イシガミ石神アキヒト昭人略歴 1990 年東邦大学薬学部大学院薬学博士大日本インキ化学工業株式会社総合研究所研究員 1992 年米国国立衛生研究所 (NIH) 米国国立老化研究所 (NIA) 客員研究員 1994 年東京都老人総合研究所細胞化学部門研究員 2005 年東京都老人総合研究所老化制御

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みいかきせんばる
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1 イシガミ石神アキヒト昭人略歴 1990 年東邦大学薬学部大学院薬学博士大日本インキ化学工業株式会社総合研究所研究員 1992 年米国国立衛生研究所 (NIH) 米国国立老化研究所 (NIA) 客員研究員 1994 年東京都老人総合研究所細胞化学部門研究員 2005 年東京都老人総合研究所老化制御リーダー主任研究員 2008 年東邦大学薬学部生化学准教授現在に至るビタミン C と老化機能性食品評価系の確立 Establishment of functional food evaluation which used vitamin C insufficient mice. An appropriate evaluation system that correctly evaluates effectiveness and safety of the functional food and supplement has not been established yet. Most of the functional food and the supplement being marketed now has 'Anti-oxidation ability' as the effect. To evaluate the effect of the functional food and supplement, we used SMP30/GNL knockout mice that can not synthesize vitamin C and real-time biography, a newly developed photonic imaging system, with the chemilumigenic probe, Lucigenin, to detect superoxide anion radicals. Superoxide-dependent chemiluminescence levels determined by ischemia-reperfusion were 3.0-fold higher in vitamin C depleted SMP30/GNL knockout mice than in vitamin C supplemented SMP30/GNL knockout mice. However, total superoxide dismutase activity and protein levels were not altered. Thus, vitamin C depletion specifically increased superoxide generation in the brain. Moreover, administration of hydrogen-rich pure water created a pronounced decrease of superoxide formation in the brain. Hydrogen-rich pure water acts as an anti-oxidant in the brain and prevents superoxide formation. Collectively, it has been understood that the SMP30/GNL knockout mice that cannot synthesize vitamin C by this research is practical and is possible as the human model animal that is correctly appreciable of effectiveness and the safety of the functional food and supplement with 'Anti-oxidation ability'. 1

2 はじめに機能性食品サプリメントの有効性や安全性を正しく評価する適切な評価系は未だ確立されていない現在市販されている機能性食品サプリメントのほとんどはその効能として抗酸化能力を持っている私たちはビタミン Cを合成できない遺伝子破壊マウス (SMP30/GNL 遺伝子破壊マウス ) を開発しこのマウスをビタミン Cの少ないエサ ( マウスが 1 日に必要とするビタミン C 量のわずか2.5%) で飼育したところ普通のマウスより寿命が 1/4 に短縮することを突き止めた 1 3) ヒトは体内でビタミン Cを合成できないしかしマウスは体内でビタミン Cを合成できる私たちが開発したビタミン Cを合成できないマウスは限りなくヒトに近いヒトモデル動物であるこのマウスは抗酸化能力を持つ機能性食品サプリメントの有効性や安全性を正しく評価できるヒトモデル動物として利用価値が高い本研究ではビタミン C 不足マウスを用いた抗酸化能力を持つ機能性食品サプリメントの評価系が有効であることを確認立証するため水素 (H2) ガスを高濃度に溶解した水素水を代表例としその効果を検証する即ち水素 (H2) を飽和状態 ( 0.6 mm) まで溶かした水素水 ( 高濃度水素溶解精製水 ) の飲用が脳での活性酸素の発生を抑制できるかをビタミン C 不足マウス及びリアルタイムに脳での活性酸素の量を測定できる装置 ( リアルタイムバイオグラフィー装置 ) を用いて比較検討した水素 (H2) ガスは神経細胞から生ずる活性酸素特に毒性の強い活性酸素であるヒドロキシラジカルの発生を抑制または減少させることが報告されている 4 6) 実験方法 1. ビタミン C 合成不全マウス ( SMP30/GNL 遺伝子破壊マウス ) 加齢指標タンパク質 30(SMP30) はラット肝臓より同定された加齢で減少するタンパク質である 7,8) 最近私たちは SMP30がビタミン C 合成経路の重要な酵素であるグルコノラクトナーゼ ( GNL) であること SMP30/GNL 遺伝子を破壊したマウスは体内でビタミン Cを合成できないことを報告した 1,3) 即ち SMP30/GNL 遺伝子破壊マウスは体内でビタミン Cを合成できないヒトに極めて類似したヒトモデル動物であるビタミン Cの不足が脳での活性酸素を増加させるか明らかにするため SMP30/GNL 遺伝子破壊マウスを生後 30 日で離乳後ビタミン Cを全く含まない餌や飲み水を与えて 4 週間飼育したまた水素 ( H2) ガスを飽和状態 ( 0.6 mm) まで溶かした水素水の飲用がビタミン C 不足による脳での活性酸素の増加を抑制できるか調べるため SMP30/GNL 遺伝子破壊マウスを生後 30 日で離乳後 1 水素 ( H2) ガスを飽和状態 ( 0.6 mm) まで溶かした水素水 ( 高濃度水素溶解精製水 ) を与えた群 2 充分なビタミン Cを与えた群 3 水のみを与えた群の 3 群に分け 1 ヶ月間飼育した水素は揮発性が高いため飲料水の交換は1 日 2 回行った 2. リアルタイムバイオグラフィー法活性酸素は反応性が高いため生体内で直接その量を測定することは難しいそのため生体成分の酸化程度を知るためにはカルボニル化タンパク質を指標とする酸化タンパク質チオバル 2

ビツール酸法による過酸化脂質 8-ヒドロキシ -デオキシグアノシン (8-OHdG) を指標とする DNAの酸化修飾などが測定されるしかしこれらの方法は最終酸化生成物を測定するものであり生体内の活性酸素の量を測定するものではない現在活性酸素を直接に測定するためには電子スピン共鳴 ( ESR; Electron Paramagnetic Resonance) 測定装置が用いられるしかし

3 ビツール酸法による過酸化脂質 8-ヒドロキシ -デオキシグアノシン (8-OHdG) を指標とする DNAの酸化修飾などが測定されるしかしこれらの方法は最終酸化生成物を測定するものであり生体内の活性酸素の量を測定するものではない現在活性酸素を直接に測定するためには電子スピン共鳴 ( ESR; Electron Paramagnetic Resonance) 測定装置が用いられるしかしこの装置を用いてリアルタイムに生体内で発生する活性酸素を測定することは現時点では不可能であるこれらの問題を克服するため東京都老人総合研究所の佐々木らは脳スライスを用いた脳での活性酸素の発生をリアルタイムに捉える装置 ( リアルタイムバイオグラフィー装置 ) を開発した 9) 脳での活性酸素の検出にはスーパーオキシドアニオンラジカル - (O2 ) に特異的に反応する化学発光試薬であるルシゲニン ( Lucigenin) を用いたルシゲニンの化学発光量は高感度 CCDカメラでリアルタイムに撮影を行い 15 分ごとの積算画像を数値化し定量したこの装置を用いることにより生体に近い状態で脳の活性酸素を測定することが可能である結果と考察 1. ビタミン C 不足による脳の活性酸素の増加ビタミン Cの不足が脳での活性酸素を増加させるか調べるためビタミン Cを体内で合成できない SMP30/GNL 遺伝子破壊マウスとリアルタイムバイオグラフィー装置を用いて実験を行ったその結果脳の活性酸素量はビタミン Cを充分に与えた群に比べてビタミン Cを全く与えない群では定常状態でも有意に高く虚血再灌流に似た窒素再酸素により約 3 倍も活性酸素が多く生じた ( 図 1) 10) この時脳のビタミン C 含量はビタミン Cを充分に与えた群に比べて 6% 以下であった一方抗酸化系にはたらくスーパーオキシドジスムターゼ (SOD) 活性や Mn-SOD Cu,Zn-SOD カタラーゼなどのタンパク質量に有意な差は見られなかった ( 図 2) 10) これらの結果はビタミン Cが不足し高い酸化ストレス状態にあっても脳の抗酸化防御システムはそれに対応できず非常に脆弱であることを示しているそのため脳の酸化ストレスが少しでも高まると神経細胞死が誘導されてしまうと考えられる図 1 ビタミン C 不足による脳の活性酸素の増加 10) SMP30/GNL 遺伝子破壊マウス (KO) 及び野生型マウス (WT) を生後 30 日で離乳後ビタミン C 水 (1.5 g/l) を与えた群 (VC(+)) と水のみを与えた群 ( V C( )) に分けて 4 週間飼育した ( A ) リアルタイムバイオグラフィー装置を用いて脳の活性酸素を測定活性酸素の検出にはスーパーオキシドアニオンラジカル (O2 - ) に特異的に反応する化学発光試薬であるルシゲニンを用いた化学発光量は高感度 CCD カメラでリアルタイムに撮影を行い 15 分ごとの積算画像を数値化した (B) 分の再酸素による総活性酸素量を測定値は平均 ± 標準誤差 (5 匹 ) *p < 0.01 as compared to VC(+)SMP30/GNL KO, VC( )WT and VC(+)W T. 3

図 2 ビタミン C 不足による脳の抗酸化系への影響 10) SMP30/GNL 遺伝子破壊マウス (KO) 及び野生型マウス (WT) を生後 30 日で離乳後ビタミン C 水を与えた群 (+) と水のみを与えた群 ( ) に分けて 4 週間飼育した SOD 活性や Mn-SOD Cu,Zn-SOD カタラーゼなどのタンパク質量に有意な差は見られなかった 2.

4 図 2 ビタミン C 不足による脳の抗酸化系への影響 10) SMP30/GNL 遺伝子破壊マウス (KO) 及び野生型マウス (WT) を生後 30 日で離乳後ビタミン C 水を与えた群 (+) と水のみを与えた群 ( ) に分けて 4 週間飼育した SOD 活性や Mn-SOD Cu,Zn-SOD カタラーゼなどのタンパク質量に有意な差は見られなかった 2. 水素水の飲用は脳の活性酸素を減少水素 ( H2) ガスの吸引は一時的に血流が止まる虚血再灌流により発生する活性酸素の生成を抑制することが報告されている 4 6) しかし水素ガスを日常的に吸引することは難しいそのため水素 ( H2) ガスを飽和状態 ( 0.6 mm) まで溶かした水素水の飲用がビタミン C 不足による脳での活性酸素の増加を抑制できるか調べたその結果水素水投与群は水投与群に比べて窒素再酸素により生ずる活性酸素の量が27% も減少した ( 図 3) 11) この時水素水及び水投与群の脳でのビタミン C 含量は両群ともビタミン C 投与群に比べて6% 以下であったこのように活性酸素のひとつであるスーパーオキシドアニオンラジカルをリアルタイムに測定できるリアルタイムバイオグラフィー装置を用いて水素水の飲用が脳での活性酸素の増加を抑制することを明らかにした通常水素は毒性の強い活性酸素であるヒドロキシラジカルを消去するしかし本研究から水素は生体内で過剰な活性酸素が発生するような条件下ではヒドロキシラジカル及びスー 4

図 3 水素水の飲用は脳の活性酸素を減少 11) SMP30/GNL 遺伝子破壊マウスを生後 30 日で離乳後水素水を与えた群 ( 水素水 ) ビタミン C 水を与えた群 ( ビタミン C) 水のみを与えた群 ( 水 ) の 3 群に分けて 1 ヶ月間飼育した (A) リアルタイムバイオグラフィー装置を用いて脳の活性酸素を測定化学発光量は 15 分ごとの積算画像を数値化した (B)135

5 図 3 水素水の飲用は脳の活性酸素を減少 11) SMP30/GNL 遺伝子破壊マウスを生後 30 日で離乳後水素水を与えた群 ( 水素水 ) ビタミン C 水を与えた群 ( ビタミン C) 水のみを与えた群 ( 水 ) の 3 群に分けて 1 ヶ月間飼育した (A) リアルタイムバイオグラフィー装置を用いて脳の活性酸素を測定化学発光量は 15 分ごとの積算画像を数値化した (B) 分の再酸素による総活性酸素量を測定水素水投与群の化学発光量は水投与群に比べて 27% も減少していた値は平均 ± 標準誤差 (10 匹 ) *p<0.01 and **p<0.05 as compared to the vitamin C group. p<0.01 and p<0.05 as compared to the H2O group. パーオキシドアニオンラジカルの両方を直接的或いは間接的に消去する可能性が考えられるまた水素はミトコンドリア膜を容易に透過できるためミトコンドリア内でのスーパーオキシドアニオンラジカルの生成を直接的或いは間接的に抑制する可能性も考えられる今回の研究成果により水素 (H2) ガスを飽和状態 ( 0.6 mm) まで溶かした水素水の飲用は生体内で過剰なスーパーオキシドアニオンラジカルの発生を抑制することが明らかになった水素水は酷い酸化ストレスがかかる条件下で有効な抗酸化物質であると考えられるまとめ本研究により私たちが開発したビタミン Cを合成できない SMP30/GNL 遺伝子破壊マウスは抗酸化能力を持つ機能性食品サプリメントの有効性や安全性を正しく評価できるヒトモデル動物として実用可能であることが分かったまた水素水の飲用がビタミン C 不足による脳での活性酸素の増加を抑制することも明らかになった本研究から水素ガスは吸引だけではなく飲用によっても脳での活性酸素の増加を抑制できることが分かった活性酸素は糖尿病動脈硬化などの生活習慣病やアルツハイマー病などの神経変性疾患そして老化の一因であると考えられている水素水はこれら疾患や老化を予防する手軽に飲用できる水としてその効果がとても期待されるなお本研究は現在市販されている水素を含有する特定の健康飲料水や健康サプリメントの効果を実証するものでは無い純粋に科学的に水素 (H2) ガスを飽和状態まで溶かした水素水が脳での活性酸素の増加を抑制することを調べた研究成果である謝辞本研究を遂行するにあたり研究助成を賜りました財団法人アサヒビール学術振興財団に深く感謝いたします 5

6 参考文献 1) 石神昭人 : ビタミン Cの不足が老化に及ぼす影響. ビタミン 81: , ) Ishigami A, Kondo Y, Nanba R, Ohsawa T, Handa S, Kubo S, Akita M and Maruyama N: SMP30 deficiency in mice causes an accumulation of neutral lipids and phospholipids in the liver and shortens the life span. Biochem Biophys Res Commun 315: , ) Kondo Y, Inai Y, Sato Y, Handa S, Kubo S, Shimokado K, Goto S, Nishikimi M, Maruyama N and Ishigami A: Senescence marker protein 30 functions as gluconolactonase in L-ascorbic acid biosynthesis, and its knockout mice are prone to scurvy. Proc Natl Acad Sci U S A 103: , ) Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, Watanabe M, Nishimaki K, Yamagata K, Katsura K, Katayama Y, Asoh S and Ohta S: Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals. Nat Med 13: , ) Cai J, Kang Z, Liu WW, Luo X, Qiang S, Zhang JH, Ohta S, Sun X, Xu W, Tao H and Li R: Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Neurosci Lett 441: , ) Hayashida K, Sano M, Ohsawa I, Shinmura K, Tamaki K, Kimura K, Endo J, Katayama T, Kawamura A, Kohsaka S, Makino S, Ohta S, Ogawa S and Fukuda K: Inhalation of hydrogen gas reduces infarct size in the rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Biochem Biophys Res Commun 373:30-35, ) 石神昭人丸山直記 : SMP30 ノックアウトマウス - 新しい老化モデルマウスとしての可能性 -. 基礎老化研究 27:35-40, ) Ishigami A and Maruyama N: Significance of SMP30 in gerontology. Geriatrics & Gerontology International 7: , ) Sasaki T, Iwamoto A, Tsuboi H and Watanabe Y: Development of real-time bioradiographic system for functional and metabolic imaging in living brain tissue. Brain Res 1077: , )Kondo Y, Sasaki T, Sato Y, Amano A, Aizawa S, Iwama M, Handa S, Shimada N, Fukuda M, Akita M, Lee J, Jeong KS, Maruyama N and Ishigami A: Vitamin C depletion increases superoxide generation in brains of SMP30/GNL knockout mice. Biochem Biophys Res Commun 377: , )Sato Y, Kajiyama S, Amano A, Kondo Y, Sasaki T, Handa S, Takahashi R, Fukui M, Hasegawa G, Nakamura N, Fujinawa H, Mori T, Ohta M, Obayashi H, Maruyama N and Ishigami A: Hydrogen-rich pure water prevents superoxide formation in brain slices of vitamin C-depleted SMP30/GNL knockout mice. Biochem Biophys Res Commun 375: ,

研究成果の概要ビタミンCを体内で合成できない遺伝子破壊マウス (SMP30/GNL 遺伝子破壊マウス ) に1 水素 (H2) ガスを飽和状態 (0.6 mm) まで溶かした水素水 ( 高濃度水素溶解精製水 ) を与えた群 2 充分なビタミンCを与えた群 3 水のみを与えた群の 3 群に分け 1 ヶ

研究成果の概要ビタミンCを体内で合成できない遺伝子破壊マウス (SMP30/GNL 遺伝子破壊マウス ) に1 水素 (H2) ガスを飽和状態 (0.6 mm) まで溶かした水素水 ( 高濃度水素溶解精製水 ) を与えた群 2 充分なビタミンCを与えた群 3 水のみを与えた群の 3 群に分け 1 ヶ研究詳細水素 (H 2 ) を高濃度に溶解した水素水の飲用は脳での活性酸素の増加を抑制するポイントヒトやサルモルモットは体内でビタミンCを合成できないしかしマウスをはじめ犬猫鳥など多くの動物は自らの体内でビタミンCを合成できる私たちはビタミンCを体内で合成できない遺伝子破壊マウス (SMP30/GNL 遺伝子破壊マウス ) を作成しビタミンCの不足が脳での活性酸素を増加させることをリアルタイムに脳での活性酸素量を測定する装置を用いて初めて明らかにした