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1 : OlympusIX70 () IX70 IX70 ND

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3 n excitation filter emission filter CCD ND ND (neutral density) filter Excitation/Emission filter Dichroic mirror Excitation filter Dichroic mirror ND ND Emission filter CCD or CCD 3

4 顕微鏡と周辺機器の起動 n 電源をON (PC CCDカメラ電源 IX70顕微鏡 顕微鏡 水銀ランプ) CCDカメラと水銀ランプは安定するまでに10 分程度は時間がかかる 水銀ランプは一度つ けたら15分は消さないこと また 一度消し たら10分はつけないこと 水銀ランプは寿命 CCDカメラ とその電源 があるので消し忘れに注意 n ログイン Administrator パスワードなし 水銀ランプ n MetaMorphを起動 CCDカメラが起動されてないないと 警告が 出る 解析だけで撮像しないのであればCCD カメラの電源はつける必要はない n デスクトップの個人フォルダ内に フォルダを作成しておく p 顕微鏡の電源は本体右裏側 p CCDカメラの電源は後ろの黒いbox データ管理方法の一例 日付_実験名 (e.g., _NPC1-GFP-ExpressionCheck) フォルダ内にサンプルごとにフォルダを作成 し その中に同じサンプル由来の画像を保存 (個々のファイル名は手動では入力しない) PC本体 4

5 サンプルをステージにセット n サンプルに合わせたステージ台 アダプターを選び サンプルをセット 3.5cm dish / IWAKI Glass-bottom dish 広穴金属ステージ + 3.5cm dishアダプター あるいは 金属ステージなしで3.5cm dishアダプター を使用する 狭穴金属ステージを用いても良いが 対物レンズを変える際 などにレンズが金属ステージと当たりやすいことに注意 96-well plate (glass-bottom EzView etc.) 狭穴金属ステージ を使用する 金属ステージなしや広穴 金属ステージを用いた場合 96-well plateの端のwellを見る 広穴金属ステージ 狭穴金属ステージ 際 プレートの端がステージに乗らず安定しない Other dishes (10cm dish / screw cap flask) 狭穴金属ステージのみを使用 撮像位置を動かすのに手で dishを動かすことになるので 細かい位置調整は難しい Slide glass (with cover glass) チャンバースライド (スライドガラスに取り外し可能なwellが 固定されたもので カバーガラスをのせて使用するもの)やカ バーガラス上で細胞培養した場合 (スライドガラスにのせて使 3.5cm dishアダプター 用) 狭穴 広穴金属ステージとスライドガラス用のアダプ ターを使用 5

6 明視野 (位相差) 観察 n まずは低倍率 (x4やx10)でピントを合わせる 高倍率になればなるほどピントは合わせにくいので 低倍率で合わせてから高倍率レンズに変える n 明視野照明は左手前のスライダー スイッチで調節 ON/OFF可能 スライダーで光量0から最大まで調節可能 蛍光撮影時など 一時的に照明を落としたい場合は スライダーの 上のLight OFFスイッチを押すと消せる もう一度押すと付く このスイッチを使うと 照明の明るさを変えず にON/OFFできる OFFではスイッチが点灯する (暗い蛍光観察時にもみえるように) 6

7 n ( ) BF / PhL / Ph1 / Ph2 # BF: Phase Contrast Immersion UPlanFl 4x 0.13 PhL UlanFl 10x 0.3 Ph1 LCPlanFl 20x 0.4 Ph1 LCPlanFl 40x 0.6 Ph2 LUCPlanFL N 60x 0.7 Ph2 PlanApo 100x 1.4 Ph2 Oil 7

8 n ( ) () 0.17mm (IWAKI )96-well 1.5mm 24-well 1.3mm 6-well/12-well 1.2mm Phase Contrast Immersion UPlanFl 4x 0.13 PhL UlanFl 10x 0.3 Ph1 LCPlanFl 20x 0.4 Ph1 LCPlanFl 40x 0.6 Ph2 LUCPlanFL N 60x 0.7 Ph2 PlanApo 100x 1.4 Ph2 Oil OK 8

9 光路の切り替え (CCDカメラ / 目 / フィルムカメラ) n 対物レンズから入った光をCCDカメラ側で検出するか 目(接眼レンズ)で見るか フィルム カメラ側で検出するかを手動で切り替える必要がある 1. 目で見る場合は 接眼レンズ側の光路を使用 2. 撮影する場合は CCD側の光路へ切り替える 3. 接眼レンズとフィルムカメラ側の光路は現在使用していない 右側面の光路切り替えスイッチ CCDカメラ 接眼レンズ 接眼レンズと フィルムカメラ 9

10 ( ) n OK n 10

11 n ON/OFF () n 4 BlueGreen NIBA GreenRed WIG UVBlue NUAbroad UV BlueWU Open Close NIBA WIG NUA WU Excitation nm nm nm nm band pass filter band pass band pass band pass Emission nm 580nm < nm 420nm < band pass long pass band pass long pass Examples FITC (fluorescein) TRITC DAPI DAPI GFP rhodamine Hoechst Hoechst PI filipin 11

12 ND n ND ND(neutral density) Alexa GFP Dansyl NBD Show Live Show Live CCD n ND ND ND 3ND25 25% ND50 ND10 ND5 n ND ND ND ND (ND25) ND ( ) ND 12

13 n (100x) immersion oil () ( ) (Olympus) ( oil ) immersion oil n ( OK) Whatman 105Hyper Clean 6310 ( ) () 13

14 MetaMorph n Exposure Time 100ms-200ms ms Saturation AutoExpose n Show Live Live CCD n Binning / Live Bin Binning CCD (1392 x 1040 pixels) () Binning 2x2 2x2 4 1 S/N () binning 1Live Bin 2-3 Show Live (>500ms) 14

15 MetaMorph Autoscale n Display Autoscale Show Live Acquire Autoscale ( ) Show Live () Lo% Hi% saturation 15

16 (16-bit tiff) n Image: Specified (..) n Specify Image Name (4) (5) (1) (2) Acquire n Acquire ( ) acquired-2.tif acquired- 11.tif (acquired-1 > acquired-10 > acquired-11 > acquired-2 > acquired-3 ) n Save (3) 16

17 MetaMorph (16-bit tiff) n Save w/sequence Save.. Set Save (6) (7) (1) (2) n Set Save C:/Documents and Settings/Administrator/Desktop/( )/(_ )/() Image0011 Image001.tif 2 Image002.tif (3) (5) n AcquireSave SaveAcquire Acquire * Acquire Acquire Save Image001 Image001.tif Image002.tif Image003.tif (4) 17

18 8-bit TIFF n () n Display > Scale Image 8-bit Copy Range Image Min/Max AutoScale n 16-bit TIFF 8-bit TIFF 18

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