東京都健康安全研究センター研究年報

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1 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 2004 重症急性呼吸器症候群 (SARS) 診断のための遺伝子検査法の確立 Establishment of Genetic Diagnosis for Severe Acute Respiratory Syndrome SARS Takayuki SHINKAI, Kenji SADAMASU, Michiya HASEGAWA, Yukiko TABEI, Mami NAGASHIMA, Yasuko YOSHIDA, Akemi KAI and Satoshi MOROZUMI Keywords Severe Acute Respiratory Syndrome SARS PCR nested-pcr PCR Real-timePCR はじめに Severe Acute Respiratory Syndrome SARS ) SARS SARS SARS, CDC Bernard-Nocht SARS 2) WHO SARS SARS WHO 1 SARS SARS SARS SARS 表 1 SARS 問題の主な経緯 中国 広東省で肺炎患者多数発生患者 305 名中 5 名死亡 (2.11 報告 ) 香港, ベトナム, シンガポール, カナダで重症肺炎患者発生この患者の周囲から同様の症状多発 世界各地で重症肺炎患者発生 世界保健機関 (WHO) は SARS の原因は 新型コロナウイルス (SARS コロナウイルス ) であると発表 ベトナムが感染地域指定 (2.23 より ) 解除 国内において SARS に感染した台湾人医師の問題発生 青森県八戸沖で乗組員の SARS 感染疑い問題発生 シンガポールが感染地域指定 (2.25 より ) 解除 香港が感染地域指定 (2.15 より ) 解除 北京が感染地域指定 (3.2 より ) 解除 カナダ トロントが感染地域指定 (2.23 より ) 解除 台湾が感染地域指定解除 WHO は SARS におけるヒト - ヒト感染の経路は世界的に断たれたと発表 ( 終息宣言 ) シンガポールで SARS の実験室内感染 台北で SARS の実験室内感染 中国 広東省で 3 名の SARS 感染例が報告されたが 感染源は特定されなかった 中国 北京で国立ウイルス学研究所内での実験室感染を原因とした一人の死者を含む 9 人の SARS 患者が報告された SARS Tokyo Metropolitan Institute of Public Health , Hyakunin-cho, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan

2 26 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 2004 Real-timePCR SARS 材料と方法 1. 供試材料 SARS % 表 2.SARS 検査に供された患者の主な渡航先と検出病原体 主な渡航先患者数 検体種別 検体数 SARS コロナウイルス ヒトメタニューモウイルス ウイルス検出数 インフルエンザウイルス パラインフルエンザウイルス RS ウイルス アデノウイルス その他検出数 マイコプラズマ 咽頭拭い液 喀痰 香港 10 尿 4 血液 9 咽頭拭い液 9 1 喀痰 台湾 8 尿 6 血液 9 ふん便 2 咽頭拭い液 9 1 喀痰 2 1 北京 7 尿 4 1 ふん便 3 咽頭拭い液 1 1 喀痰 0 上海 1 尿 0 咽頭拭い液 3 喀痰 1 シンガポール 5 尿 1 咽頭拭い液 喀痰 2 広東 4 尿 1 1 咽頭拭い液 1 喀痰 0 ロンドン 1 尿 0 咽頭拭い液 1 喀痰 1 蘇州 1 尿 1 ふん便 1 咽頭拭い液 3 喀痰 1 1 その他 3 尿 0 血液 3 計 40 計 検査対象病原体の変遷 SARS SARS SARS CDC 2-3) Bernard-Nocht SARS 2) 2,4-6) SARS 3. 遺伝子抽出法 1) SARS コロナウイルス検査 QIAmp Viral-RNA Mini-kit QIAGEN 2)SARS コロナウイルス以外の検査 RV-R 4. 遺伝子検査法 1)nested-PCR 法 SARS 3 Big Dye terminator cycle Sequencing NCBI 2)Real-time PCR 法 SARS Real-timePCR ABI Primer Express 2.0 CDC Bernard-Nocht 2) 4 SARS Rial-timePCR Real-time PCR ABI PRISM 7900HT(Applied Biosystems) 3)Loop-mediated Isothermal Amplification(LAMP) 法 Loopamp 5. 検査体制

3 55, 表 3 nested-pcr 法に用いたプライマー 対象病原体 プライマー名 塩基配列 配列位置 インフルエンザ AH1 PA53 5 -TGAGGGAGCAATTGAGCTCA ウイルス PB53 5 -TGCCTCAAATATTATTGTGTCC IU TTACAGAAATTTGCTATGGCTG IU ACACTACAGAGACATAAGCATT AH3 HN TTTGTTGAACGCAGCAAAGCT HN CTCCCGGTTTTACTATTGTCC IFA-A GATTATGCCTCCCTTAGGTC IFA-A CCCCTTACCCAGGGTCTAG B IB GCAAAAGCTTCAATACTCCAC IB TTTGTGGTAGCCCTCCGTC IB GGAACCTCAGGATCTTGCC IB GGTAGCCCTCCGTCTTCTG RSウイルス RO3 5 -TATAGCTGTATCCAAAGTTT RO4 5 -ATAGAGGTGATGTGTGTAAT RO1 5 -CTTGAAGGAGAAGTGAAC RO2 5 -TGATGTGTGTAATTTCCA アデノウイルス B 群 HexAA GCCGCAGTGGTCTTACATGCACATC 以外 HexAA CAGCACGCCGCGGATGTCAAAGT NeHexAA GCCACCGAGACGTACTTCAGCCTG NeHexAA TTGTACGAGTACGCGGTATCCTCGCGGTC B 群 SAD TTCGGAGTACCTCAGTCCG MAS TGTGCTGGCCATGTCAAGC マイコプラズマ * MP1-1st 5 -GCAAGTCGATCGAAAGTAGT ニューモニエ MP2-1st&2nd 5 -ATTTGCTCACTTTTACATGCTGGCG MP3-2nd 5 -GAATGACTTTAGCAGGTAATGGCTA クラミジア C1F 5 -ACGGAATAATGACTTCGG ニューモニエ C1R 5 -TACCTGGTACGCTCAATT CPF 5 -ATAATGACTTCGGTTGTTATT CPR 5 -CGTCATCGCCTTGGTGGGCTT ハ ラインフルエンサ 1 型 PIP1+ 5 -CCTTAAATTCAGATATGTAT ウイルス PIP1-5 -GATAAATAATTATTGATACG PIS1+ 5 -CCGGTAATTTCTCATACCTATG PIS1-5 -CTTTGGAGCGGAGTTGTTAAG 型 PIP2+ 5 -AACAATCTGCTGCAGCATTT PIP2-5 -ATGTCAGACAATGGGCAAAT PIS2+ 5 -CCATTTACCTAAGTGATGGAAT PIS2-5 -GCCCTGTTGTATTTGGAAGAGA 型 PIP3+ 5 -CTGTAAACTCAGACTTGGTA PIP3-5 -TTTAAGCCCTTGTCAACAAC PIS3+ 5 -ACTCCCAAAGTTGATGAAAGAT PIS3-5 -TAAATCTTGTTGTTGAGATTG ヒトメタニューモ MPVN3f 5 -GAGAAGAGCTGGGTAGAAG ウイルス MPV CATTGTTTGACCGGCCCCATAA MPV AACCGTGTACTAAGTGATGCACTC MPVN3r 5 -CAAACAAACTTTCTGCT コロナウイルス cou2 5 -CAGAATGGATGTCTTGCTGC cou1 5 -GTGATTCTTCCAATTGGCCAT cou3 5 -ATAGAGAAGGTTATAGCAGACT cou4 5 -TCATTCATTTACTAATTACTGGG SARSコロナ BNIoutS2 5 -ATGAATTACCAAGTCAATGGTTAC ウイルス BNIoutAs 5 -CATAACCAGTCGGTACAGCTA BNIinS 5 -GAAGCTATTCGTCACGTTCG BNIinAs 5 -CTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG ** SAR1s 5 -CCTCTCTTGTTCTTGCTCGCA SAR1as 5 -TATAGTGAGCCGCCACACATG *:Semi-nested-PCR 法 **:RT-PCR 法 表 4 real-timepcr 法に用いたプライマーとプローブ 対象ウイルス プライマー プローブ名 塩基配列 SARSコロナ BNITMSARS1 5 -TTATCACCCGCGAAGAAGCT-3 ウイルス BNITMSARAs2 5 -CTCTAGTTGCATGACAGCCCTC-3 BNITMSARP インフルエンザ AH1 H1-VAF 5 -CTCTGTAGTGTCTTCACATTATAGCAGAAG-3 ウイルス H1-VAR 5 -TGATCTCTTACTTTGGGTCTTTTGG-3 H1-MGBVA AH3 RT-H3-588 RT-H3-653 Flu-H TCAAGCATCAGGGAGARTCACA-3 5 -CCGATATTCGGGATTACAGTTTG-3 B RT-B-265F 5 -CCTGTTACATCYGGRTGCTTTCC-3 RT-B-334R 5 -GAGAAGATTGGGYAGYTGTCTRAT-3 Flu-B-293 アデノウイルス ADHXFm 5 -CCTBGGMCARAACMTKCTCTA-3 ADHXRm 5 -CATGGGRTCSACYTCRAAAKTCAT-3 ADHX 5 -FAM-TCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGT-TAMRA-3 5 -VIC-TTGGAGCCATTGCC-MGB-3 5 -FAM-TCTCTACCAAAAGAAGCCA-MGB-3 5 -VIC-TGCACGACAGAACAA-MGB-3 5 -FAM-AACTCCGCCCACGCGCTAGA-TAMRA-3 ADHX7 5 -FAM-AACTCGGCCCATGCGCTGGA-TAMRA-3

4 28 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 2004 結果 1.nested-PCR 法による検査結果 AH3 2 B 1 AH RS RT-PCR 53 nested-pcr +SARS 50 PCR PCR 5. 検査体制の整備 SARS 8 SARS 2.Real-time PCR 法による検査結果 Real-time SARS 6 3.LAMP 法による検査結果 LAMP SARS 検査のコストダウンと省力化 RT-nested-PCR 23 PCR PCR SARS nested-pcr 1 14 PCR 5 PCR PCR 4 +PCR 1 PCR AH1 +AH3 +B +RS 53 B + B 考察 SARS SARS SARS SARS WHO 8) SARS SARS SARS PCR 1 PCR PCR nested-pcr 23 Real-time PCR

5 55, 鼻咽頭吸引液 (n=392) 便 (n=50) 80 尿 (n=20) ~2 3~5 6~14 15~17 21~23 ( 日 ) 経過日数図 1 SARS コロナウイルスに感染発症した患者の各臨床材料中における RT-PCR 陽性率の変動 (WHO:SARS 報告書 ) LAMP SARS SARS SARS 24 SARS SARS SARS SARS 38 5 Real-time PCR LAMP RT-nested-PCR SARS SARS SARS SARS 表 5 SARS 関連検体採取時期と検査対象病原体 検体の種類検査対象の病原体時期 ( 法定 ) 第一 二次体制第三次体制咽頭拭い液, SARS コロナウイルス診断時喀痰, 尿, 便, インフルエンサ ウイルス SARS コロナウイルスアテ ノウイルス血液発症咽頭拭い液, SARS コロナウイルス SARS コロナウイルス 10 日後喀痰, 尿, 便抗体検査抗体検査 3 週間後血液 ( 抗 SARS コロナウイルス ) ( 抗 SARS コロナウイルス ) 1SARS コロナウイルス 2 インフルエンザウイルス 3 アデノウイルス 4RS ウイルス 5 ハ ラインフルエンサ ウイルス 6 マイコフ ラス マ ニューモニエ 7 クラミシ ア ニューモニエ 8 レジオネラ菌 ( 尿中 ) 表 6 SARS 関連検体の検査項目 第一次体制第二次第三次検査項目体制体制疑い例疑似症 検査実施 : する,: しない,: 必要に応じて行う SARS 文献 1 24(4), Drosten C, Gunther S, Preiser W, et.al.: N Engl J Med. 348(20): ) Teresa C.T. Peret, Guy Boivin, Yan Li, et.al.: J. of Infect. Disease, 185, , Marra MA, Jones SJ, Astell CR, et.al.:science. 300 : , Wang Y, Ma WL, Song YB;Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 23(5), Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, et.al.: N Engl J Med., 348(20): ) Susan M. Poutanen, Donald E. Low, Bonnie Henry, et.al.: N. Engl. J. Med., 348(20), , WHO WHO Scientific Research Advisory Committee on SARS. Switzerland, October 2003

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