122 第3 章分子遺伝学の手技と遺伝子異常の解析第 B FISH 法造血器腫瘍の診療における組織 FISH 法 1 はじめに日常臨床では, 造血器腫瘍の染色体分析法として, 染色体分染法 (G- 染色法 ) や FISH(fluorescence in situ hybridization) 法

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ゆいとふじがわ
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1 第3 章分子遺伝学の手技と遺伝子異常の解析第 FISH 法造血器腫瘍の診療における組織 FISH 法 1 はじめに日常臨床では, 造血器腫瘍の染色体分析法として, 染色体分染法 (G- 染色法 ) や FISH(fluorescence in situ hybridization) 法が広く行われている染色体分染法は, すべての染色体を検索対象として, 数的もし

(tissue-fish, 組織 FISH 法 ) 1), 報告してきた -8) 本項では組織 FISH 法の手順と, 造血器腫瘍への応用について概説する 3 章松本洋典 1) 組織 FISH 法の手順 1 標本の作製パラフィン包埋された組織ブロックを 4~6μm で薄切し, 湯伸ばしした後, シランコートされたスライドガラス上に展開する標本がのったスライドガラスは 37

蒸留水で 1 分間洗浄後, SSC/0 05%Tween 0 で 5 分間洗浄 7. 37 の 0 05mg/mL proteinase K/1 TEN buffer に 5~15 分間浸透 8. SSC/0 05%Tween 0 で 5 分間洗浄 9. 10% ホルマリンに 10 分間浸透 10. SSC/0 05%Tween 0 で 5 分間洗浄 11.

2 1 第3 章分子遺伝学の手技と遺伝子異常の解析第 FISH 法造血器腫瘍の診療における組織 FISH 法 1 はじめに日常臨床では, 造血器腫瘍の染色体分析法として, 染色体分染法 (G- 染色法 ) や FISH(fluorescence in situ hybridization) 法が広く行われている染色体分染法は, すべての染色体を検索対象として, 数的もしくは構造異常の検出に用いられる一方, 反復配列プローブや位置特異的プローブを用いた FISH 法は, 数的異常や転座, 逆位, 挿入, 欠失などある特定の染色体, 遺伝子異常の有無だけを検出するものである FISH 法は, 従来, カルノア固定した標本に行われていたが, 当科では特に造血器腫瘍のホルマリン固定, パラフィン包埋した病理組織標本切片に対して FISH 法を応用し (tissue-fish, 組織 FISH 法 ) 1), 報告してきた -8) 本項では組織 FISH 法の手順と, 造血器腫瘍への応用について概説する 3 章松本洋典 1) 組織 FISH 法の手順 1 標本の作製パラフィン包埋された組織ブロックを 4~6μm で薄切し, 湯伸ばしした後, シランコートされたスライドガラス上に展開する標本がのったスライドガラスは 37 で一晩乾燥させる検体の前処理 % キシレンに 10 分間ずつ 3 回浸透し脱パラフィン. 100%,85%,70% エタノールに 5 分ずつ浸透し脱水後, 蒸留水で 5 分間洗浄 3. 0 M HCl に 0 分間浸透 4. 蒸留水に浸透後, SSC/0 05%Tween 0 で 5 分間洗浄の SSC に 0 分間浸透 6. 蒸留水で 1 分間洗浄後, SSC/0 05%Tween 0 で 5 分間洗浄の 0 05mg/mL proteinase K/1 TEN buffer に 5~15 分間浸透 8. SSC/0 05%Tween 0 で 5 分間洗浄 9. 10% ホルマリンに 10 分間浸透 10. SSC/0 05%Tween 0 で 5 分間洗浄の変性溶液 (0 SSC 10mL, ホルムアミド 35mL, 蒸留水 5mL) に 5 分間浸透 1. 70%,85%,100% エタノールに分ずつ浸透し脱水後, 風乾 3 N プローブの処理市販プローブの場合, 遮光の上, プローブ 0 5μL/ バッファー 7μL/ 蒸留水 5μL を 73 の恒温槽で 5 分,37 で 0~30 分処理以後の処理はすべて遮光で行う 4 ハイブリダイゼーション 1. プローブをの風乾後の標本上に滴下し, プローブの乾燥を防止するため 4 4mm のカバーガラスで覆い,90 のホットプレートに 10 分間のせる. 湿潤箱に入れ,4 で一晩インキュベートする 5 洗浄 1. 4 の SSC に 10 分間浸透カバーガラスをつけたまま浸し, カバーガラスが自身の重さで滑り落ちるようにするつ回洗浄 3. 4 の SSC で 5 分間洗浄 4. SSC で 4' 6-diamidino--phenylindole (PI) を 0 03μg/mL に調節し,37 で 3 分間浸透 5. 蒸留水で速やかに洗浄後, 暗所で風乾 6. ベクタシールドでカバー 6 蛍光顕微鏡で観察,CC カメラで撮影 3 組織 FISH 法の特徴 1. 組織内での腫瘍の同定 ( 図 1) single cell preparation を用いた従来の FISH 法では, 染色体異常を有する腫瘍が組織上にどのように位置するかの情報は得られなかった一方, 組図 1 C 織 FISH 法では PI 染色像によって病理組織形態を観察することができる場合があり, その際には染色体異常を有するの組織上での位置, 局在の情報を得ることができるまた, ヘマトキシリン - エオジン (HE) 染色や免疫組織化学との対比も可能である ). 微小な検体での検討 ( 図, 3) 消化管病変の生検検体や針生検検体では染色体検査は困難であることが多いが, 組織 FISH 法はこのような微小な検体にも適用可能である 1,3-7) 3. 古い病理組織標本への適用 N は安定な物質であり, 数年前に作成されたパラフィン包埋組織ブロックであっても, 薄切切片を作製することにより組織 FISH 法の適用が可能である ) HE 染色 () で認められる濾胞構造が PI 染色 () でも確認できる組織 FISH 法 (C) では濾胞内の腫瘍に 14q3 上の IGH (SpectrumGreen) と 18q1 上の CL(SpectrumOrange) の融合シグナルを認める (LSI CL/IGH ual-color,ual-fusion Translocation Probe,Vysis) FISH 法造血器腫瘍の診療におけ. 4 の50% ホルムアミド / SSCで5 分間ずる組織FISH 法13

3 46 第8 章リンパ系腫瘍の診断と治療予後因子 1 粘膜関連リンパ組織型辺縁帯リンパ腫 (extranodal marginal zone -cell lymphoma of mucosaassociated lymphoid tissue) 頻度発生母地 ( 起源ならびに分子生物学的特徴 ) 8.5% post-gc, 辺縁帯節性辺縁帯リンパ腫 (nodal marginal zone -cell lymphoma) 小児節性濾胞辺縁帯リンパ腫 (pediatric nodal marginal zone 1.0% post-gc, 辺縁帯 lymphoma) * 濾胞性リンパ腫 (follicular lymphoma) in situ 濾胞性腫瘍 (in situ follicular neoplasia) * 6.7% 濾胞中心十二指腸型濾胞性リンパ腫 (duodenal-type follicular lymphoma) * 小児型濾胞性リンパ腫 (pediatric-type follicular lymphoma) * IRF4 再構成を伴う大型リンパ腫 (large -cell lymphoma with IRF4 rearrangement) * 原発性皮膚濾胞中心リンパ腫 (primary cutaneous follicle center lymphoma) CL- 蛋白の発現はみられないことが多い GC IG/IRF4 再構成,CL-6 再構成しかし CL- 再構成はない IRF4/MUM1 の強い発現濾胞中心由来マントルリンパ腫 (mantle cell lymphoma) in situ マントル腫瘍 (mantle cell neoplasia) *.8% マントル層内側のびまん性大型リンパ腫, 非特異型 (LCL,NOS) 濾胞中心型 (germinal center -cell type) * 活性化型 (activated -cell type) * T 組織球豊富型大型リンパ腫 (T cell/histiocyte-rich large -cell lymphoma) 中枢神経原発 LCL(primary LCL of CNS) 皮膚原発 LCL, 足型 (primary cutaneous LCL,leg type) EV 陽性 LCL, 非特定 (EV positive LCL,NOS) EV + mucocutaneous ulcer * 慢性炎症関連びまん性大型リンパ腫 (LCL associated with chronic inflammation) リンパ腫様肉芽腫症 (lymphomatoid granulomatosis) 原発性縦隔大型リンパ腫 primary mediastinal (thymic)large -cell lymphoma 33.3%# 0.3% GC /post-gc( 活性化 ) non-gc 型の 30% では MY88L65P 変異がみられる GC 活性化 post-gc EV により形質転換した成熟 EV により形質転換した late/post-gc EV により形質転換した成熟 0.3% 胸腺髄質ステロイド (I + ) 血管内大型リンパ腫 (intravascular large -cell lymphoma) 0.1% 形質転換した成熟 LK 陽性大型リンパ腫 (LK positive large -cell lymphoma) 形質芽性リンパ腫 (plasmablastic lymphoma) HHV8 関連多中心性キャスルマン病起因大型リンパ腫 (large -cell lymphoma arising in HHV8-associated multicentric Castleman disease) 原発性滲出液リンパ腫 (primary effusion lymphoma;pel) HHV8 陽性 LCL, 非特定 (HHV8 positive LCL,NOS) * 形質へ分化を示す post-gc 形質芽球, 形質へ分化した芽球性 naive post-gc 頻度バーキットリンパ腫 (urkitt lymphoma;l) 1.0% 11q 染色体異常を伴うバーキット様リンパ腫 (urkitt-like lymphoma with 11q aberration) * high grade -cell lymphoma,with MYC and CL- and/or CL-6 rearrangements * high grade -cell lymphoma,nos * LCL と古典的ホジキンリンパ腫の中間型特徴を有する分類不能リンパ腫 (-cell lymphoma,unclassifiable,with features intermediate between diffuse large -cell lymphoma and classical HL ) 成熟 T および NK 腫瘍 (mature T-cell and NK-cell neoplasms) 4.9% T 前リンパ球性白血病 (T-cell prolymphocytic leukemia) 1.7% T 大顆粒リンパ球性白血病 (T-cell large granular lymphocytic leukemia) 慢性 NK 増加症 (chronic lymphoproliferative disorders of NK cells) アグレッシブ NK 白血病 (aggressive NK-cell leukemia) 小児全身性 EV 陽性 T 性リンパ増殖症 (systemic EV + T-cell lymphoma of childhood) 種痘様水疱症様リンパ腫 (hydroa vacciforme-like lymphoma) 発生母地 ( 起源ならびに分子生物学的特徴 ) GC /post-gc TCF3または I3 変異がsporadic/immunodeficiency related typeの70% にみられる縦隔に生じる場合は胸腺類似その他の部位は様々な分化段階の成熟 (post thymic)t, 胸腺皮質 T と末梢血 T の中間の分化段階多くは C8 陽性 T, 一部 γδt 成熟 NK 成熟 NK 多くは傷害性 C8 陽性 T, または活性型 C4 陽性 T 皮膚親和性傷害性 T, 稀に NK 成人 T 白血病 / リンパ腫 (adult T-cell leukemia/lymphoma) 7.5% C4 陽性 T, 特に regulatory T 節外性鼻型 NK/T リンパ腫 (extra nodal NK/T-cell lymphoma,nasal type) monomorphic epitheliotropic intestinal T-cell lymphoma * indolent T-cell lymphoproliferative disorder of the GI tract *.6% 活性化 NK, 稀に傷害性 T 腸管症型 T リンパ腫 (enteropathy-type T-cell lymphoma) 0.3% 腸管上皮内 T 肝脾 T リンパ腫 (hepatosplenic T-cell lymphoma) 皮下脂肪組織炎様 T リンパ腫 (subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma) 自然免疫系成熟 γδ, 稀に αβ 傷害性 T 成熟傷害性 αβt 菌状息肉症 (mycosis fungoides) 1.% 成熟皮膚親和性 C4 陽性 T セザリー症候群 (Sézary syndrome) 原発性皮膚 C30 陽性 T リンパ増殖異常症 (primary cutaneous C30 positive T-cell lymphoproliferative disorders) 皮膚原発 γδt リンパ腫 (primary cutaneous gamma-delta T-cell lymphoma) 皮膚原発 C8 陽性進行性表皮向性傷害性 T リンパ腫 (primary cutaneous C8-positive aggressive epidermotropic cytotoxic T-cell lymphoma) 成熟皮膚親和性 C4 陽性 T 0.3% 活性化皮膚親和性 T 傷害性機能を有する成熟 γδt 皮膚親和性 C8 陽性傷害性 αβt 1 リンパ球系腫瘍総論463

470 第8 章リンパ系腫瘍の診断と治療予後因子実際にはこれらの特徴が混じり合った中間的な形態を持つものが多く, これらの特徴をスコア化することにより分類が行われていたしかし, これらの形態的な特徴は,L3 にバーキット型 LL が多いという以外は,

悪性リンパ腫に分類されているしたがって, 形態による -LL と T-LL の鑑別, あるいは CR-L などの特定の遺伝子異常を持つ LL を鑑別することは困難である表 1 WHO LL LL CR-L1 を伴う -LL/LL MLL 再構成を伴う

芽球の表面抗原による分類と WHO 分類である表面抗原による分類では,-LL では通常 HL-R,C19, C79a が陽性で, これを C10, 内 μ 鎖, 細胞表面 IgM の発現などの発現状態により pro- LL (early

pre--ll の形質を示すのが特徴的である ( 表 1) 表面抗原 C19 C79a C10 C0 Cyμ Smlg TdT pro- LL + + + common LL + + + +/ + pre- LL + + + + + + WHO

) C19 +,C10 +,C13 +,C33 + L キナーゼの恒常的活性化による増殖刺激 t(v;11q3) C19 +,C10 MLL 融合蛋白によるヒストンメチル化の異常による遺伝子発現の変化 t(1;1)(p13;q) C19 +,C10 +,C34

3) C19 +,C10 +,Cyμ + 転写因子 PX1 と E( リンパ球分化を制御 ) の異常による分化障害 *1 典型的な場合, * 判明している主なもの, *3 典型的には 45 未満 C : は小型で大きさは均一 N/C 比が高く,

4 470 第8 章リンパ系腫瘍の診断と治療予後因子実際にはこれらの特徴が混じり合った中間的な形態を持つものが多く, これらの特徴をスコア化することにより分類が行われていたしかし, これらの形態的な特徴は,L3 にバーキット型 LL が多いという以外は, 表面抗原による分類とも, 白血病の持つ遺伝子異常の種類とも, あるいは臨床病態ともほとんど相関を持たず, 形態の分類という以上の意味を持たないまた,L3 に多く認められるバーキット型 LL は, 現在ではバーキットリンパ腫の白血化ととらえられており, 悪性リンパ腫に分類されているしたがって, 形態による -LL と T-LL の鑑別, あるいは CR-L などの特定の遺伝子異常を持つ LL を鑑別することは困難である表 1 WHO LL LL CR-L1 を伴う -LL/LL MLL 再構成を伴う -LL/LL TEL-ML1 を伴う -LL/LL 高二倍体性 -LL/LL 低二倍体性 -LL/LL IL- 3-IgH を伴う -LL/LL E-PX1 を伴う -LL/LL 染色体異常表 LL 4 *1 表面抗原分類 LL の分類で汎用されるのは, 芽球の表面抗原による分類と WHO 分類である表面抗原による分類では,-LL では通常 HL-R,C19, C79a が陽性で, これを C10, 内 μ 鎖, 細胞表面 IgM の発現などの発現状態により pro- LL (early precursor--ll),common LL,pre- LL に分類する terminal doxytransferase(tdt) は原則陽性となる ( 表 ) MLL 再構成を伴う -LL は pro--ll の形質を示し,E-PX1 を伴う -LL は pre--ll の形質を示すのが特徴的である ( 表 1) 表面抗原 C19 C79a C10 C0 Cyμ Smlg TdT pro- LL common LL / + pre- LL WHO 分類は現在の造血器腫瘍分類の標準であり, 白血病, 悪性リンパ腫などを含めた造血器腫瘍全体 * 分子病態 t(9;)(q34;q11.) C19 +,C10 +,C13 +,C33 + L キナーゼの恒常的活性化による増殖刺激 t(v;11q3) C19 +,C10 MLL 融合蛋白によるヒストンメチル化の異常による遺伝子発現の変化 t(1;1)(p13;q) C19 +,C10 +,C34 +,C0 転写因子 ML1( 造血系分化を抑制 ) の阻害による分化障害染色体数染色体数 <45 *3 t(5;14)(q31;q3) C19 +,C10 + t(1;19)(q3;p13.3) C19 +,C10 +,Cyμ + 転写因子 PX1 と E( リンパ球分化を制御 ) の異常による分化障害 *1 典型的な場合, * 判明している主なもの, *3 典型的には 45 未満 C : は小型で大きさは均一 N/C 比が高く, 質はほとんど認められない核小体は不明瞭 : は小中型で大きさが不均一 N/C 比は比較的低く, 質は好塩基性核小体が明瞭 C: は中大型で不均一質は好塩基性で空胞を持つものもある核小体は不明瞭なものと明瞭なものが混在 : と同一症例の MPO 染色図 CR-L LL : は中大型で N/C 比はやや低く, 質は好塩基性核小体は明瞭 : は小大型で大きさが不均一 N/C 比が低いものが多く, 核は不整形で質は灰白色核小体は不明瞭なものが多い性腫瘍1 急性リンパ芽球性白血病図 1 LL 471

5 804 第1 章造血幹移植免疫療法第 1 章急性白血病に対する同種造血幹移植 1 はじめに近年における様々な分子標的薬や抗体医薬品の開発にもかかわらず急性白血病に対する化学療法の成績は劇的な向上を認めるには至っていない一方で, 中高年期人口の増加に伴い, 急性白血病の発症者数は経年的に増加しており, 急性白血病を根治に導きうる治療法として, あらためて同種造血幹移植 (allogeneic hematopoietic cell transplantation;allo- HCT) の役割が見直されている移植前処置と幹ソースの多様化に伴い, 現在ではほぼすべての症例に対して必要であれば移植を考慮することが可能となっており, 最近のわが国では, 急性骨髄性白血病 (acute myeloid leukemia;ml) および急性リンパ性白血病 (acute lymphoblastic leukemia;ll) に対して, それぞれ年間件および 500 件前後の allo- HCT が行われている本項では主に成人の ML および LL に対する allo-hct における未解決の課題とその解決に向けた展望をいくつかのクリニカルクエスチョンの形で概観するなお, 適切な幹ソースの選択基準や小児の急性白血病に対する allo-hct の意義については他項を参照されたい初回寛解期急性白血病に対する移植適応はどのように決定すべきか? 急性白血病に対する移植適応を検討する際には, 白血病自体の生物学的特徴だけではなく, 患者自身の身体的因子や社会的背景の十分な評価が重要であり, 前者は主に再発死亡のリスク, 後者は非再発死亡のリスクに強く関連している特に, 初回寛解期 (CR1) での移植の実施にあたっては, 現在の医学的水準ではその対象者から化学療法で治癒している症例を除外することが困難であるため, できる限り治療関連死亡のリスクを最小化する努力が必要であり, 適切な移植適応の判断にはしばしば困難が伴う一戸辰夫, 大島久美そのような観点から, 最近 ELN(European Leukemia Net) は,CR1 の ML に対する移植適応に関して, 表 1 のような統合的評価システムを提唱している 1,) この評価システムでは, まず ML としての生物学的なリスクを白血病が有する染色体核型と遺伝子異常に基づき good,intermediate poor,very poor の 4 段階に分類し, それに並行して EMT(European Group for lood and Marrow Transplantation) スコアと HCT-CI(hematopoietic cell transplantation-specific comorbidity index) を用いて非再発死亡のリスクを同様に 4 段階に評価するそして, それらを用いて allo-hct を行った場合の生存率を推定し, 化学療法または自家移植を行った場合よりも 10% 程度の上乗せが期待できる場合,CR1 での allo-hct の積極的な適応と判断しようとするものである近年 ML においては次世代シーケンサー (next generation sequencing; NGS) によるゲノム解析がほぼ終了し, 遺伝子レベルでの分類が進んでいることをふまえ, この ELN の評価システムでは, 従来の染色体異常に基づくリスク分類を一部踏襲しながら, 比較的良好な予後に関連する遺伝子として NPM1 と CEP, 予後不良に関連する遺伝子として FLT3,EVI1,RUNX1,SXL1, TP53 を組み込んだ新たなの層別化が採用されて表 1 ELN CR1 ML リスクグループ good intermediate poor very poor 診断時および CR 到達時のリスク評価 t(8;1)/ml1-eto で WC 0,000µL inv16/t(16;16)/cf-myh11 CEP の両アレル変異 FLT3-IT 変異陰性で NPM1 変異陽性正常核型 ( X Y 含む ) かつ WC 100,000/µL かつ CRe t(8;1)/ml1-eto で WC>0,000/ µl あるいは KIT 変異陽性正常核型 ( X Y 含む ) かつ WC 100,000/µL かつ CRe t(8;1)/ml1-etoでwc>0,000/ µl(kit 変異陽性陰性 ) 正常核型 ( X Y 含む ) かつ WC 100,000/µL かつ not CRe 正常核型 ( X Y 含む ) かつ WC> 100,000/µL CF MK 3q6 関連以外の異常核型でEvi-1 発現亢進なし MK 3q6 関連異常 CF 以外の異常核型で Evi-1 発現亢進あり CF 以外の異常核型で p53,runx1, SXL1 いずれかの変異あるいは FLT3- IT の両アレル変異 (FLT3-IT/ FLT3wt 比 >0.6) あり CR1 では allo-hct の適応とならないとされてきた t(8;1) 転座関連 ML に関しても, 初診時の白血球数 (0 000/μL 以上 ),KIT 遺伝子変異の有無, 化学療法サイクル終了時の微小残存病変 (minimal residual disease;mr) の有無に基づき, 再発リスサイクル治療終了後の MR 地固め治療法別の再発リスク化学療法または自家移植同種移植非再発死亡の予測スコア EMT スコア HCT-CI スコアクを 3 段階に評価している点が挙げられる NRM + または N N < または + または <30 + または > <40 WC;white blood cell count,cep;gene ecoding CCT/enhancer binding protein alpha,flt3;gene encoding fms-like tyrosine kinase receptor 3,IT;internal tandem duplication,npm1;gene encoding nucleophosmin,cre; complete remission after one cycle of induction therapy,cf;core binding factor,mk;monosomal karyotype,evi-1; MS1 and EVI1 complex locus protein,mr;minimal residual disease,emt;european Group for lood and Marrow Transplantation,N;not advocated,hct-ci;hematopoietic cell transplantation-specific comorbidity index,nrm;nonrelapse mortality 注 : 正常核型には X 染色体あるいは Y 染色体の単独欠損例も含む ( 文献より引用改変 ) LL に関しては, 十分にコンセンサスの得られている移植適応の評価システムは公表されていないが, 表に示すような予後不良因子が提唱されている 3,4) 前駆型 LL(-cell precursor LL;CP- LL) における予後不良因子としての IKZF1 遺伝子変急性白血病に対する同種造血幹移植いるまた, 特筆すべきこととして, これまで通常 805

小児の難治性白血病を引き起こす MEF2D-BCL9 融合遺伝子を発見ポイント小児がんのなかでも最も頻度が高い急性リンパ性白血病を起こす新たな原因として MEF2D-BCL9 融合遺伝子を発見しました MEF2D-BCL9 融合遺伝子は治療中に再発する難治性の白血病を引き起こしますが新しい

平成 28 年 8 月 9 日小児の難治性白血病を引き起こす MEF2D-BCL9 融合遺伝子を発見名古屋大学大学院医学系研究科 ( 研究科長髙橋雅英 ) 小児科学の小島勢二 ( こじませいじ ) 名誉教授村松秀城 ( むらまつひでき ) 助教鈴木喬悟 ( すずききょうご ) 大学院生名古屋大学医学部附属病院先端医療臨床研究支援センターの奥野友介 ( おくのゆうすけ ) 特任講師らの研究グループは

122 第3 章分子遺伝学の手技と遺伝子異常の解析第 B FISH 法造血器腫瘍の診療における組織 FISH 法 1 はじめに 日常臨床では, 造血器腫瘍の染色体分析法として, 染色体分染法 (G- 染色法 ) や FISH(fluorescence in situ hybridization) 法

122 第3 章分子遺伝学の手技と遺伝子異常の解析第 B FISH 法造血器腫瘍の診療における組織 FISH 法 1 はじめに日常臨床では, 造血器腫瘍の染色体分析法として, 染色体分染法 (G- 染色法 ) や FISH(fluorescence in situ hybridization) 法