Key words : arbitrarily primed PCR, Salmonella enterica serovar Enteritidis, plasmid DNA profile, antimicrobial susceptibility, phage type

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2 Table 1 Strains of S. Enteritidis Table 2 Primers used in the AP-PCR profile of S. Enteritidis HP : Feces of healthy person FP : Feces of food poisoning patient SC : Feces of sporadic case patient

3 AP-PCR法 ase濃 度 の 最 適 な も の を 選 ん だ.AP-PCR反 は10 reaction buffer(gene taq 応 液 (16.5μg/ml)を (Genetaq,Wako)0.4μl,テ 水 を 加 system USA)を 用 い,は 94 5min,elongation し,そ 72 の 後denaturation plasmid 3. M : plasmid size marker で10min 94 denatura36 イ ク ル 増 幅 1min,annealing 1minで30サ elongationさ イ ク ル せ た.PCR産 リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル で 定 電 流 30mA,120min電 気 泳 動 後,エ ド で 染 色 し,254nmの チ ジ ウム ブ ロ マ イ トラ ン ス イ ル ミネー タ ー上 で 写 真 撮 影 後 観 察 し た. 成 供 試 し た 菌 株 は,す Table 3 obtained RDNC: Phage from Reaction SM : Streptomycin, 平成9年8月20日 績 べ て60kbpの type, Plasmid 21 cases dose TC: not プ ラ ス ミ ド保 profile in Wakayama type, Drug resistance City, conform Tetracycline, -: (S. Enteritidis ) Elmer, 5min,annealing 72 10min 物10μ1を15%ポ gel electrophoretic し た.PCRは, 5minで4サ 1min,elongation 増 幅 後,72 polymerase 9600(Perkin じ め に94 tionし,denaturation 36 Agarose ン プ レ ー ト20 え て 全 量 を50μ1に GeneAmp(R)PCR profile types of Salmonella Enteritidis. FL 1, 2 and 3 : plasmid profile type 1, 2 and プ ライ マ ー 各5μlとTaq 疫学 的 検 討 Fig. buffer,wako), 15mMMgCl2,dNTPmix(各lmM)と μlに に よ るS.Enteritidisの Susceptible and AP-PCR type of S. Enteritidis strains

4 吐崎 748 有 株 でPL1,PL2,PL3の3種 1).薬 に 分 類 で き た(Fig. 剤 感 受 性 は,3種 事 例1がSM耐 が12),反 応 液 や 温 度 条 件 を 最 適 な も の に 定 め,分 類 用 の 対 照 に コ ン トロ ー ル 株 を 置 い てAP-PCRを 例3以 あ っ た.フ ァ ー ジ 型 は34型,1型 あ っ た.1996年 で,そ な ど影 響 を 受 け る 要 因 が 多 い 例2がTC SM耐 あ っ た.事 降 は す べ て9薬 剤 に感 受性 で フ ァ ー ジ1型 ら従 来 か ら 使 用 さ れ て き た3種 実 施 す れ ば,安 る.ま で れ で は,A- プ ラ イ マ ー に よ りb1,b2の2種 類 に,B-32 類 に,C-42プ 類 に,C-45プ 年 の 事 例1以 示 し て い る6).1992年 例 中17事 あ っ た.タ イ プCはAP-PCR法 プIII,IV,Vの3種 らVIに 分 類 で き り主 流 で 考 Fig. 2 A-11 性,60kbpの め,フ ら80%を 占 め て い た フ ァ ー ジ4 プ ラ ス ミ ド を 持 つ 株(和 歌 ァ ー ジ4型,薬 ミ ド を 持 つ 株(タ polymerase濃 AP-PCR primers で 全 体 の70か 山 市 で は 分 離 さ れ て い な い)が 察 ロ フ ァ イ ル はMg2+濃 ニ ー リ ン グ 温 度,Taq と4型 型,SM耐 に よ り更 に タ イ 主 流 で27,7%を 剤 感 受 性,60kbpの イ プC)は8.1%で さ れ て い る6).和 歌 山 市 のS.Enteritidisは 度,テ C株 profile が81%を of Salmonella 占 め,15事 Enteritidis 例(71%)が タイプ タ イ プC IV using A-11, B-32, C-42 and C-45. B-32 C-42 C-45 感 染症 学 雑誌 占 プラス あ っ た と報 告 度,ア fingerprinting か ら 以 降 の 日本 の 主 流 フ ァー ジ る1)13)14).山梨 県 で も 同 様 で あ り,ま 類 に 細 分 す る こ とが で き た. AP-PCRプ れ は 日本 の フ ァー ジ の 動 向 の 山 梨 県 の金 子 らの 報 告 と一 致 した 動 向 を は1型 類 のマー カーの分類 で 例(81%)あ へ と 降 分 離 さ れ て お ら ず,1985年 の4本 タ イ プCは21事 と1型 と ほ ぼ 一 致 し て い る1)13)14).タ イ プA Iは,1991 る こ と が で き た(Fig.2).こ 来 の3種 フ ァ ー ジ 型 は1991 以 降4型 変 化 し て き て い る.こ 1995年 の 分 類 の 組 み 合 わ せ で タ イ プ1か 板 上 の コロ 一 の ロ ッ トの 酵 に安 定 した プ ロ フ ァイ ル 和 歌 山 市 のS.Enteritidisの 類 にそれぞれ分類す た(Table3).従 の 影 響 も,平 定 め,同 年34型,1992年1型,1994年 に よ りc4,c5,c6,c7の4種 のプライマ ー を 得 る こ と が で き た. ライ ライマー とTaq 力 価 の 違 い に よ りプ ロ フ ァイ ル に 素 を 使 う こ と に よ り,更 ら タ イ プEの5 11プ ラ イ マ ー に よ りa1,a2,a3の3種 ン プ レ ー ト量 ニ ー の 直 径 を1.5mmに で あ っ た.こ 種 に 分 類 で き た(Table3).AP-PCR法 定 した 分 類 結 果 を得 る こ とが で き 濃 淡 の 差 が 生 じ た が,こ 類 の疫学 マーカー の 組 み 合 わ せ に よ り,タ イ プAか た,テ polymeraseの フ ァ ー ジ 型 はRDNC の 他 の 事 例 は フ ァ ー ジ4型 マ ー に よ りc1,c2,c3の3種 の3種 フ ァ ー ジ34型,1992 の 事 例11は の 事 例19の 性 で 及 び4型 の 事 例1が 年 の 事 例2と1995年 ン プ レ ー ト量 類 の タ イ プ に 分 類 で き, 性 で,事 類 で あ っ た.1991年 修 他 第71巻 第8号

5 7) Suzuki Y,. Ishihara M, Matsumoto M et al. : Molecular epidemiology of Salmonella Eanteritidis. An outbreak and sporadic cases studied by means of pulsed-field gel electrophoresis. J Infect 1995 ; 31 : ) Lin AW, Usera MA,Barret TJ, Goldsby RA : Application of random amplified polymorphic analysis to differentiate strains of Sal - monella Enteritidis. J Clin Microbiol 1996 ; 34 : ) Kado C, Liu ST : Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacreriol 1981 ; 145 : ) Jutras EM, Miller RM, Pepper IL: Optimization of arbitrarily primed PCR for the identification of bacterial isolates. J Microbiol Methods 1995 ; 24 :

6 Application of Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Analysis to Epidemiological Study of Salmonella enterica Serovar Enteritidis Osamu HANZAKI, Yoshiharu MORINO, Yuko KANAZAWA, Michi UENO, Yoko MATSUKAWA, Ikuya YAMAMOTO & Kazue TABITA Wakayama City Institute of Public Health An arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR) profile was applied to epidemiological analysis of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis. A total 21 strains of S. Enteritidis isolated from 21 cases (10 cases of healthy persons, 7 cases of food poisoning outbreaks and 4 sporadic diarrhea cases), during the period between December 1991 and August 1996 in Wakayama City, were used. A total of 60 arbitrary primers ( oligomer (12) set, Wako) were screened with 4 S. Enteritidis strains of different cases. A-11, B- 32, C-42 and C-45 primers were chosen. Plasmid profiles, antimicrobial susceptibility patterns and phage types were also examined. The combination of these three methods resolved the collection into five groups (A to E). And type C strains were found in 17 cases (81%) out of 21 cases. However, according to AP-PCR profile, all 21 strains were classified into six groups (I to VI), and 17 type C strains were classified into three groups (III, IV and V). Type IV was predominant in Wakayama City, and type C EIV was found in 15 cases (71%). In conclusion, we considered that AP-PCR profile using appropriate primers was an effective epidemiological marker.

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