ノロウイルおよびアストロウイルスによる急性胃腸炎に関する分子疫学的研究

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4 197 Norovirus NV RNA Calicivirus Norovirus ) NV NV NV NV 1997 NV 21 NV 3% CDC NV 2,3 1 3

5 NV 3 24 NV NV NV 2,3 199, NV, NV NV NV NV kb RNA open reading frame(orf) NV NV G G G1 14G2 17 NV, NV NV RTPCR PCR 4

6 PCR NV ELISA ELISA NV RNA Virus DNA RNA Calicivirus Astrovirus (mrna) Norovirus Astrovirus Norovirus ORF1 ORF2 ORF Kb Astrovirus ORF1 ORF Kb NV RNA RNA RNA mutation ( ) recombination ) mutation ( ) RNA RNA recombination ( ) copychoice NV 2 Jiang ORF1ORF2 NV ORF 2 capsid P1A P2 P2 GC AU 5

7 RNA 2 Gallimore NV Nilson NV capsid S P1 P2 NV 1999 NV in vitro NV Astrovirus ASV NV RNA Astrovirus Astrovirus ( )ASV ELISA NV ASV 1 ASV ASV ASV NV ASV ASV NV RNA NV NV ASV RNA 6

8 7

9 1 8

10 NV NV Mead NV ) 2,3 NV ( ) 92 NV 3 RTPCR NV 1998 NV NV 1 NV common disease CDC NV NV NV 24 NV , NV 21 NV 9

11 NV NV NV 24 / 5 NV NV NV NV , , NV NV 1

12 NV NV 1 5.6% 2 1.1% 15.7% ) 1 3, ,4 65 = , % 52 1, = 73, NV 73, NV NV 11

13 (21 ) NV

14 874, NV NV 1, NV NV NV Mead 2,3 NV ( ) 92 3 ) NV NV NV 1997 NV 23 NV NV 3, NV NV NV NV 3, 13

15 NV 24 / 5 NV NV ) 2 51 NV 73, 16 1 NV NV NV 14

16 NV NV ,355 1, NV NV NV 6 GenBank G1 G2 2 ) 2 G1 14 G2 17 ( ) NV PCR PCR RNA NV NV NV 1997 NV NV G1 G2 ) NV 61 NV NV NV 15

17 16

18 (1) % NV 5 1 NV NV NV NV PCR 4 1 NV NV ,589 (2) NV TaqMan NV 2,3 NV NV Realtime PCR

19 18

20 (3) NV 612 NV 61 NV 61 7 NV NV UPGMA NV 68 G2 G/5 (31%) G/4 (22%)G/1 (16%)G /3 (15%) 4 8 G1 G/3 1 1 G2 NV 4 G

21 (4) NV G/3 2 4 G/3 NV (1 2 ) G NV NV (5) NV G/3 2 G2 1 G /5 G/3 G/1 2 G G/5 16 G/4 11 G/1 7 G/3 5 G2 3 NV 4 2

22 (6) NV 4 G2 (7) NV NV

23 8 9 (8) G

24 NV NV NV 199 NV NV NV 48% 2% 9% NV 2 NV 2% NV 2 NV PCR 1 8 /g 1 3 /g Jiang NV PCR NV 6 NV NV NV 2 G,G G1 14 G2 17 NV 23

25 NV nested reverse transcribed polymerase chain reaction ( nested RTPCR ) NV NV G/5 (31%)G /4 (22%)G/1 (16%)G/3 (15%) NV NV NV NV NV HCV Quasispesis( ) NV NV 1997 G / G G/5 22 GII/4 Lordsdale/93/UK [X86557] ) ORF2 GII/4 ORF1 ) ) / ORF GII/4 RNA RNA RNA 24

26 RNA RNA NV 25

27 1 26

28 nested reverse transcribed polymerase chain reaction ( nested RTPCR )NV 61 PBS()1 HCFC141b 1,5 g X, 1 3,g X 3 1, g X, 3 4.1M.15MNaCl RNA RNA Jiang CTAB

29 RTPCR NV DNA Molony Murine Leukemia Virus ( MMLVRT ) pd(n)6 Random HexamerOligo d(t)cog1r/cog2r G2SKR RTPCR RNA 741 PC71 (Astec K.K.) st PCR 1.M ExTaq DNA polymerasetakara1.25u 1mM TrisHCl ph8.3 5mM KCl1mM MgCl2 5l st PCR nestedpcr PCR 2% 47bp 33bp 26bp µ µ 11 RTPCR 28

30 11 43) NV G1 G/1 G2 (G/3) ECL FITC PCR Hybond N UV 515 5Over Night ECL Hyper filmecl PCR PCR ABI PRISM 7 ( Applied Biosystems ) (Micro Amp Optical 96Well Reaction Plate) 2.l DNA

31 12 DNA NV 1st PCR PCR Dye Terminator ABI PRISM 31 Genetic AnalyzerApplied Biosystems DNA Data Bank of JapanDDBJ NV UPGMA (Outweighed PairGrouping with an Arithmetic Mean Method ) 3

32 31

33 ( ASV )Astrovirus Astrovirus ( ) ASV ASV ASV 3 (Open reading frame: ORF) 5' ORF1a ORF1b ORF1b ORF2 ASV NV , ASV ASV 1 ASV ELISA NV ELISA ASV ASV NV NV ASV NV ASV ASV NV NV RTPCR NV ASV (57%) NV 159 (17%) ASV (7 ) (34 ) (2 ) (24 ) ASV 38%18%17 13 NV (12) 32

34 ( ) ASV 1 ASV NV 1 ASV NV 2 ASV NV NV ASV 33

35 ASV NV ASV ASV % % ASV ASV ASV ASV 1 ASV NV ASV (57%) NV 159 (17%) ASV ASV NV 85 ASV 2 ASV NV 2 ASV NV 4 ASV NV NV ASV 4 2 NV ASV 3 1 NV ASV 3 5 ASV NV 1 ASV NV NV ASV 4 5 ASV 34

36 2 35

37 (norovirus : NV ) (rotavirus : RV) (astrovirus : ASV)3 NV NV NV NV 2 G,G G1 14 G2 17 NV RNA RNA RNA RNA mutation ( ) recombination ) 1962 Picornavirus NV RNA NV NV Jiang ORF1ORF2 Rohayem ORF 2 capsid Gallimore NV NV Nilson NV capsid in vitro NV 36

38 1999 NV ASV NV ASV in vitro NV NV ASV ASV NV NV NV ASV NV ASV ASV ASV Single stranded conformational polymorphism (SSCP) NV G1 G2 NV SSCP ( )

39 (1 22 9:) 76%(28/37 ) (85%) (58%) (58%) (38%) (35%) (31%) (27%) (1/2) (2/2) (2/2) (1/2) (1/2) (1/2) ( ) NV ASV NV NV NV NV NV 2 NVASV 2 38

40 6 NV 3 ASV 14NV ASV 13 NV ASV RTPCR RTPCR EM ELISA / / / / EM : ELISA : ( )S.aureus 1 (1 22 9:) 14 NV ASV

41 NV ASV 1 NV ASV 24 NV ASV 1 14 Crew No. Time of onset Result of RTPCR Number of times Symptoms (hours) Norovirus Astrovirus Diarrhea Vomiting Nausea Chill Abdominal pain Cluster Cluster Preceding (213) Preceding (195) Asymptomatic Asymptomatic Asymptomatic Asymptomatic Asymptomatic Asymptomatic Asymptomatic Asymptomatic Asymptomatic (1) ( 5) () (2) () () () () () () NV NV ORF ' ORF ' (14) Minato G/ 1 G/ 1 G/5 8 'ORF1 'ORF2 4

42 15 Minato14 'ORF1 G/6 99% 'ORF2 75% G/1 97 Minato14 ORF1 G/6ORF2 G/1 Minato NV 5 ORF2 14(a)Minato3Minato6 Minato8Minato9Minato17 3 ORF1 14(b)Minato3 Minato4Minato6Minato9Minato13Minato31Minato/6 3 ORF1 G/5 Yuri/52/99/JP 1% G/5 5 ORF2 G/5 (83%) G /1(89%) Yuri/52/99/JP 3 ORF1 ORF2 (A) 3 ORF1 B) 5 ORF2 G4(Bristol; X76716) G8(SaitamaU25; AB67543) G1(Mc37; AY237415) G9(VA9727; AY38599) G1(Hawaii; U7611) G2(Melksham; X81879) Minato/1 (AB233472) Neustrelitze(AY77273) G3(Tront; U23) Minato/3 Minato/4 Minato/6 (AB233471) Minato/9 Minato/13 G6(SaitamaU4; AB39777) Minato/14 (AB233474) Neustrelitze(AY77273) G1(Hawaii; U7611) Minato/3 Minato/6 (AB233471) Minato/8 Minato/9 Minato/17 Minato/31 G5(SaitamaT49; AB112315) G5(Yuri52; AB9876) G1(Mc37; AY237415).5 G5(SaitamaT49; AB112315) G6(SaitamaU4; AB39777) Minato/14 (AB233474) G9(VA9727; AY38599) G8(SaitamaU25; AB67543).5 G2(Melksham; X81879) G3(Tront; U23) G4(Bristol; X76716) Minato/33 (AB233473) 14 NV 41

43 15 3 ORF1 5 ORF2 G /genotype G /1 G /2 G /3 G /4 G /5 G /6 G /8 G /9 G /1 Strain (Accession number) Hawaii (U7611) Melksham (X81879) Tront (U23) Bristol (X76716) SaitamaT49 (AB112315) SaitamaU4 (AB39777) SaitamaU25 (AB67543) VA9727 (AY38599) Mc37 (AY237415) Yuri52 (AB9876) Neustrelitz (AY77273) 3'ORF1 72 (84) 72 (85) 71 (83) 73 (84) 89 (98) 72 (78) 7 (76) 71 (78) 72 (83) 98 (1) 73 (84) Abbreviations: n.d., not done Minato/6 (AB233471) 5'ORF2 79 (89) 76 (86) 79 (86) 75 (76) 79 (83) 76 (82) 78 (83) 73 (81) 81 (87) n.d. 8 (87) % nucleotide (amino acid) sequence identity 3'ORF1 77 (92) 78 (92) 76 (91) 78 (91) 74 (85) 69 (78) 73 (81) 69 (79) 77 (91) 69 (78) 96 (98) Minato/1 (AB233472) 5'ORF2 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3'ORF1 69 (79) 69 (8) 7 (8) 7 (79) 71 (78) 99 (99) 78 (93) 93 (98) 69 (79) 71 (78) 7 (8) Minato/14 (AB233474) 5'ORF2 84 (97) 77 (89) 76 (88) 72 (79) 78 (89) 75 (86) 74 (86) 74 (84) 79 (9) n.d. 95 (1) 3'ORF1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Minato/33 (AB233473) 5'ORF2 75 (78) 76 (79) 75 (77) 86 (91) 75 (78) 75 (79) 76 (76) 77 (77) 75 (79) n.d. 75 (78) SSCP NV SSCP 15 SSCP 3bp 15(a)5 ORF2 3 No NV No.1 No.14 NV 5 ORF2 No.14 Neustrelitze/26//GE 98%G/1 97 No.1 PCR 3 ORF1 14(b) No.1 QNo.14 R No.1 Neustrelitze/26//GE No.14 SaitamaU4G/6 No.14 NV (Minato14 ) ORF1 G/6ORF2 G/1 ORF ORF2 42

44 (a) 5 ORF2 (b) 3 ORF A A A A A A A P P P P P F B F B C D E D Q R (mix) (mix) Crew Member Number (Italic) and Types of SSCP patterns 15SSCP SSCP ABE ASV ASV ORF1 3' 95% ORF25' (16) % 3'ORF2 ASV 5'ORF2 43

45 Minato/1 (21 hr after) Minato/21 (31 hr after) Minato/33 (asymptomatic) ASV 2 ASV 1 Minato/23 (38 hr after) Minato/3 (asymptomatic) Minato/5 (1 hr after) Minato/27 (54 hr after) Minato/9 (21 hr after) Minato/34 (asymptomatic) Minato/22 (35 hr after) Minato/29 (asymptomatic) 16 5 ORF2 NV NV NV NV 2 1 NV 2 NV (13) NV ASV NV 36 ASV 35 NV ASV 44

46 NV 2 NV NV NV NV NV NV NV NV ASV 24 ( ) 24 ( 2 ) NV ASV NV ASV 24 ASV ASV ASV NV ASV 1 ASV 5 ASV NV NV ASV Minato14 3 ORF1 5 ORF2 Neustrelitze G1 G6 G9 7 (8) 95 (1) 69 (79) 84 (97) 99 (99) 75 (86) 93 (98) 74 (84) 17Minato14 naturally occurred recombination NV NV 45

47 NV NV NV ASV ELISA NV ELISA ASV ASV ASV ASV NV NV SSCP SSCP C (HCV) (FCoV) SSCP NV G/1 1 G/ 1 G/5 8 NV Minato14 ORF1 G/6ORF2 G/1 ORF ORF2 No.14 Minato14 Minato SSCP A No ORF1 G/5 ORF2 G/5 G/1 G/1 NV 46

48 NV B E C G D A ASV b d a c F G A a F d A F a b 18 NV 2 NV ORF ORF2 NV GenBank NV NV SSCP No.15 No.25 NV SSCP ABE ABE NV SSCP SSCP 3bp 14 3 ORF1 LVNV82/F1R1 83bp SSCP PCR 47

49 18,19 NV ASV ASV ASV NV NV NV 2 NV NV NV Gallimore NV NV 1 1 NV 2 NV ASV 2 F NV C B G b a c A E D d ASV 37 2% =

50 Nilson NV NV capsid Jones 1 quasispecies Radford quasispecies NV NV quasispecies NV NV 49

51 TEM 2 3 TEM (HITACHI7) 4, ELISA DAKO IDEIA Astrovirus RTPCR 5

52 ASV DNA RTPCR NV RTPCR RTPCR 17 ASTEND 17 SSCP PCR SSCP 95%.25%.25% l Gene Gel Clean SSCP Gel 51

53 52

54 NV ASV 3 NV NV 1 NV NV 51 73, ,8 NV NV RTPCR NV 12 3 NV 48% 2% 9% 5 1 NV NV TaqMan PCR NV kb RNA open reading frame(orf) G G 14G 17 NV NV NV 3 5 (612 ) RTPCR PCR 68 G/1 (31%) G/4 (22%)G/6 (16%)G/3 (15%) NV NV 53

55 ASV NV NV ASV RTPCR ASV (17%) ASV ASV NV 57% ASV NV ASV 38%18%17 13 NV NV ASV NV RTPCR 18 3 ASV RTPCR 14 NV G/1G/ G/5 3 NV NV SSCP NV 1 G/6 G/1 ORF ORF2 ASV ORF1 ORF2 1 2 ASV SSCP NV RNA NV ASV RNA 54

56 55

57 56

58 57

59 58

60 59

61 6

62 61

63 62

64 Yukiko Sasaki, Akemi Kai, Yukinao Hayashi, Takayuki Shinkai, Yayoi Noguchi, Michiya Hasegawa, Kenji Sadamasu, Kohji Mori, Yukiko Tabei, Mami Nagashima, Satoshi Morozumi and Tomoko Yamamoto : Multiple viral infections and genomic divergence among noroviruses during an outbreak of acute gastroenteritis. J. Clinical Microbiology 44(3), in press (26) 63

65 64

(2) (2) (3) (3) (4) ABI PRISM 7700 TaqMan (4) Roche LightCycler TM (5) BioFlux LineGene TaqMan (6) 1 RT-PCR (7) (9) (10) F. Hoffmann-La Roche Ltd. Roc

(2) (2) (3) (3) (4) ABI PRISM 7700 TaqMan (4) Roche LightCycler TM (5) BioFlux LineGene TaqMan (6) 1 RT-PCR (7) (9) (10) F. Hoffmann-La Roche Ltd. Roc 05-8 Realtime PCR Master Mix (Code No. QPK-101, QPK-101T) TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN A3313K (2) (2) (3) (3) (4) ABI PRISM 7700 TaqMan (4) Roche LightCycler TM (5) BioFlux LineGene

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