Key words : enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) 0157 : H7, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), Shiga-like toxin, genotype, southern blottin

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1 Key words : enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) 0157 : H7, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), Shiga-like toxin, genotype, southern blotting

2 Table 1 Classification of EHEC 0157 by PFGE and Southern blotting of the stx genes No and No. 13 are EHEC 0157 : H7 isolated from sporadic cases. No. 1 is EHEC 0157 : H7, designated 92N, and No are EHEC 0157 : H7 isolated from the food-poisoning outbreak : No. 14, an adult carrier ; No. 17, a patient ; No. 18, a carrier, the mother of No. 17. No. 12 and No. 19 are EHEC 0157 : NM. aexistence of the stx genes was confirmed by PCR. b No positive signal was observed. 'Aomori Prefecture. n.r. : not recorded.

3 1234 根本 優子 他 Fig. 1 PEGE represent either のstx2DNA配 本,未 報告 と同一 で 分 離 し た.患 そ の 他 の 散 発 例 由 来 の 分 離 株 で はNo.6株 者 年 齢 は1歳 O157:NM2株 を 含 む そ の 他 の6株(Fig.1, パ タ ー ン を示 した. PCRに か ら77歳 で,3歳 以下 全 て 異 な るPFGE よ る 解 析 で は0157:NMのNo 女 比 は5:6 岡市集団感染例 由来 の 2).そ サ ザ ン プ ロ ッ トを 行 っ た(Fig の 結 果,stx1はNo.7株 で330kbDNA断 27株,92N株,お よ びEHECO157:NMの2株 に,ま た,No.11株 に つ い てPFGEを 行 っ た.集 こ れ ら 以 外 の 菌 株 で は 約130kbのDNA断 ち,2次 感 染 保 菌 者 由 来 の1株 Fig.1,lanes14 17に 示 し た.一 方,2次 団感 染 例 由来 株 の う を 除 く26株 は 全 て 示 し たPFGEパ ター ンを 感 染 保 菌 者 由 来 の1株 で は380 kbと210kbの 新 た な バ ン ド が 観 察 さ れ た(Fig 1,1ane18).散 発 例 の 腸 炎 患 者 由 来 の 分 離 株 で は, PFGEパ のPFGEパ タ ー ン を 示 し た.さ ら に,こ パ ター ン と も類 似 した. 在 す る こ と が 示 さ れ た.一. 18株 ま で は600kb断 片 に 存 在 し た が, 片 に存 は550kb,No.6株 13株 は200kb,そ し てNo.7株 ほぼ同一の 存 在 し た.さ 片 に,No.11株 つ のDNA断 No.2とNo.11株 断 に 片 に存 在 す る分 離 か らNo. 片,No.1,4,5,8,10株 は555kb,No.9株 ら にNo.2株. 片 方,stx,はXbaI切 よ っ て 得 ら れ る 最 長 のDNA断 れ ら分 離 株 タ ー ン は 集 団 感 染 例 由 来 株 のPFGE で は500kb断 株 が 多 く,集 団 感 染 例 の 分 離 株No-14株 92N株(Fig.1,lane1)とNo.4,5,8,9,10 株(Fig.1,lanes4,5,8,9,10)が あ り, は8tx1+,stx2+で あ っ た(Table1). PFGE後,stxの. と がstx1-,stx2+で 残 り のEHECO157:H737株 て の症 例 は続 発 症 を 起 こ す こ と な く完 治 し た(Tablel).19株 がstx1-,stx2-,0157:H7のNo.2,No.3株 0157:NMのNo.12株 児 の 発 症 が 顕 著 で あ っ た.男 に み ら れ た が,全 タ ー ン の 類 似 が 見 ら れ た が,EHEC ら に1997 の 報 告 が あ っ た.さ 以 上 の 散 発 例 の11株,盛 Numbers containing side. Ianes2,3,11,12,13,19)は の 腸 炎 患 者 か らEHECO157;H7を で 血 便 が7例 strains. か ら始 ま 5名,10代1名,20代2名,50代1名,70代2名 で,幼 at the right PFGEパ 分 離 報 告 は7月 ま で に10例 に1名 0157 : NM (Fig.1,lane6)とNo.7株(Fig.1,lane7)で 果 手 県 にお け る散 発 例 の腸 炎 患 者 か ら のEHECO157:H7の り,10月 0157 : 117 and 1. Sizes in kb of the DNA fragments 発 表). 結 1996年,岩 of EHEC in Table the stx, or stx, gene are written 列 はJacksonら5)の あ っ た(根 年2月 analysis the patients で は410kb,No. で は185kb断 片 に で は530と155kbの2断 で は300,230,お よ び155kbの3 片 に シ グ ナ ル を 認 め た.し は 少 な く と も2コ 感染 症 学 雑 誌 たが って ピ ー以 上 の 第71巻 第12号

4 EHEC O157:H7の ゲ ノタ イ プ分析 1235 Fig. 2 Southern blotting of the stx genes. XbaI-cleaved genome DNA shown in Fig. 1 was transferred to Hybond N+ membrane, and then hybridized with (a) the fluorescein-labeledstx1,and (b)-stx2 specific DNA probes. b a が 明 ら か と な っ た.し stx2を 保 有 す る も の と 考 え ら れ た. PCRでstx1-で あ っ たNo.2,3,12,19株 びPCRでstx2-で あ っ たNo.19株 プ ロ ッ トで もPCRの お よ で は,サ 結 果 に 一 致 し て,そ ザ ン れ ぞれ の 遺 伝 子 に 対 応 す る シ グ ナ ル は 認 め な か っ た.一 方,PCRでstx2+で あ っ たNo.3株 とNo.12株 のPFGEで た が っ てEHEC O157:H7 示 さ れ る ゲ ノ タ イ プ は,我 々 が 考 え て い る以 上 に 変 化 し や す い も の と 考 え ら れ,PFGE パ タ ー ン 解 析 時 に は,変 異 に よ るパ ター ンの 変 化 に 注 意 す る 必 要 が あ る. 最 近,大 腸 菌 を 含 む 細 菌 は,比 較 的 高 い遺 伝 子 は サ ザ ン プ ロ ッ トで は シ グ ナ ル が 検 出 で き ず,こ 変 異 能 を 自 然 界 に お け る 集 団 内 で 保 持 し て お り, れ ら の2株 こ れ に よ り環 境 適 応 の 手 段 と し て い る 可 能 性 が 報 はstx25)と は 異 な る5偽DNA配 列 を 告 さ れ た10)11).LeClercら12)は 持 つ こ とが 示 唆 さ れ た. 考 岩 手 県 で は1996年 か ら1997年2月 療 機 関 で 治 療 を 受 け,届 O157:H7感 条 件 下 で 約4%のEHEC 察 まで の 問 に 医 け 出 の あ っ たEHEC 染 患 者 は 集 団 感 染 例 で41名6)お 発 例 の 腸 炎 患 者11名 し た 患 者 は な く,全 EHECO157:H7を 方 法 と し て,PFGEは の 合 計52名 よ び散 で あ っ た.重 症 化 O157:H7分 変 異 率 を 持 つ こ と を 示 し て お り,今 け る分 離 株 に つ い て も,同 よ り広 範 囲 で 長 期 間 に わ たって 分 離 し た O157:H7のPFGEパ タ ー ン に よ る分 子 疫 学 分 析 を 補 足 す る た め に,本 最 も識 別 力 が 高 く,有 込 み 部 位 に つ い て 検 討 し た.こ 研 究 で はstxの れ ら2種 方 法 と な っ て い る3)7) 9).1996年 に 日 本 各 地 で 分 離 方 法 か ら 得 ら れ た 結 果 か ら,検 し たEHECO157:H7に O157:H7の つ い て のPFGEパ ン は 和 田1)に よ り報 告 さ れ て い る.一 方,今 討 か らEHEC O157:H7分 離 株 のPFGEパ ター 回 の検 ター ン は14日 間 と い う 極 め て 短 期 間 に 変 化 し う る こ と 平 成9年12月20日 邦 にお 様 な検 討 が 必 要 で あ る 含 む病原細菌 の分子疫学 の 用な 離株 が高い 後,本 と考 え る. EHEC て の 患 者 が 完 治 し た. 実 際 に,通 常 の 培 養 分 離 株 は7つ れ た(Table1).No.6株 類 の解析 討 し たEHEC のゲ ノタイ プに分 け ら とNo,7株 タ ー ン は 類 似 し て い た が,stx組 な る こ と か ら,異 組 み はPFGEパ み込 み 部 位 が 異 な る ゲ ノ タ イ プ に 分 類 し た.こ

5 Fig. 3 A map of municipalities around Iwate Prefecture where EHEC O157 strains were isolated. 1, Towada ; 2, Ninohe ; 3, Kuzumaki ; 4, Matuo ; 5, Morioka ; 6, Ohazama ; 7, Towa ; 8, Esashi ; 9, Isawa. Letters from A to I are genotypes of EHEC O157 strains described in Table 1. One letter corresponds to a patient. A* is the food-poisoning outbreak. 5) Jackson MP, Neill RJ, O'Brien AD, Holmes RK, Newland JW : Nucleotide sequence analysis and comparison of the structural genes for Shiga-like toxin I and Shiga-like toxin II en- by bacteriophages from Escherichia coded coli. FEMS Microbiol Lett 1987 ; 44 : ) Bohm H, Karch H : DNA fingerprinting of Escherichia coli O157 : H7 strains by pulsedfield gel electrophoresis. J Clin Microbiol 1992 ; 30 : ) Watanabe H, Wada A, Inagaki Y, Itoh K, Tamura K : Outbreaks of enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157 : H7 infection by two different genotype strains in Japan, Lancet 1996 ; 348 : ) Taddei F, Radman M, Maynard-Smith J, Toupance B, Gouyou PH, Godelle B : Role of mutator alleles in adaptive evolution. Nature

6 1997 ; 387: ) Sniegowski PD, Gerrish PJ, Lenski RE : Evolution of high mutation rates in experimental populations of E. coll. Nature 1997 ; 387: ) LeClerc JE, Li B, Payne WL, Cebula TA : High mutation frequencies among Escherichia coli and Salmonella pathogens. Science 1996 ; 274 : Genotype Analysis of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Strains Isolated in Iwate Prefecture from 1996 to February 1997 Yuko OHARA-NEMOTO, Masahiko KOBAYASHI & Masaru KANEKO Department of Microbiology, School of Dentistry, Iwate Medical University Genotypes of 38 isolates of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157:H7 isolated from 11 sporadic cases and one outbreak in Iwate Prefecture from 1996 to February 1997 were studied by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), in comparison with a strain of EHEC O157:H7 isolated in 1992 in Ohazama-Cho, Iwate Prefecture, and two isolates of EHEC O157:NM. In order to substantiate the genotypes classified by PFGE, Southern blotting was performed to investigate integration sites of the Shiga toxin genes (stx) in the XbaI-digested genome DNA fragments. The stx1 gene existed on an approximately 130 kb fragment in all isolates except two ones. On the other hand, the stx2 gene was observed on 11 DNA fragments in different length from 600 kb to 155 kb, indicating that the stx2 gene integrates into more heterogeneous sites of genome DNA than stx1 does. From these analyses, EHEC O157:H7 isolates examined were classified into 7 genotypes. Since half of the isolates were the same genotype as that of the isolate in 1992, it is suggested that this type of EHEC O157:H7 strain is expanding from Ohazama-Cho and Morioka City in Iwate Prefecture.

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