「生理」

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えりかやすこ
5 years ago
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1 脳脊髄液 ( リコール ) 検査マニュアル (SOP) Ver 作成者 : 中野幸弘このマニュアルは髄液検査の操作法について規定したマニュアルです内容等変更があった場合には速やかに改訂を行うことこのマニュアルの内容の多くは標準化の立場から髄液検査法 2004: 日本臨床衛生検査技師会を参考にしていますなお上記テキストで規定されているものの当院ではまだ標準化されていない事項については赤字印字をしていますので注意してください髄液検査 SOP 1

Ⅰ. 脳脊髄液 ( リコール ) について脳脊髄液の容量は 150ml 脊椎管内には 30ml 脊髄下端には 5ml 500ml/ 日が脳室の脈絡叢で産生上矢状静脈のクモ膜顆粒で吸収腰椎穿刺 ( 水平横臥位 ) では正常の脳圧は 120~150mmH2O である 1 2 Monro 孔 Magendie 孔第三脳室と側脳室を連絡第四脳室正中でクモ膜下腔を連絡 3 Luschka 孔

2 Ⅰ. 脳脊髄液 ( リコール ) について脳脊髄液の容量は 150ml 脊椎管内には 30ml 脊髄下端には 5ml 500ml/ 日が脳室の脈絡叢で産生上矢状静脈のクモ膜顆粒で吸収腰椎穿刺 ( 水平横臥位 ) では正常の脳圧は 120~150mmH2O である 1 2 Monro 孔 Magendie 孔第三脳室と側脳室を連絡第四脳室正中でクモ膜下腔を連絡 3 Luschka 孔第四脳室外側でクモ膜下腔を連絡異常髄液糖 γ グロブリン蛋白細胞解離 ( 細胞蛋白 ) 化膿性髄膜炎真菌性髄膜炎結核性髄膜炎悪性腫瘍亜急性硬化性全脳炎神経 Behcet 病多発性硬化症家族性アミロイドニューロパチー糖尿病性ニューロパチー Guillain Barre 症候群 Fisher 症候群 Charcot Marie Tooth 病 Dejerine Sottas 病アルコール性神経炎髄液検査 SOP 2

3 Ⅱ. 細胞数の算定 ( 準備するもの ) 髄液細胞の検索は髄膜炎, 脳炎をはじめとする各種中枢神経系感染症の診断ならびに治療効果を推定するうえで最も重要とされますそれだけに高い精度が要求され使用する器具, 手技には細心の注意が必要です 1. エッペンドルフ 200μl( 青色 ) 20μl( 黄色 ) メランジュール法は実際量以上の髄液が必要でサムソン液の逆流による失敗の可能性や吸い口を介して起こる感染の危険性などの問題から使用すべきではありませんマイクロピペット容量はメランジュール法をそのまま置き換えれば髄液 : サムソン液 =180:20 ですがそれが 200:20 であっても臨床的に問題となるような誤差は生じません 2. 計算板ディスポーザブル C-Cip( フィンガルリンク社 ) または Fuchs-Rosenthal 計算板 Fuchs-Rosenthal 計算板には丸型カバーガラスが必要です使用の際にはカバーガラスの両端を持ち強くこすりつけるようにニュートンリングを作り使用しましょう 3. サムソン (Samson) 液成分 : 酸性フクシン酢酸サムソン液はもっとも一般的な希釈染色液であり他の希釈液 (Pappenheim 液など ) に比較し短時間で安定した染色結果を得ることができ高濃度の酢酸を含むため髄液に混在した赤血球の融解能力も高いとされていますサムソン液は密栓のできる容器で保存し染色性が劣化する前に定期的 (1 年ごと ) に更新ましょう髄液検査 SOP 3

4 4. サンプルカップまたは試験管当院ではプラスチックのサンプルカップを使用します試験管を使う場合ガラス製はプラスチックと比較すると荷電陽イオンが生じやすく細胞表面は陰イオンに荷電しているため管壁に細胞が付着しやすいのでプラスチックのものを使用しましょう髄液検査 SOP 4

5 Ⅲ. 細胞数の算定 ( 操作方法 ) 1. 肉眼的観察正常の髄液は無色透明であり混濁や着色は病的変化の可能性がある検査を開始する前に肉眼観察を加えることで出血の有無や細胞の増多の程度を推定できます ( 表 2) 細胞の微細粒子 ( 日光微塵 ) の観察は髄液の入ったスピッツを光にかざしながら軽く振って行います血性髄液の場合は化学的検査における遠心分離の際に上清のキサントクロミーの有無を確認しましょう 2. 希釈サンプルカップにエッペンドルフ 200μl( 青色 ) でリコールエッペンドルフ 20μl( 黄色 ) でサムソン液を混和し 3~5 分間静かに置く細胞数が著しく増加した髄液ではあらかじめ髄液を生理食塩水で適度に希釈するのがよいでしょう細胞数が 5 桁になるような例 ( 細菌性髄膜炎 ) では計算盤上に好中球どうしが重なり合ったり集塊を形成したりして算定困難となりますこの場合肉眼的に髄液の白濁が薄らぐまで生理食塩水で希釈する 10, 20, 40 の倍々希釈法が簡便です髄液に多数の赤血球が含まれると白血球の核の染色性が低下し細胞算定の障害となりますこの場合髄液とサムソン液を混合後サンプルカップ ( 試験管 ) のまましばらく放置することで赤血球の融解が促進されるとともに核の染まりがよくなります 3. 計算板にサンプルを注入し 1 分静かに置く C-Cip は 1 枚で 2 検体に使用できます髄液検査 SOP 5

6 サンプル注入口は計算板の左右外側にあるのでそこからあふれ出さないようにゆっくり注入します 4. 計算板の升目の全視野の細胞数を算定する計算板の大きさは 4mm 4mm 深さは 0.2mm サンプル量は 0.2μl 白血球のみを算定の対象とする単核球 : リンパ球単球組織球多核球 : 好中球好酸球髄液細胞検査の第一の目的は髄膜炎, 脳炎の推定 ( とくに細菌性か否か ) ですこれらの指標となるのは白血球の数と種類です白血球以外に臨床的意義のある細胞を認めた場合は別途報告しましょう作業効率を良くするために鏡検倍率は 200 倍 ( 対物レンズ 20 倍接眼レンズ 10 倍 ) を使用するのがよいでしょう 200 倍では 1 視野にフックスローゼンタール計算盤の最小区画が 4 区画入り効率良く細胞算定と分類を同時に行うことができます ( 図 2) 結果値は整数とし単位は細胞数表示の国際標準単位である /μlを用いる /3mm 3 はあくまでもフックスローゼンタール計算盤もつ特性に合せた単位にすぎません最小値は 1 とし算定した数値が 1 に満たない場合は 1/μl 以下と表現しましょう髄液細胞数の参考基準値は 5 /μl 以下ですしかし乳児では基準値の上限が 20 /μl, 新生児では 25 /μl と通常に比較して高いので注意しましょう髄液検査 SOP 6

7 計算盤上の各白血球形態 1 単核球 a. リンパ球白血球の中で最も小型で核はほぼ円形細胞質は狭く核周囲にリング状にみられるリンパ球の増加は一般にウイルス感染症ならびに慢性炎症を示す b. 単球大きさはリンパ球の 1.5 ~2 倍でサムソン液によく染まる細胞質を有する偏在する核は類円形で切れ込みをもつものが多い単球は髄膜の炎症や頭蓋内出血など髄膜へのある種の刺激に対し反応性に出現する c. 組織球組織球は髄液に出現する白血球の中で最も大型だが核は一般に小さく N/C 比は低い単球と同一起源の細胞でありその出現機序や細胞形態も単球に似る細胞質は泡沫状で淡い桃色を呈し変性空胞を認めることもある小型核は偏在しときに多核のものも認めるくも膜下出血や脳室内出血などでは組織球の細胞質内に赤血球片やヘモジデリン顆粒の貪食を認めることも多くこれは髄液腔内出血を反映する有用な所見である 2 多核球 a. 好中球好中球の細胞質はサムソン液に染まらず偽足をもったような不整形を示すものが多い分葉した核が重なり合いボ? ル状にみえ核の形状のみでは単核球と区別できない場合が少なくないしかし細胞質の形状と染色性に留意すればリンパ球や単球との鑑別は容易に行なえる好中球の増加は細菌感染症ならびに急性炎症を示す b. 好酸球好酸球は寄生虫性髄膜炎やアレルギー反応で著明に増加することがありこの場合とくに好酸球性髄膜炎とも呼ばれる好酸球は好中球に比較してより円形のものが多く注意深く観察すると細胞質内が輝くような淡いオレンジ色を呈し典型的なものはメガネ状 2 核を示すしかし計算盤状では積極的な分類は避けギムザ系染色を施し確認する c. 好塩基球好塩基球は好酸球とともに少数出現したり髄膜炎回復期に数 % の割合で認めることがあるがサムソン染色の認識はできない計算盤上では好中球, 好酸球とともに多核球として分類する髄液検査 SOP 7

8 Ⅳ. リコール蛋白測定 1. 使用する機器 QUICK RUN ( 和光純薬工業 ) 承認番号 27B3X を使用する 2. 機器立ち上げ時の点検始業点検票に従い機器のチェックを行う 3. 操作方法 1)FOBT/U-TP のボタンを操作し U-TP を選択する 2) 検体をサンプルカップに分注する検体 ( リコール ) はディスポーザブルスポイドで 4 滴コントロール ( 蛋白標準液 ) は 3 滴 3) 検体の装置へのセッティング検体ポジション1 : 検体検体ポジション2 : 蛋白標準液 4) エッペンドルフチップのセッティング検体がセットされたポジションにあわせてエッペンドルフ黄チップをセッティングする 5) 試薬のセッティング TP AR/QR 発色試液 ( 和光純薬工業 ) を試薬ポジションにセッティングする 6) スタートボタンを押す髄液検査 SOP 8

9 4. 測定値の入力得られた測定値はその順番を間違わないようにLACSへ入力する検査結果入力でワークシート : 空欄受付日 : 当日検体番号 : 検体を確認して入力測定値は整数で入力すること標準液の値は点検票に記載すること 90~110mg/dl の範囲を超える場合はキャリブレーションを行った後再測定すること 5. 終了点検測定が終了したら点検票に従い装置を終了させること髄液検査 SOP 9

10 Ⅴ. 化学的検査法現在髄液検査で実施されている化学検査には一般的な蛋白, 糖の測定をはじめ各種の酵素やいくつかの古典的な化学検査などがあるが項目選択に際し重視すべきはそれらが臨床的意義を有し緊急検査の現場で迅速かつ簡単に正確性をもって測定できる項目であるかどうかという点である 1. 蛋白通常血清蛋白の 0.2~0.6% が髄液に移行するしたがって腰椎穿刺髄液の蛋白量は健常成人で 15~45mg/dl で A/G 比も 1.5~2.3 と血清値とほぼ同じである髄液蛋白はあらゆる中枢神経疾患で上昇し一般的に 50mg/dl 以上であれば病的増加と考えられるとくに細菌性髄膜炎, 結核性髄膜炎, 真菌性髄膜炎の憎悪期, ギランバレー (Guillain-Barre ) 症候群などで高値を示すこれは血液脳関門が破壊され多くの蛋白が血中より髄液に移行するためである髄液蛋白の検出法としてはピロガロールレッド法, スルホサリチル酸法などがあり分光高度計や自動分析装置を用いて測定する一方多発性硬化症や脳炎では中枢神経系で産生された免疫グロブリンにより髄液蛋白が増加するため髄液蛋白の測定よりもむしろ A/G 比や IgG の検索が重要となるとくに多発性硬化症ではオリゴクローナルバンド (oligoclonal band) やミエリン塩基性蛋白 (myelin basic protein) の証明が診断に有効とされている 2. 糖髄液糖は血糖値の 60~80% に維持されており血糖値が正常であれば髄液糖は 50~ 80mg/dl を示すがその値はあくまでも血糖値に左右される髄液糖の評価に際しては常に血糖値を参考にし対比する必要がある髄液糖が低下を示す代表的な疾患として細菌性髄膜炎, 結核性髄膜炎, 真菌性髄膜炎, 悪性腫瘍の髄膜浸潤などがあげられこれは髄液腔で増加した病原微生物や好中球による嫌気性解糖作用あるいは血液脳関門の破壊による糖移送能障害が原因とされている測定には電極法 ( グルコース専用分析装置 ) や酵素法 ( 汎用生化学自動分析装置 ) を用いる 3.LD 髄液中の LD(lactate dehydrogenase) は細菌性髄膜炎で優位に上昇しさらに予後推定や治療効果の判定に役立つことから臨床的に意義のある髄液マーカーとされている正常髄液やウイルス性髄膜炎の LD アイソザイムでは LD4, LD5 はほとんど認められず LD1, LD2, LD3>LD4, LD5 のパターンを示す一方細菌性髄膜炎では著しく増加した好中球由来の LD4, LD5 が上昇し LD1, LD2, LD3<LD4, LD5 となりそのため LD 値が高くなるしかしウイルス性髄膜炎であっても髄液中にリンパ球が著明増加した例ではリンパ球由来の LD2, LD3 が上昇し髄液 LD が上昇を示すことがあるので注意するまた中枢神経組織の破壊が生じた場合は組織由来の LD1,LD2 が上昇する髄液 LD の基準値は JSCC 法で 25U/l 以下であり測定は血清 LD と同様に汎用生化学自動分析装置で行う髄液検査 SOP 10

11 4.CK 髄液中の CK(creatine kinase) は血中のそれとは独立して変動し髄液蛋白量の影響もほとんど受けない CK には骨格筋由来の CK-MM, 心筋由来の CK-MB, 脳由来の CK-BB があるが髄液中で検出されるのはほとんどが CK-BB である髄液中の CK 基準値は 6U/l 以下で髄液中の CK が上昇する疾患には脳挫傷, 髄膜脳炎, 脳腫瘍, 脳血管障害, 多発性硬化症などがあげられその上昇は脳組織の荒廃に由来すると考えられるまた髄膜炎症例において重症例では細菌性, ウイルス性を問わず髄液 CK の上昇を示すのに対し軽症例では上昇せず予後推定に有用であるとの報告も認める髄液 CK の測定は髄液 LD と同様で汎用生化学自動分析装置を用いる 5. 測定意義に乏しい化学的検査 1)Cl( クロール ) 髄液中の Cl は血中 Cl に由来し血中より 15~20mEq/l 高値を示すこの差は Donnan( の膜 ) 平衡ならびに髄液と血液間に存在する電位差により生じるとされ髄液 Cl 値は血中 Cl 値の変動に従い増減する髄液中の蛋白が上昇するとの Donnan 平衡に抵抗が加わりそのぶん髄液 Cl は低下するたとえば細菌性髄膜炎など髄液蛋白が著明に増加する例ではおのずと髄液 Cl は減少するかつて結核性髄膜炎で髄液 Cl が特異的に低下するとの報告がなされたことがあるがのちにこれは結核性髄膜炎に生じる低クロール血症が原因であることが明らかにされたしたがって血中 Cl 値の把握と正確な髄液蛋白の測定がなされていればあえて髄液 Cl を測定する必要はないということになる 2) ノンネアぺルト (Nonne-Apelt) 反応, パンディー (Pandy) 反応当院では中止ノンネアぺルト反応は 1908 年にパンディー反応は 1910 年に報告された本反応は髄液のグロブリン検出試験として理解されている向きにあるがいずれも真のグロブリン反応ではなく古典的な髄液蛋白の半定量法として認識すべきである正確な蛋白定量が可能となりさらには免疫グロブリンなどの詳細な検索が日常となった現在これらの検査法を実施する臨床的意義はほとんどない 3) トリプトファン (tryptophan) 反応当院では中止本反応は結核性髄膜炎の髄液中にトリプトファンが存在することが報告されて以来 (Aiello, 1927) 結核性髄膜炎の補助的診断法として応用されてきたわが国ではホルムアルデヒドを用いボアズネー (Voisenet) 反応を基本にした里見変法が知られているが本法の反応機序はいまだ明らかではなく結核性以外の各種髄膜炎やキサントクロミー髄液でも陽性を示すことがありときに臨床の誤解を招く危険があるさらに貴重な髄液材料を一度に 1ml も使用することにも問題がある結核菌検出のための迅速培養法や PCR(polymelase chain reaction) 法,MTD(micobacterium tuberculosis direct test) 法など高精度検査法が確立されつつある現在過去の慣習のみで根拠に乏しい検査を持続することには大きな問題がある髄液検査 SOP 11

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<4D F736F F F696E74202D B95A C993A C C815B B8CDD8AB B83685D> 平成 25 年度新人サポート研修会 Ⅱ 一般検査部門 JA 愛知厚生連江南厚生病院臨床検査技術科伊藤康生髄液の産生と循環多くは脈絡叢で産生約 1000~1500mL/day 成人の髄液量は約 150ml 髄液検査の意義 1 中枢神経感染症 ( 髄膜炎脳炎 ) の診断と経過観察くも膜下出血多発性硬化症脳ヘルニア脊髄疾患ギランバレー症候群ベーチェット症候群サルコイドーシス脳腫瘍髄膜白血病転移性腫瘍