分光による水素結合状態 X 線回折や中性子散乱による水和構造 誘電緩和やテラヘルツ分光 中性子準弾性散乱による運動性の評価が挙げられる 2) 3.1 DSC 法による水の状態 量解析図 5 に67wt% のPVP 水溶液について測定した昇温過程の DSC 曲線を示す 測定条件としては まず-60 ºC まで-20 ºC /min で降温したのち 0.3 ºC /min で昇温した 図 6 PVP 水溶液における DSC 曲線の含水率依存性 ( 昇温過程 ) 図 5 PVP 水溶液 (67wt%) における DSC 曲線 ( 昇温過程 ) DSC 曲線に見られる吸熱ピークは中間水あるいは自由水の融解によるものである 融解ピークのうち 0 ºC 以下の面積から中間水 0 ºC 以上の面積から自由水がそれぞれ定量できる 67wt% では 0 ºC に融解ピークは観測されず 自由水は存在していないことがわかった また 不凍水は降温過程において凍結していないため 融解ピークとしては観測されず 試料の全水量と融解ピークから求めた中間水 自由水量の差を求めることで不凍水量を評価できる また -25 ºC 付近に階段状の吸熱が観測されており これは非晶質固体の流動性が急激に増大して液体に転移する際に生じるガラス転移と呼ばれる現象である 一般に水のガラス転移温度 T g は-140 ºC と低温であるため これは含水によって可塑化した PVP のガラス転移であると考えられる T g が低温で観測されるほど より低温でも分子が流動性を示すということになるため ポリマーの運動性を示す指標になる 図 6に含水率をさまざまに変えたPVP 水溶液のDSC 曲線を示す 3 26wt% や 40wt% の低含水率の水溶液では融解ピークはほとんど観測されておらず これらの含水率ではほぼ水分子は不凍水としてのみ存在していると考えられる 含水率を増やすにつれて 氷の融解ピークが観測されるようになり 中間水や自由水が増加していることがわかった また T g が低下していることから PVP の運動性が含水によって高くなったと考えられる 特筆すべきは 51wt% では-45 ºC 付近に低温結晶化による特徴的な発熱ピークが観測されていることである 九州大学田中教授らは生体適合性が優れたポリマーでは 一様にこの低温結晶化を示す水が存在することを見出している 1) DSC 曲線から融解熱量 ( 融解ピーク面積 ) と融解ピーク温度 T m および T g を評価した結果を図 7 と図 8 にそれぞれ示す 図 7 融解熱量の含水率依存性

4 図 8 融解ピーク温度 T m とガラス転移温度 T g の 含水率依存性 図 7 の融解熱量の含水率依存性から 約 50wt% より低含水率では融解熱量がほとんど観測されず ほぼ不凍水のみが存在していることがわかった 50wt% から含水率が増加するにつれて融解熱量が増加しているが 80wt% 以下では T m が 0 ºC よりも低温のため ( 図 8) 50 ~ 80wt% では不凍水と中間水のみが存在し 80wt% より高含水率で自由水が出現し始めると 考えられる ここで ポリマーが保有できる吸着水についてより 図 9 PVP 水溶液 (67wt%) における重水の 2 H-NMR スペクトル イメージしやすくするために 下式を用いて含水率 x(wt%) から算出されるモノマー当りの水和数 n w を導入する n w xm p = (100 - x) M w M p はポリマーのモノマー分子量 (PVP では 111) M w は水の分子量 (=18) である したがって PVP は 50wt% すなわちモノマー当り 6 個の不凍水と 50~80wt% すなわちモノマー当り 13 個の中間水を保有できるポリマーであると言える 3.2 温度可変 2 H-NNR 法による水の状態 量解析 110 ºC で1 晩真空乾燥させたPVPに重水を吸着させて 図 10 2 H-NMR による PVP モノマー当りの 可動水分子数の温度依存性 67wt% に調製した試料の温度可変 2 H-NMR スペクトル を図 9 に示す 2 H-NMR で重水を測定すると 水分子が速い回転運動を行っているとシャープな NMR シグナルが観測される 温度低下によって水の ( 回転 ) 運動性が低下すると 重水ピークがブロード化して シグナル強度が減少する このシグナル強度から動いている水を定量することができる 36wt% と 67wt% に調製した PVP 水溶液について得られた 2 H-NMRシグナル強度から計算したモノマー当りの可動水分子数の温度依存性を図 10 に示す 67wt% について詳しく見ると 冷却過程において重水の融点 (4 ºC) より低温でも可動水分子数は変化せず -10 ºC で急激に 4 個まで減少し その後緩やかに減少する挙動 4

5 が確認された -60 ºC まで冷却しても 1 個弱の水分子 が動ける状態で存在していることがわかり これは不凍水として存在していると考えられる 一方 昇温過程では-10 ºC 付近までは冷却過程に沿って可動水分子数が増加し その後 冷却過程の曲線から離れて比較的緩やかに可動水分子数が増加する 履歴効果 ( ヒステリシス ) が観測された DSC の結果から 67wt% では自由水は存在しておらず 不凍水が約 1 個 残りが中間水であると推定されるが -10 ºC を境にしたヒステリシスを示す中間水と示さない中間水では PVP との相互作用が異なっていると考えられる 本稿では便宜上 前者を中間水 1 後者を中間水 2として区別する 36wt% は中間水 1は存在しない含水率であり したがって ヒステリシスは観測されなかった 同様の含水率の DSC 曲線と比較すると 67wt% において-10 ºC 付近で DSC では融解し始め 2 H-NMR では急激に可動水分子数が増加するといった類似挙動を示しており 両手法間で類似な水の挙動を捉えられていることがわかる 一方 67wt% における DSC 曲線の -10 ºC 以下の範囲や40wt% のDSC 曲線では有意な融解が観測されないが 2 H-NMR では有意に可動水分子数の変化が捉えられており 両手法の観測対象 (DSC: 水の融解 2 H-NMR: 水の回転運動 ) の違いから 異なる水の挙動を評価していることも示唆される また 温度可変 2 H-NMR の結果からは 不凍水約 1 個 中間水 2が 3 個 中間水 1が 7 個以上と結論付けられ 水の状態解析においても DSC とは異なる結果を示した これは DSC では融解に関わった水の熱量を観測しているのに対して 2 H-NMR では水分子の回転運動に着目して 分子レベルの局所的な動いている水分子を観測しており 中間水などポリマーに拘束され運動性が低下した水については 2 H-NMR の方が敏感に観測できていると考えられる この手法間の差異を相補的に議論することで 中間水のマクロ ( 融解 ) からミクロ ( 分子運動 ) における階層的な状態を詳細に評価できる可能性がある C-NNR 法による水和構造の推定ポリマーと相互作用した水がポリマーのどの官能基と相互作用しているかはポリマー選定や設計に大きな指針を与えると考える 図 11 には含水率をさまざまに変えた PVP 水溶液について測定した 13 C-NMR スペクトルを示す 5 図 11 各含水率における PVP 水溶液の 13 C-NMR スペクトル 各ピークに示したアルファベットは PVP 構造式の各炭素原子に対応している 炭素 b~f( ピロリドン環の CH 炭素 主鎖の炭素 ) 由来のピークの化学シフトは含水率によりまったくシフトしていないのに対して 炭素 a( カルボニル基 ) 由来のピークの化学シフトは含水率に対して敏感に変化していることがわかる これはカルボニル炭素原子の電子遮蔽状態が水和により変化することで 化学シフトの変化として観測されたものである すなわち 本測定において 化学シフトの変化が顕著に観測されたアミド基への水和が支配的であると結論付けられる 上述の 2 H-NMR の結果から 14wt% では不凍水のみ 35wt% では中間水 2と不凍水 66wt% ではさらに中間水 1が存在することがわかるが 比較的 PVP と強く相互作用しているであろう不凍水や中間水 2だけでなく 中間水 1もアミド基へ優先的に水和しているということが明らかになった 3.4 磁場勾配 NMR 法による水の拡散係数解析磁場勾配 NMR では 水の並進自己拡散係数を評価することができる 図 12 に 36wt% と 66wt% について磁場勾配 NMR 測定を測定して求めた拡散係数と 純水 ( 自由水 ) の拡散係数の文献値 3) を併せて示す 簡単のために 36wt% では中間水 2 66wt% では中間水 1の拡散係数が評価できていると考えると 拡散係数は自由水が最も速く 次いで中間水 1 中間水 2の順で遅くなっていることがわかった

6 4. おわりに 図 12 PVP 水溶液における水分子の 拡散係数のアレニウスプロット 生体適合性と中間水の関係について明確な関係性は未だ明らかになっていない中で 本稿では中間水の生体適合性発現メカニズムにおける働きを仮定して 中間水にどのように分析アプローチするかについて述べた 本稿で詳しく説明した以外に各種分光法や誘電緩和 X 線 中性子散乱を用いた分析アプローチも行っていく予定である TRC では 今後 さらに多種の生体適合性ポリマーについて分析経験を培うことで 中間水がいかに生体適合性発現に寄与しているかを実証できると期待している 図 12 は縦軸が拡散係数の対数表示 横軸が温度 (K) の逆数となっており すなわちアレニウスプロットとなっている このアレニウスプロットの傾きから 拡散の活性化エネルギー E a を評価することができる D a = D 0 exp(-e / RT ) 求めた活性化エネルギーを表 1 に示す 中間水 1と中間水 2ともに自由水よりも大きい活性化エネルギーを有しており 拡散に際してそれだけ大きいバリアを乗り越える必要があることがわかる 水分子が拡散するとき まず周囲の水分子や官能基との水素結合を切って その後新たな水分子や官能基と水素結合を結ぶ ということを繰り返しながら拡散していく 今回評価した活性化エネルギーが水素結合の切断エネルギーに相当していると考えると 中間水 1や中間水 2は PVP のアミド基と水素結合を結び 運動が拘束されており その水素結合の強さや運動の拘束の度合いは中間水 2 の方が強いことが示唆される 引用文献 1) 田中賢, 化学と教育, 60 巻 6 号, p.250 (2012). 2) Y. Furushima, et al., Thermochimica Acta, 538, 43 (2012). 3) M. Holz, et al., Phys. Chem. Chem. Phys., 2, 4740 (2000). 中田克 ( なかだまさる ) 構造化学研究部構造化学第 2 研究室研究員趣味 : バレーボール ダイナミクス石田宏之 ( いしだひろゆき ) 構造化学研究部構造化学第 2 研究室研究員趣味 : 旅 表 1 拡散の活性化エネルギー 含水率活性化エネルギー水の状態 /wt% / kj mol 中間水 中間水 自由水 20 6