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1 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED. 11 三次元組織を構築するための 足場材料とその培養システム 明治大学理工学部 応用化学科 教授相澤守

2 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED. 22 本説明会で紹介したい技術の概要 : 三次元組織を構築するための足場材料とその培養システム 臨床的に使用可能な 大きさ をもつ組織を再生させるためには? 1) 細胞が住みやすい空間を備えた足場材料 ( スキャフォルド ) 2) 三次元的な培養を可能にするシステム ( バイオリアクター ) 3) 細胞 ( 間葉系幹細胞 ips 細胞など ) 例 : 三次元再生培養骨の構築 < 三次元培養基材 > < 高密度循環培養 > out AFS(18 mmf, 15 mm) < 細胞 > in 循環経路 ラジアルフロー型バイオリアクター (RFB) 逆放射状で連続的な培地の循環 ラット骨髄間質細胞 (RBMC)

3 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED. 33 研究の背景 #1 第 4 期 ( 平成 23~27 年度 ) 科学技術基本計画 成長の柱としての2 大イノベーションの推進 1. 基本方針制約の克服と新たな成長産業の創成にむけて 環境 エネルギーと医療 介護 健康を対象とする科学技術イノベーションを戦略的に推進 2. グリーンイノベーションの推進 i) エネルギー供給の低炭素化 ii) エネルギー利用の効率化 スマート化 iii) 社会インフラのグリーン化 3. ライフイノベーションの推進 i) 革新的な予防法の開発 ii) 新しい早期診断法の開発 iii) 安全で有効性の高い治療の実現 iv) 高齢者 障害者 患者の生活の質 (QOL) の向上 組織工学 ( 再生医学 ) の実現!

4 研究の背景 #2 * 組織工学における重要な三要素 スキャフォルド 成長因子 ( 骨形成タンパク質など ) 細胞 (ips 細胞など ) 目的とする組織を再生! ( 骨 軟骨 肝 神経など ) 本研究 健康寿命の延伸! 高い QOL の実現! 体の部位など 網膜色素上皮細胞 赤血球 骨 軟骨 骨格筋 肝細胞 肺や腎臓などの立体臓器作製技術 腎臓細胞 * 再生医療研究の工程表 開始時期 年 2017 年以降 2019 年以降 2021 年末までに確立 2022 年以降 ( 出典 ; 日経産業新聞 2012 年 11 月 8 日 ) 現在の組織再生の課題 ( 細胞塊をホストに埋入して組織化させる 借り腹 を利用 ) In vitro 系で立体臓器 ( 三次元組織 ) を構築するためのプロセスの確立 図 2 我が国の老年人口の推移予測 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED. 4 4

5 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED. 55 本研究の目的 三次元組織を構築するための足場材料とその培養技術の確立 アパタイトファイバー により構築されたス キャフォルドの骨格 ( ファイバーの絡み合いによりミクロ気孔が 形成されている ) 100 m アパタイトファイバース キャフォルドのマクロ気孔 ( 細胞が進入可能な 大きさの気孔をもち そ れらのマクロ気孔が連 結している ) 図 1 アパタイトファイバースキャフォルドの電子顕微鏡写真 < 高密度循環培養 > 三次元組織を構築するための培養システム 1) AFS 2) RFB 3) 細胞 out in 循環経路 ラジアルフロー型バイオリアクター (RFB) 逆放射状で連続的な培地の循環 三次元培養可能なアパタイトファイバースキャフォルド (AFS) < 三次元培養基材 > AFS(18 mmf, 15 mm) < 細胞 > ラット骨髄間質細胞 (RBMC) 将来展望 :RBMC ips へ ( 骨以外の三次元組織の構築 )

6 新技術の内容 #1: アパタイトファイバースキャフォルド (AFS) 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED. 66

7 新技術の内容 #2: アパタイトファイバースキャフォルド (AFS) 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED. 77

8 新技術の内容 #3: ラジアルフロー型バイオリアクター (RFB) 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED. 88

9 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED. 99 新技術の内容 #4: AFS + RFB + RBMC 骨再生 二次培養 (0 w, 1 w, 2 w) AFS mmf 18 mm 気孔率 ~98% 骨髄間質細胞 初代培養 (16 日 ) cells 通常培地 分化誘導培地通常培地 + a-mem 三次培養 (0 w, 1 w, 2 w) 10% FBS 100 U cm -3 penicillin 100 g cm -3 streptomycin 10 nmol dm -3 デキサメタゾン 1 mmol dm -3 b- グリセロリン酸ナトリウム 200 mmol dm -3 L(+)- アスコルビン酸 グルコース量 乳酸値をモニタリング グルコース量 乳酸値 ラジアルフロー型バイオリアクター

10 総グルコース消費量 / mmol 総乳酸産生量 / mmol 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 新技術の内容 #5: AFS + RFB + RBMC 骨再生 培養時における総グルコース消費量, 総乳酸産生量 w-0w 2w-1w 2w-2w 1w-0w 1w-1w 1w-2w 0w-1w 0w-2w 培養日数 / day w-0w 2w-1w 2w-2w 1w-0w 1w-1w 1w-2w 0w-1w 0w-2w 培養日数 / day RFB によるラット骨髄間質細胞の高密度循環培養が実施できた

11 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 新技術の内容 #6: AFS + RFB + RBMC 骨再生 再生培養骨の構築 ~ 培養後の処理 ~ 培養終了 RFB からスキャフォルドを回収 1/4 に切断 4 PBS で洗浄スキャフォルドを図のように 1/4 に切断 上から見た図 1/4 3/4 10 mass% グルタルアルデヒドで固定 (4 ºC, 1 h) PBSで洗浄 HEPESを3 cm 3 加えて 遠心分離する (1,000 r.p.m, 5 min) 3 回 0.1 mass% ゼラチン溶液に浸漬 (1 h) 吸引減圧 (1 h) HEPES を 1 cm 3 加えて -80 ºC で保存 O. C. T compound で包埋 -20 ºC で静置 (overnight) -80 ºC で保存 凍結切片の作製 DNA 量測定 アルカリホスファターゼ (ALP) 活性測定 オステオカルシン (OC) 産生量測定

12 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 新技術の内容 #7: AFS + RFB + RBMC 骨再生 HE 染色 アリザリンレッド染色 一連の培養条件において 足場材料の骨格に沿って細胞がより多く存在していることがわかった 1w-2w および 2w-2w の培養条件では 足場材料の気孔内部にまで細胞が侵入していることがわかった 三次培養の期間は長くなると 足場材料の骨格上で増殖 分化した細胞の石灰化が確認された

13 ALP 活性 / IU dm -3 gdna -1, 37 ºC 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED I-Col ALP OP BSP OC 新技術の内容 #8: AFS + RFB + RBMC 骨再生 培養後の AFS2000 の生化学的評価 (1): AFS 1 個あたりの ALP 活性 個 間葉系幹細胞 1 未分化前駆細胞 成熟前駆骨芽細胞 未熟骨芽細胞 前骨芽細胞 0.2 成熟骨芽細胞 0 0w-1w 0w-2w 1w-0w 1w-1w 1w-2w 2w-0w 2w-1w 2w-2w 休止骨芽細胞 骨細胞

14 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED I-Col ALP OP BSP OC 新技術の内容 #9: AFS + RFB + RBMC 骨再生 培養後の AFS2000 の生化学的評価 (2) : AFS 1 個あたりの OC 産生量 間葉系幹細胞 OC 産生量 / ng gdna OC 産生量 / ng gdna w-1w 0w-1w 1 個 0w-2w 0w-2w 1w-1w 1w-1w 1w-2w 1w-2w 2w-1w 2w-1w 2w-2w 2w-2w 分化レベルの異なる再生培養骨の構築に成功! 未分化前駆細胞 成熟前駆骨芽細胞 未熟骨芽細胞 前骨芽細胞 成熟骨芽細胞 休止骨芽細胞 骨細胞

15 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 新技術の内容 #10: AFS + RFB + 肝細胞など 肝再生 RFB に装填した AFS に 肝細胞 (IMH-4 ) 肝星細胞 (A7 ) 類洞内皮細胞 (M1 ) を播種し 共培養 17 日後 ヌードマウスの腎被膜下 :Kidney 大網 ( 腹膜下 ) :Omentum に移植 8 週後 AFS の取り出し IMH-4 : マウス不死化肝細胞 A7 : マウス不死化星細胞 M1: マウス不死化類洞内皮細胞 80 m 80 m 腎被膜下と大網において AFS を用いて構築されたオルガノイドは増殖生着していた また 両者において肝特異的な m-rna の発現も確認され 肝機能の一つであるアルブミンの発現も確認された AFS は 体内埋め込み型足場材料 として期待できる M.Saito et al., Artif. Organs,35, (2011 ).

16 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 新技術の内容 #11: AFS + RFB + 肝細胞など 肝再生 血管 再生肝オルガノイド ( ミニ肝臓 ) 肝細胞 類洞内皮細胞 AFS および RFB を用いた肝細胞 星細胞 類洞内皮細胞により構築した再生肝オルガノイドの概観と組織像 血管を含む肝再生オルガノイドの構築に成功!

17 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 従来技術とその問題点 再生医療( 組織工学 ) は 現在 各研究機関で積極的に研究が進められているが いまだ以下の点に課題が残されている 三次元組織( 立体臓器 ) の構築 血管を含む組織再生そのため 広く臨床応用されるまでには至っていない

18 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 新技術の特徴 従来技術との比較 従来技術の問題点であった 三次元組織の構築 に成功した 大きな再生組織を構築することは困難であったが 本技術を利用すると 例えば 直径 15 mm 高さ18 mm 程度の大きさをもつ 肝再生オルガノイド や 再生培養骨 を構築できる また この再生組織に 血管 を導入することも可能である

19 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 新技術の特徴 生体適合性を備えたアパタイトファイバーにより構築される足場材料 ( アパタイトファイバースキャフォルド ) 細胞の侵入を容易にする連通性の高い細孔構造を実現! 新規な足場材料と三次元循環培養を可能にするラジアルフロー型バイオリアクターとの併用による高密度循環培養の実現 三次元構造を備えた再生組織の構築 未分化間葉系幹細胞からの 骨再生 および血管を導入した 再生肝オルガノイド の構築に成功!

20 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 想定される用途 再生医療分野での三次元組織の構築に活用 ( 骨 肝で実績あり ) 基本的な培養技術は普遍であるため 上記以外の組織再生 ( 心筋 膵 軟骨ほか ) にも適用可能である 再生組織を 創薬スクリーニング に利用可能

21 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 実用化に向けた課題 現在 ラット骨髄由来の間葉系幹細胞で再生培養骨が構築できているが ヒト間葉系幹細胞では未着手の状態である ヒト細胞での再生培養骨の構築が今後の課題である 肝再生については 株化細胞による検討までとなっており 細胞ソースを再考する必要がある 今後 ips 細胞を本培養システムに適用して 高密度三次元循環培養を行ない 種々の組織を再生させるための実験条件の最適化が必要である

22 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 企業への期待 未解決の前記した課題については これまでの検討実績から克服できると考えている 立体臓器の構築を目指して 再生医療への展開を推進している企業との共同研究を希望 創薬スクリーニングへの応用も期待できるため 製薬会社との共同研究を希望 また 細胞培養システムを開発中の企業 再生医療分野への展開を考えている企業には 本技術の導入が有効と思われる

23 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED 本技術に関する知的財産権 特許 1 発明の名称 : バイオリアクター 出願番号/ 登録番号 : 特願 / 特許第 号 出 願 人 : 学校法人明治大学 発 明 者 : 相澤守 松浦知和 特許 2 発明の名称 : 繊維状リン酸カルシウム 出願番号/ 登録番号 : 特願 / 特許第 号 出 願 人 : 学校法人明治大学 宇部マテリアルズ株式会社 発 明 者 : 相澤守 特許 3 発明の名称 : 細胞の培養方法 出願番号/ 登録番号 : 特願 / 特許第 号 出 願 人 : 学校法人明治大学 宇部マテリアルズ株式会社 発 明 者 : 相澤守

24 2014 MEIJI UNIVERSITY. ALL RIGHTS RESERVED お問い合わせ先 明治大学研究推進部生田研究知財事務室コーディネーター今村孝 TEL FAX

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