小関修正版0705
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- こうた かつもと
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1 研 究 課 題 の 概 要 研 究 課 題 名 予 測 微 生 物 学 的 解 析 手 法 を 用 いた 微 生 物 学 的 リスク 評 価 システムの 開 発 主 任 研 究 者 所 属 機 関 小 関 成 樹 ( 独 ) 農 業 食 品 産 業 技 術 総 合 研 究 機 構 食 品 総 合 研 究 所 研 究 成 果 の 概 要 食 品 における 微 生 物 学 的 リスク 評 価 を 効 率 的 効 果 的 に 行 うための 支 援 システ ムを 開 発 し 論 文 化 の 上 公 開 した 具 体 的 には リスク 評 価 に 必 要 不 可 欠 な 各 種 の 食 中 毒 菌 挙 動 を 効 率 的 かつ 確 実 に 検 索 収 集 可 能 とする 従 来 にない 操 作 性 と 検 索 容 易 性 を 備 えたデータベース(Microbial Responses Viewer, MRV)を 開 発 した また 食 中 毒 菌 を 食 事 とともに 摂 食 した 場 合 の 胃 内 における 食 中 毒 菌 の 死 滅 を 予 測 するシミュレータを 開 発 した さらに 実 際 の 食 品 ( 鶏 挽 肉 とマグロす き 身 )における 食 中 毒 菌 の 種 々の 保 存 温 度 における 詳 細 な 増 殖 挙 動 データを 蓄 積 し それらを 元 にして 数 理 モデルを 構 築 した 開 発 したモデルによって 変 動 温 度 環 境 下 における 食 中 毒 菌 数 および 食 品 常 在 菌 数 の 同 時 予 測 と 予 測 菌 数 の 取 り 得 る 確 率 分 布 の 推 定 を 可 能 とした これらのデータベースと 予 測 モデルとの 連 携 は 効 率 的 かつ 適 切 なリスク 評 価 の 遂 行 に 資 する 評 価 所 見 食 中 毒 のリスク 評 価 を 行 うためのデータベース 並 びにシュミレーションモデルの 開 発 に 成 功 した 胃 内 の 細 菌 の 挙 動 をシュミレートできるモデルは 食 中 毒 の 基 礎 データとして 有 用 である 食 中 毒 菌 の 食 品 中 や 体 内 での 挙 動 の 予 測 に 活 用 で きると 思 われる 評 価 結 果 目 標 を 達 成 した
2 0705 Microbial Resp onses Viewer, MRV 1
3 ( 1921 ) ( 0705)
4 7 6 (a) L. monocytogenes Time (h) Time (h) 1-1 L. monocytogenes ( ) Natural flora() ( ) ---- ph 1-2 3
5 2 ComBase ( Microbial Responses Viewer (MRV) ( MRV 1-3 Microbial Responses Viewer (MRV) ComBase ph ph 4
6 3 Salmonella 1-4, L. monocytogenes ( )( ) A: B: 1-5 L. monocytogenes natural flora 5 : natural flora 10 2 CFU/g L. monocytogenes : natural flora 10 4 CFU/g L. monocytogenes : natural flora 10 6 CFU/g L. monocytogenes : natural flora 10 2 CFU/g : natural flora 10 4 CFU/g : natural flora 10 6 CFU/g 5
7 ComBase ComBase ComBase 2-1 ph L. monocytogenes ph web Combase UK, Food Research Institute, USDA, Eastern Regional Research Center, Australian Food Safety Centre of Excellence ComBase 1 PCR 6
8 PCR (Fujikawa et al., J. Food Hyg. Japan, 47, ,2006) Salmonella Enteritidis Percoll (EEM) inv A PCR Ct Ct EEM Ct L. monocytogenes L. monocytogenes L. monocytogenes L. monocytogenes 2-3 L. monocytogenes 20 C L. monocytogenes
9 MRV (Microbial Responses Viewer) ComBase ComBase MRV Microbial Responses Viewer, MRV 16 ph, 2-4 MRV MRV 2-4 E. coli O157:H7 < E. coli O157:H7 1 PCR -20 8
10 30 12 Salmonella Enteritidis CFU/g (2 ) ( ) DHL ( ) DHL PCR O Salmonella C : : : : CFU/g CFU/g Listeria monocytogenes L. monocytogenes Natural flora 2ºC 5 ºC 10 ºC 15 ºC 20ºC 25ºC 30 ºC L. monocytogenes 1.5%NaCl TSA L. monocytogenes PALCAM (MERCK) L. monocytogenes 48 5 ºC 2-7 natural flora 6 L. monocytogenes 5 log CFU/g 4 6 log cfu/g 2 7log CFU/g 8log CFU/g natural flora L. 2-7 L. monocytogenes natural flora 5 : natural flora 10 2 CFU/g L. monocytogenes : natural flora 10 4 CFU/g L. monocytogenes : natural flora 10 6 CFU/g L. monocytogenes : natural flora 10 2 CFU/g : natural flora 10 4 CFU/g : natural flora 10 6 CFU/g monocytogenes L. monocytogenes 9
11 5 ºC L. monocytogenes natural flora 20 C natural flora MRV (Microbial Responses Viewer) ComBase ( Microbial Responses Viewer (MRV) ( MRV ComBase (ver. 4) C log Ratkowsky MRV ( ph ph
12 2-8 MRV L. monocytogenes 3 11
13 H20 L. monocytogenes 2-10 σ 2 τ Markov Chain Monte Carlo (MCMC), APC ~ Poisson (mean.apc) APC Natural flora conc.apc ln.apc mean.apc = exp(ln.apc) / conc.apc ln.apc ln.apc ~ N (xa, τ 2 A ) xa Natural flora 12
14 (ln CFU/g) τ 2 A. L. monocytogenes LM ~ Poisson (mean.lm) mean.lm = exp(ln.lm) / conc.lm ln.lm ~ N (xl, τ 2 L ) ln.lm xl L. monocytogenes (ln CFU/g) L. monocytogenes (ln CFU/g) xa xl mean.xa mean.xl σ 2 A σ 2 L xa ~ N (mean.xa, σ 2 A ) xl ~ N (mean.xl, σ 2 L ) mean.xa mean.xl (1) (2) t, Temp, xa.max, xl.max, and xl.x0 (h), ( C), natural flora (ln CFU/g), L. monocytogenes (ln CFU/g), L. monocytogenes (ln CFU/g) pa[i] pl[i] MCMC Gibbs R2WinBUGS package (Sturtz et al., 2005) WinBUGS (Lunn et al., 2000) R (R Development Core Team, 2008) 13
15 L. monocytogenes Natural flora (a) L. monocytogenes 10 (b) Natural flora Prediction (log 10 CFU/g) Prediction (log 10 CFU/g) 2-11 (a) L. monocytogenes (b) Natural flora Baranyi-Ratkowsky model 7 (a) Bayesian modeling 20 7 (b) Conventional modeling Time (h) Time (h) 2-12 L. monocytogenes ( ) Natural flora ( ) (a) New Bayesian State Space model, (b) Conventional Baranyi model 14
16 7 (a) L. monocytogenes Time (h) Time (h) 2-13 L. monocytogenes ( ) Natural flora ( ) ) 2-14 The Key Events Dose-Response Framework 15
17 30 ml 37 ph ph E. coli O157:H7 Salmonella L. monocytogenes ND ND Time (h) Time (h) E. coli - ph Lm -ph Sal- ph ph 10 2 ~10 3 CFU/g 1 ph ph 2.5 ph ph L. monocytogenes E. coli O157:H7 ph L. monocytogenes E. coli O157:H7 Salmonella ph (~2.5) ph LM L. monocytogenes E. O157 coli O157:H7 Salmonella spp ph 16
18 ph 1 ph ph USFDA ns/badbugbook/ucm htm PDF ph 2 ph ph 1.5, 40 ml ph = - log10 [H+] % 3 ph ph max ph 2 ph min ph 1.5 a ph ph x[t] <- x[t - 1] + Delta.time[t] * (p[1] * exp(p[2] * ph[t])) t p[1], p[2] MCMC 95 ph 3 ph 17
19 ph ph a 5 a = 0 a= 1 5 g CFU/g = CFU ph
20 Salmonella enterica serovar Enteritidis low-contaminated chicken high-contaminated chicken TSB CFU/g 10g 110ml standard plate counts (SPC) DHL XLD PCR O AM-7002 Fujikawa 2004, 2005 N t k N max N min m n Fujikawa and Kano 2009 k log
21 ( 2-19)
22 (A) (B)
23 (log ) (log ) A B A B Fujikawa, H., Kai, A., Morozumi S., A new logistic model for Escherichia coli at constant and dynamic temperatures. Food Microbiol. 21, Fujikawa, H., Morozumi, S., Modeling Surface Growth of Escherichia coli on Agar Plates. Appl. Environ. Microbiol. 71, Fujikawa, H., Kano, Y., Development of a program to fit data to a new logistic model for microbial growth. Biocont. Sci. 14,
24 in vitro Listeria monocytogenes ph ph g ph L. monocytogenes ( ) Buchanan The Key Events Dose-Response Framework 1) ( ) in vitro L. monocytogenes GAM 0.1%(w/v) 0.4% L. monocytogenes Scott-A CIP (Lm) (BHI) 30 C, 6-24h 10 9 cfu/ml BHI ml 3ml (n = 3) Lactobacillus acidophilus NBRC Enterococcus faecalis NBRC MRS broth 48h OD 660nm 2.0, 10 9 cfu/ml (OD660nm=2) Lm 0.3ml Lm E. faecalis Lb. acidophilus MRS broth Lm 37 C 24h PALCAM Lm 1) Lm 10 6 cfu/ml 37 24h 10 9 cfu/ml 10 4 cfu ( 2-24) Lm 23
25 cfu/ml 37 24h 2) MRS Lb. acidophilus E. faecalis 10 8 cfu/ml Lm 2-25 Lb. acidophilus Lm Lm E. faecalis Lm Lm ( 6h)( 12h) 2-25 Lactobacillus acidophilus Enterococcus faecalis Cont., ; Cult., ; Sup., ; Cell, 24
26 Lm Lm Lm Lb. acidophilus Ec. faecalis Lm 1) Buchanan, R.L. et al., The Key Events Dose-Response Framework: Its Potential for Application to Foodborne Pathogenic Microorganisms',Critical Reviews in Food Science and Nutrition,49:8,
27
28 3 1 2 ComBase ( Microbial Responses Viewer (MRV) ( 3 Salmonella, L. monocytogenes ComBase ComBase ComBase Combase UK, Food Research Institute, USDA, Eastern Regional Research Center, Australian Food Safety Centre of Excellence
29 ComBase (ver. 4) C log 2 26 ComBase Ratkowsky MRV ( ph ph MRV 28
30 ComBase ph ph L. monocytogenes H20 L. monocytogenes
31 σ 2 τ Markov Chain Monte Carlo (MCMC), APC ~ Poisson (mean.apc) APC Natural flora conc.apc ln.apc mean.apc = exp(ln.apc) / conc.apc ln.apc ln.apc ~ N (xa, τ 2 A ) xa Natural flora (ln CFU/g) τ 2 A. L. monocytogenes LM ~ Poisson (mean.lm) mean.lm = exp(ln.lm) / conc.lm ln.lm ~ N (xl, τ 2 L ) ln.lm xl L. monocytogenes (ln CFU/g) L. monocytogenes (ln CFU/g) xa xl mean.xa mean.xl σ 2 A σ 2 L xa ~ N (mean.xa, σ 2 A ) xl ~ N (mean.xl, σ 2 L ) mean.xa mean.xl (1) 30
32 (2) t, Temp, xa.max, xl.max, and xl.x0 (h), ( C), natural flora (ln CFU/g), L. monocytogenes (ln CFU/g), L. monocytogenes (ln CFU/g) pa[i] pl[i] MCMC Gibbs R2WinBUGS package (Sturtz et al., 2005) WinBUGS (Lunn et al., 2000) R (R Development Core Team, 2008) L. monocytogenes Natural flora (a) L. monocytogenes 10 (b) Natural flora Prediction (log 10 CFU/g) Prediction (log 10 CFU/g) 2 30 (a) L. monocytogenes (b) Natural flora 31
33 Baranyi-Ratkowsky model 7 (a) Bayesian modeling 20 7 (b) Conventional modeling Time (h) Time (h) 2-31 L. monocytogenes ( ) Natural flora ( ) (a) New Bayesian State Space model, (b) Conventional Baranyi model 7 (a) L. monocytogenes Time (h) Time (h) 2-32 L. monocytogenes ( ) Natural flora ( )
34 1) 2-33 The Key Events Dose-Response Framework 30 ml 37 ph ph E. coli O157:H7 Salmonella L. monocytogenes ND ND Time (h) Time (h) E. coli - ph Lm -ph Sal- ph ph 33
35 10 2 ~10 3 CFU/g 1 ph ph 2.5 ph ph L. monocytogenes E. coli O157:H7 ph L. monocytogenes E. coli O157:H7 Salmonella ph (~2.5) ph ph LM L. monocytogenes E. O157 coli O157:H7 Salmonella spp ph 1 ph ph USFDA oxins/badbugbook/ucm htm PDF ph 2 ph ph 1.5, 40 ml ph = - log10 [H+] % 3 ph 34
36 ph max ph 2 ph min ph 1.5 a ph ph x[t] <- x[t - 1] + Delta.time[t] * (p[1] * exp(p[2] * ph[t])) t p[1], p[2] MCMC 95 ph 3 ph ph ph a 5 a = 0 a=
37 g CFU/g = CFU ph
38 4 Salmonella enterica serovar Enteritidis low-contaminated chicken high-contaminated chicken TSB CFU/g 10g 110ml standard plate counts (SPC) DHL XLD PCR O AM-7002 Fujikawa 2004, 2005 N t k N max N min m n Fujikawa and Kano 2009 k log 37
39 ( CFU/g) 2-38A N max k 8 SPC k N max 2-38B A B 2-38 (A) (B) 2 ( CFU/g) 2-39A N max k 2-39B k N max A B 2-39 (A) (B)
40 ( 2-41)
41 (A) (B)
42 (log ) 2 2 (log ) A B A B Fujikawa, H., Kai, A., Morozumi S., A new logistic model for Escherichia coli at constant and dynamic temperatures. Food Microbiol. 21, Fujikawa, H., Morozumi, S., Modeling Surface Growth of Escherichia coli on Agar Plates. Appl. Environ. Microbiol. 71, Fujikawa, H., Kano, Y., Development of a program to fit data to a new logistic model for microbial growth. Biocont. Sci. 14,
43 5 L. monocytogenes Natural flora 2ºC 5 ºC 10 ºC 15 ºC 20ºC 25ºC 30 ºC L. monocytogenes 1.5%NaCl TSA L. monocytogenes PALCAM (MERCK) L. monocytogenes 48 5 ºC 2-45 natural flora 6 L. monocytogenes 5 log CFU/g 4 6 log cfu/g 2 7log CFU/g 8log CFU/g natural flora L. monocytogenes L. monocytogenes 5 ºC L. monocytogenes natural flora 20 C natural flora 2-45 L. monocytogenes natural flora 5 : natural flora 10 2 CFU/g L. monocytogenes : natural flora 10 4 CFU/g L. monocytogenes : natural flora 10 6 CFU/g L. monocytogenes : natural flora 10 2 CFU/g : natural flora 10 4 CFU/g : natural flora 10 6 CFU/g 6 in vitro Listeria monocytogenes ph ph g ph L. monocytogenes ( ) 42
44 Buchanan The Key Events Dose-Response Framework 1) ( ) in vitro L. monocytogenes GAM 0.1%(w/v) 0.4% L. monocytogenes Scott-A CIP (Lm) (BHI) 30 C, 6-24h 10 9 cfu/ml BHI ml 3ml (n = 3) Lactobacillus acidophilus NBRC Enterococcus faecalis NBRC MRS broth 48h OD 660nm 2.0, 10 9 cfu/ml (OD660nm=2) Lm 0.3ml Lm E. faecalis Lb. acidophilus MRS broth Lm 37 C 24h PALCAM Lm 1 Lm 10 6 cfu/ml 37 24h 10 9 cfu/ml 10 4 cfu ( 2-47) Lm cfu/ml 37 24h 43
45 3 MRS Lb. acidophilus E. faecalis 10 8 cfu/ml Lm 2-48 Lb. acidophilus Lm Lm E. faecalis Lm Lm ( 6h)( 12h) Lm Lm Lm Lb. acidophilus Ec. faecalis Lm 2-48 Lactobacillus acidophilus Enterococcus faecalis Cont., ; Cult., ; Sup., ; Cell, Buchanan, R.L. et al., The Key Events Dose-Response Framework: Its Potential for Application to Foodborne Pathogenic Microorganisms',Critical Reviews in Food Science and Nutrition,49:8,
46 1) Koseki, S Microbial Responses Viewer (MRV): a new ComBase-derived database of microbial responses to food environments. Int. J. Food Microbiol. 134, (IF = 2.753) 2) Shige Koseki 1 *, Yoshiko Takizawa 2, Satoko Miya 2, Hajime Takahashi 2, and Bon Kimura. A Novel Approach to Predicting the Bacterial Growth using Bayesian State Space Model: Quantify both the Bacterial Population and its Probability Distribution. (in submission) 3) Shige Koseki 1 *, Yasuko Mizuno. Pathogen can survive during digesting process: Prediction of pathogen survival in si,ulated gastric fluid with various foods. (in submission) MRV 45
47 3 Buchanan 46
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