Microsoft Word - 要旨_分子生体防御学松永 docx

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word - 要旨_分子生体防御学松永 docx"

しげじろうやぶき
4 years ago
Views:

1 学位論文の要旨 Molecular and Enzymatic Characterization of XMRV Protease by A Cell-Free Proteolytic Analysis ( 無細胞合成技術を用いたタンパク質分解解析法による XMRV プロテアーゼの酵素学的特性の評価 ) Satoko Matsunaga 松永智子 Department of Microbiology and Molecular Biodefense Research Yokohama City University Graduate School of Medicine 横浜市立大学大学院医学研究科分子生体防御学 ( Doctoral Supervisor:Akihide Ryo, Professor ) ( 指導教員 : 梁明秀教授 )

2 学位論文内容の要旨 Molecular and Enzymatic Characterization of XMRV Protease by A Cell-Free Proteolytic Analysis ( 無細胞合成技術を用いたタンパク質分解解析法による XMRV プロテアーゼの酵素学的特性の評価 ) 1. 序論ヒト免疫不全ウイルス (Human Immunodeficiency Virus; HIV) や異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス (Xenotropic murine leukemia virus-related virus; XMRV) が属するレトロウイルスはウイルスゲノム内にプロテアーゼ (protease; PR) をコードしており自身のカプシドタンパク質である Gag を切断することで感染性粒子を形成するレトロウイルスが保有するプロテアーゼ (rvpr) は活性中心にアスパラギン酸を持ち二量体形成により活性を獲得する rvpr の切断配列は基質である Gag タンパク質切断部位からみると指向性はあるものの多様であり立体構造上 rvpr 二量体により形成される親和性ポケットに適合することが必要である (Brik and Wong, 2003) 一方このような分子構造は宿主タンパク質も保有しておりいくつかの宿主タンパク質が in vitro において rvpr により切断されることが示されている (Balvay et al., 2007) しかしウイルスプロテアーゼの標的となる宿主タンパク質の知見は少なく rvpr による宿主タンパク質の切断がウイルス複製や病原性発現にどのように関与するかについては不明な点が多く残されている rvpr の解析が十分進んでいない理由としてウイルスプロテアーゼは細胞毒性が強く発現細胞において細胞死を誘導するため従来の生きた細胞を用いたタンパク質発現法では酵素活性をもつプロテアーゼを作製精製することが困難であることが挙げられるしたがって活性化 rvpr を用いたタンパク質切断反応を網羅的に測定することは容易ではないまた近年のヒトレトロウイルス感染症の治療において薬剤耐性を有する変異型 rvpr が出現しており多剤併用療法 (Antiretroviral Therapy; ART) における適切かつ有効な治療薬の選択が必須となっている現在実施されている薬剤耐性検査法はウイルスゲノム配列を解析しデータベースから薬剤感受性を間接的に評価する遺伝子型解析法 (Genotype 法 ) と患者由来のウイルスを分離培養し薬剤存在下において実際のウイルス増殖能を評価する表現型解析法 (phenotype 法 ) の二種類がある (Bansi et al., 2011) しかしながら前者では多数の蓄積した変異を評価できない点また後者においては実際の感染細胞を用いるため操作が煩雑であり費用が嵩むなど問題点が多いしたがってより迅速にかつ簡便に rvpr

3 の酵素活性の測定や薬剤感受性を検査できるツールの開発が必要である本研究ではコムギ無細胞タンパク質合成系と化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ (AlphaScreen 法 ) を組み合わせた rvpr の酵素活性を指標としたアッセイ系を構築し rvpr に対する薬剤スクリーニングおよび薬剤耐性 PR の薬剤感受性試験を行なったまた rvpr の新規基質タンパク質同定に向けた宿主タンパク質の網羅的探索を行い rvpr によるヒトレトロウイルス感染症の病態関与について考察した 2. 実験材料と方法 XMRV および HIV-1 由来 rvpr 及びレポータータンパク質はコムギ無細胞タンパク質合成系を用いて作製したこれら rvpr とレポータータンパク質を混合し切断反応を行った後 AlphaScreen ビーズを加えルミネッセンスシグナル (AlphaScreen signal) を測定することで切断活性を算出したさらに 2 色イムノブロット法を用いて rvpr の基質となる宿主タンパク質の網羅的探索を行なった 3. 結果と考察本アッセイ系を活用し新規ガンマレトロウイルスである XMRV PR の性状解析および薬剤感受性の解析を行なった結果既存の抗 HIV-1 薬ではアンプレナビル (APV) とダルナビル (DRV) が XMRV PR の活性を阻害することを示したまた XRMV 感染症における病態発現のメカニズムを解明するため rvpr の標的となる宿主タンパク質を網羅的に探索し PTEN や BAX を含めた複数種類のがん抑制遺伝子由来の宿主タンパク質が XMRV PR により切断されることを明らかにした以上の結果から本研究で構築した rvpr の酵素活性を指標とした基質切断アッセイ系は迅速かつ簡便にレトロウイルスの薬剤感受性試験を行うことができる大変有用なツールであることが示されたまた rvpr を中心としたウイルス宿主タンパク質相互作用を明らかにすることでヒトレトロウイルス感染症における様々な病態機構の解明に繋がることが期待される

4 引用文献 Balvay, L., Lopez Lastra, M., Sargueil, B., Darlix, J.L., and Ohlmann, T. (2007). Translational control of retroviruses. Nat Rev Microbiol 5, doi: /nrmicro1599. Bansi, L., Smith, C., Phillips, A., Kirk, S., Geretti, A.M., Johnson, M., Mackie, N., Post, F., Gazzard, B., Dunn, D., Sabin, C., Study, U.K.C.H.C., and The, U.K.C.G.O.H.I.V.D.R. (2011). The impact of HIV drug resistance testing on changes to treatment. AIDS 25, doi: /QAD.0b013e a0. Brik, A., and Wong, C.H. (2003). HIV-1 protease: mechanism and drug discovery. Org Biomol Chem 1, 5-14.

5 論文目録 Ⅰ. 主論文 Molecular and Enzymatic Characterization of XMRV Protease by A Cell-Free Proteolytic Analysis Satoko Matsunaga, Tatsuya Sawasaki, Hirotaka Ode, Ryo Morishita, Ayako Furukawa, Ryuta Sakuma, Wataru Sugiura, Hironori Sato, Masato Katahira, Akifumi Takaori-Kondo, Naoki Yamamoto and Akihide Ryo Journal of Proteomics. 75(15): : 31 August 2012 Ⅱ. 参考論文 A cell-free enzymatic activity assay for the evaluation of HIV-1 drug resistance to protease inhibitors Matsunaga S #, Masaoka T #, Sawasaki T, Morishita R, Iwatani Y, Tatsumi M, Endo Y, Yamamoto N, Sugiura W*, Ryo A*. Front Microbiol. 2015; 6:1220. doi: /fmicb #These authors contributed equally to this work. *These authors are corresponding authors. Molecular dissection of HBV evasion from restriction factor tetherin: A new perspective for antiviral cell therapy. Miyakawa K, Matsunaga S, Watashi K, Sugiyama M, Kimura H, Yamamoto N, Mizokami M, Wakita T, Ryo A. Oncotarget Sep 8;6(26): ASK1 restores the antiviral activity of APOBEC3G by disrupting HIV-1 Vif-mediated counteraction. Miyakawa K, Matsunaga S, Kanou K, Matsuzawa A, Morishita R, Kudoh A, Shindo K, Yokoyama M, Sato H, Kimura H, Tamura T, Yamamoto N, Ichijo H, Takaori-Kondo A, Ryo A. Nat Commun Apr 22;6:6945. doi: /ncomms7945.

6 Wheat germ cell-free system-based production of hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein of human parainfluenza virus type 3 for generation and characterization of monoclonal antibody. Matsunaga S, Kawakami S, Matsuo I, Okayama A, Tsukagoshi H, Kudoh A, Matsushima Y, Shimizu H, Okabe N, Hirano H, Yamamoto N, Kimura H, Ryo A. Front Microbiol May 13;5:208. doi: /fmicb ecollection Involvement of hepatitis C virus NS5A hyperphosphorylation mediated by casein kinase I-α in infectious virus production. Masaki T, Matsunaga S, Takahashi H, Nakashima K, Kimura Y, Ito M, Matsuda M, Murayama A, Kato T, Hirano H, Endo Y, Lemon SM, Wakita T, Sawasaki T, Suzuki T. J Virol Jul;88(13): doi: /JVI Epub 2014 Apr 23. Development of oligomannose-coated liposome-based nasal vaccine against human parainfluenza virus type 3. Senchi K, Matsunaga S, Hasegawa H, Kimura H, Ryo A. Front Microbiol Nov 26;4:346. doi: /fmicb ecollection Biotinylated-sortase self-cleavage purification (BISOP) method for cell-free produced proteins. Matsunaga S, Matsuoka K, Shimizu K, Endo Y, Sawasaki T. BMC Biotechnol Jun 4;10:42. doi: /

Untitled

Untitled 上原記念生命科学財団研究報告集, 23(2009) 149. サルエイズウイルスのヒトへの感染伝播を規定する宿主制御因子の解明武内寛明 Key words: エイズウイルス, 異種間感染, 感染症, 人畜共通感染症, 新興感染症東京大学医科学研究所感染症国際研究センター微生物学分野緒言ヒト後天性免疫不全症候群 ( ヒトエイズ ) は, ヒト免疫不全ウイルス (HIV) によって引き起こされる慢性持続感染症である.

Microsoft Word - 要旨_分子生体防御学 松永 docx

Microsoft Word - 要旨_分子生体防御学松永 docx