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かんじつつの
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1 1 第 98 回特定胚等研究専門委員会平成 29 年 4 月 12 日ヒト及び動物の要素が交じり合うイメージについて - 動物性集合胚研究の成果からみる表現型の実際 - 国立成育医療研究センター研究所再生医療センター阿久津英憲

月 4 日資料 87-1-2 Figure 5 ; Weinberger L, Ayyash M,

2 2 動物性集合胚に関連する幹細胞の整理多能性幹細胞の種間差 Naïve と Primed, マウスとヒト特定胚及びヒト ES 細胞等研究専門委員会 ( 第 87 回 ) 平成 26 年 8 月 4 日資料 Figure 5 ; Weinberger L, Ayyash M, Novershtern N, Hanna JH. Nat Rev Mol Cell Biol, 2016

3 3 動物性集合胚研究の現状 Summary of the Current State of Research on Interspecies Chimeras Species Mus musculus, Myodes glareolus Mus musculus, Mus caroli Evolutionar y Distance a 30.4 Mya morula-morula aggregation Method Surrogate Outcome Reference Mus musculus majority of embryos were abnormal; two normallooking embryos at E9 and E10 with low chimerism; no live embryos beyond E Mya blastocyst injection of ICMs Mus musculus live-born chimeras developed to adulthood Mystkowska, 1975 Rossant and Frels, 1980 Ovis aries, Capra hircus Bos Taurus, Bos indicus Mus musculus, Rattus Mus musculus, Apodemus sylvaticus 9.9 Mya aggregation of four-cell or eight-cell embryos; blastocyst injection of ICMs 0.5 Mya aggregation of morulae, compact morulae or early blastocyst demi-embryos 17.9 Mya morula-morula aggregation; morula-icm aggregation; blastocysts injection of ICMs blastocyst injection of rat PSCs blastocyst injection of mouse PSCs 11.4 Mya blastocyst injection of apodemus ESCs Ovis aries or Capra hircus Bos Taurus or Bos indicus live-born chimeras developed to adulthood live-born chimeras developed to adulthood Mus musculus chimeric blastocysts and embryonic chimeras; no viable live-born chimeras Mus musculus live-born chimeras developed to adulthood Rattus live-born chimeras developed to adulthood Mus musculus live-born chimeras developed to adulthood Fehilly et al., 1984 Williams et al., 1990 Mulnard, 1973; Stern, 1973; Zeilmaker, 1973; Gardner and Johnson, 1973; Rossant, 1976 Kobayashi et al., 2010; Isotani et al., 2011 Kobayashi et al., 2010 Xiang et al., 2008 Table 2; Wu J, Izpisua Belmonte JC. Cell Stem Cell, 2015

4 4 動物性集合胚研究の現状 Summary of the Current State of Research on Interspecies Chimeras Species Mus musculus, Homo sapiens Evolutionary Distance a Method Surrogate Outcome Reference 90.1 Mya blastocyst injection of Mus musculus developmental James et al., 2006 hescs retardation; poor and low efficient contribution to in vivo: Blst-hESCs inj. E5., in vitro: Blst-hESCs inj. E6. in vivo: Mor-hiPSCs inj. E8.5-E10.5 morula injection of naive hpscs epiblast grafting of human rsescs in vivo: 8c/Mor/Blst-hESCs inj. NO chimeras@e10.5 Mus musculus, Macaca mulatta 90.1 Mya eight-cell or blastocyst injection of rhesus naïve ipscs normal embryos Mus musculus interspecies chimeric embryos at E8.5 E10.5 (Gafni et al.); no chimeric contribution in recovered E10.5 embryos (Theunissen et al.) Mus musculus chimeric contribution after grafting to posterior part of E7.5 mouse epiblast followed by 36 hr in vitro embryo culture Mus musculus interspecies chimeric embryos at E10.5 and E16 Gafni et al., 2013; Theunissen et al., 2014 Wu et al., 2015 Fang et al., 2014 Table 2; Wu J, Izpisua Belmonte JC. Cell Stem Cell, 2015 背景 : キメラ形成能は ips 細胞に代表される多能性幹細胞の検証方法

5 5 動物性集合胚研究の現状 1 ヒト幹細胞の動物胚への寄与率は極めて低い Theunissen et al., 2016, Cell Stem Cell 19, 1-14 ナイーブ型ヒト ES 細胞をマウス胚盤胞に移植した動物性集合胚をマウス胎内に移植し胎生 9.5~ 12.5 日でヒト細胞が含まれているかを解析 2951 個のマウス胚にヒト ips 細胞を注入した結果ヒト細胞が残っていた胚の数は 7 個 Figure 7; Theunissen TW, et al. Cell Stem Cell, 2016 ヒト細胞の種類動物胚の種類動物性集合胚の移植先ナイーブ型ヒト ES 細胞マウスマウス成功例 : 胎生 9.5 日の動物性集合胚赤い点 1 つがヒト細胞 1 個移植期間分化制御胚盤胞補完法 9.5~12.5 日なしなし

6 論文の概要図動物性集合胚研究の現状 2 Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem Cells Jun Wu, Aida Platero-Luengo, Masahiro Sakurai, Atsushi Sugawara, Maria Antonia Gil, Takayoshi Yamauchi,

Martinez, Tomoaki Hishida, Sonia Sánchez-Bautista, M.

Travis Berggren, Estrella Nuñez Delicado, Jeronimo Lajara, Isabel Guillen, Pedro Guillen, Josep M. Campistol, Emilio A.

6 6 論文の概要図動物性集合胚研究の現状 2 Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem Cells Jun Wu, Aida Platero-Luengo, Masahiro Sakurai, Atsushi Sugawara, Maria Antonia Gil, Takayoshi Yamauchi, Keiichiro Suzuki, Yanina Soledad Bogliotti, Cristina Cuello, Mariana Morales Valencia, Daiji Okumura, Jingping Luo, Marcela Vilariño, Inmaculada Parrilla, Delia Alba Soto, Cristina A. Martinez, Tomoaki Hishida, Sonia Sánchez-Bautista, M. Llanos Martinez-Martinez, Huili Wang, Alicia Nohalez, Emi Aizawa, Paloma Martinez-Redondo, Alejandro Ocampo, Pradeep Reddy, Jordi Roca, Elizabeth A. Maga, Concepcion Rodriguez Esteban, W. Travis Berggren, Estrella Nuñez Delicado, Jeronimo Lajara, Isabel Guillen, Pedro Guillen, Josep M. Campistol, Emilio A. Martinez, Pablo Juan Ross, Juan Carlos Izpisua Belmonte Cell Volume 168, Issue 3, Pages e15 (January 2017) Highlights Naive rat PSCs robustly contribute to live rat-mouse chimeras A versatile CRISPR-Cas9 mediated interspecies blastocyst complementation system Naive rodent PSCs show no chimeric contribution to post-implantation pig embryos Chimerism is observed with some human ipscs in post-implantation pig embryos

7 7 Generation and interspecies ICM incorporation of different types of hipscs ナイーブや中間型のヒト ips 細胞の概略図ナイーブや中間型のヒト ips 細胞の形態赤い点 1 つ 1 つが ips 細胞 1 個 Figure 4; Wu J, et al. Cell, 2017

8 8 Generation and interspecies ICM incorporation of different types of hipscs ブタまたはウシの胚盤胞にナイーブや中間型のヒト ips 細胞を注入し分析する実験の概略図単為発生体外受精ヒト ips 細胞を注入した胚盤胞を 2 日間シャーレで培養し 1-5 を解析 2 日間シャーレで培養した結果 Figure 4C; Wu J, et al. Cell, 2017 BL: 胚盤胞 ICM: 内部細胞塊胚盤胞のうち胎仔になる部分 Figure S3; Wu J, et al. Cell, 2017

9 9 ヒト - ブタキメラ胚の作製と移植評価ナイーブや中間型のヒト ips 細胞のブタ胚盤胞注入と移植後ブタ胚の分析実験手順の概略図 Figure 5; Wu J, et al. Cell, 2017 実験結果ヒト細胞の種類ナイーブ型中間型 ips 細胞動物胚の種類ブタ胚に細胞注入母ブタから取り出した胎仔動物性集合胚の移植先ブタ移植期間日分化制御なし胚盤胞補完法なし正常な胎仔成長が遅くなった胎仔 Figure S4; Wu J, et al. Cell, 2017

10 10 実験結果ヒト - ブタキメラ胚の作製と移植評価 2C, 2-cell embryo; ZG, zygote; MO, morula; BL, blastocyst; PT, parthenote Figure 5; Wu J, et al. Cell, 2017 妊娠日の間に回収されたブタ胚の解析概要 :

11 11 実験結果ブタ胚に対するヒト ips 細胞 ( GFP 標識 ) のキメラ寄与 Figure 6; Wu J, et al. Cell, 2017 正常サイズの 28 日目のブタ胚に一部 ips 細胞由来の細胞を認める

12 12 実験結果ブタ胚に対するヒト ips 細胞 ( GFP 標識 ) のキメラ寄与 Figure 6; Wu J, et al. Cell, 2017 B:28 日目のブタ胚における ips 細胞のキメラ寄与 SMA( 中胚葉 )TUJ1( 外胚葉 ) CK8( 内胚葉 ) HuNu( ヒト細胞 ) を赤く染色 GFP ( 緑 ) 陽性ヒト ips 細胞が赤く染まると 3 段目で黄色く見え同じ細胞であることがわかる

13 13 動物性集合胚研究の現状 3 ヒト EPS 細胞 :Extended Pluripotent Stem cells from blastocysts=es 細胞ヒト細胞の種類動物胚の種類動物性集合胚の移植先移植期間分化制御胚盤胞補完法ヒトEPS 細胞マウスマウス 10.5 日なしなし

14 14 Fig.5: ヒト EPS を 8 細胞胚へ移植し時間後回収 Fig.6: ヒト EPS をマウス初期胚 (E2.5/E3.5) へ注入しマウス子宮内へ移植. E10.5 に回収 Figure 5, 6; Yang Y, et al. Cell, 2017

15 15 動物性集合胚研究の現状

16 16

17 17 第 97 回特定胚等研究専門委員会資料 97-2

18 18 ヒトと動物との境界 ( 外見 ) 一般国民がヒト及び動物の要素が渾然一体となって交じり合うイメージの個体との懸念を抱く可能性があるものとは具体的にどのようなものかまたそれが生じる蓋然性について整理すべき画像はブタ人間で Google 検索したものブタクローン技術規制法で胎内移植を禁止特定胚指針で作成を禁止動物性集合胚ヒト性集合胚ヒト動物交雑胚ヒト総合科学技術会議第 9 回生命倫理専門調査会 ( 平成 13 年 11 月 6 日 ) 資料 2-2 特定胚の取扱いに関する指針 ( 案 )( 見え消し版 )(PDF)

19 19 ヒト及び動物の要素が交じり合うイメージの個体が生じる蓋然性について動物性集合胚からヒトと動物の境界があいまいな個体が生まれることはないのか? 動物性集合胚からヒト - 動物のそれぞれを合わせ持つ表現型の個体は生みだせない実際胚盤胞補完法による膵臓作成ではラット - マウスで最大キメラ率 20% 基本的にホスト胚及び母体の体格になるさらにキメラ率は種の近さに依存するためヒト - ブタではそれ以下となる Figure 3 Potential application of interspecies chimaeras with human stem cells. Organ generation via interspecies blastocyst complementation or interspecies targeted organ complementation could help to solve the severe shortage of organ donors worldwide. Human animal chimaeras will also help researchers to understand the aetiology, onset and progression of human diseases better. Additionally, they could be useful for testing the efficacy and safety of a candidate drug in vivo. Wu J, et al. Review in Nature, 2016

20 20 クローン法の動物性集合胚の定義についての課題ヒトに関するクローン技術等の規制に関する法律 ( 動物性集合胚定義部分 ) 第二条二十動物性集合胚次のいずれかに掲げる胚 ( 当該胚が一回以上分割されることにより順次生ずるそれぞれの胚を含む ) をいうイ二以上の動物性融合胚が集合して一体となった胚 ( 当該胚と体細胞又は胚性細胞とが集合して一体となった胚を含む ) ロ一以上の動物性融合胚と一以上の動物胚又は体細胞若しくは胚性細胞とが集合して一体なった胚ハ一以上の動物胚とヒトの体細胞又はヒト受精胚ヒト胚分割胚ヒト胚核移植胚人クローン胚ヒト集合胚ヒト動物交雑胚ヒト性融合胚ヒト性集合胚若しくは動物性融合胚の胚性細胞とが集合して一体となった胚 ( 当該胚と動物の体細胞又は動物胚の胚性細胞とが集合して一体となった胚を含む ) ニイからハまでに掲げる胚の胚性細胞であって核を有するものがヒト除核卵又は動物除核卵と融合することにより生ずる胚特定胚及びヒト ES 細胞等研究専門委員会 ( 第 87 回 ) 平成 26 年 8 月 4 日資料ハの水色ハイライト部分が一般的なヒト- 動物キメラ胚ニ ( オレンジハイライト ) は動物性集合胚の細胞の核を動物除核卵に移植する場合が含まれ当該胚はヒト性融合胚に相当するハとニの動物性集合胚の取扱いは分けて考えるべき

資料110－4－1　核置換（ヒト胚核移植胚）に関する規制の状況について

資料110－4－1　核置換（ヒト胚核移植胚）に関する規制の状況について第 110 回特定胚等研究専門委員会平成 31 年 4 月 9 日資料 110-4-1 核置換 ( 胚 ) に関する規制の状況について核置換 ( ミトコンドリア置換 ) 技術について受精胚核置換 ( 胚 ) 受精卵の核を別の除核卵に移植人の胎内に移植した場合精子卵体外受精 ( 有性生殖 ) 胚核正常ミトコンドリア異常ミトコンドリア核 DNA はカップル由来ミトコンドリア DNA