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- やすもり いまいだ
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1 レッドマウス 病 ERM : Enteric redmouth disease 1. 疫 学 (1) 病 名 と 病 原 体 1 病 名 :レッドマウス 病 またはエンテリック レッドマウス 病 英 名 :Enteric redmouth disease(erm) 2 原 因 菌 :Yersinia ruckeri (2) 発 生 地 域 アメリカ 合 衆 国 カナダ チリ アイルランド イギリス スペイン イタリア フランス デンマーク ドイツ スイス ハンガリー ブルガリア 旧 ユーゴスラビア ノルウェー フィ ンランド イラン 南 アフリカ オーストラリア ニュージーランド トルコ (3) 宿 主 域 1 すべてのサケ 科 魚 類 が 本 病 に 感 受 性 を 有 すると 考 えられる (a) ニジマス(Oncorhynchus mykiss) ベニザケ(O. nerka) ヒメマス(O. nerka) ギンザケ(O. kisutch) マスノスケ(O. tshawytscha) タイセイヨウサケ(Salmo salar) ブラウントラウト(S. trutta) カットスロートトラウト(S. clarkii) カワマス(Salvelinus fontinalis) レイクトラウ ト(S. namaycush) オショロコマ(S. malma) アルプスイワナ(S. alpinus) ホワイトフィッシュ (Coregonus peled, C. muksun)から Y. ruckeri が 分 離 されている (b) これらのうちニジマスでの 発 生 および 被 害 が 最 も 多 い 2 サケ 科 魚 類 以 外 でも ウナギ キンギョ コイ ミノー シスコ バス タラ チョウザメから Y. ruckeri が 分 離 されている 3 甲 殻 類 (ザリガニ) 鳥 類 ほ 乳 類 (ネズミ)からも Y. ruckeri は 分 離 されており 宿 主 域 は 広 い と 考 えられる (4) 発 症 の 特 徴 1 本 病 は 7.5 cm ほどに 成 長 したニジマスに 発 生 しやすい 2 病 状 の 経 過 により 急 性 型 亜 急 性 型 慢 性 型 に 分 けられる (a) 急 性 型 は 春 から 夏 にかけての 水 温 上 昇 期 に 主 として 当 歳 魚 に 発 生 するもので 30~60 日 間 に 死 亡 率 は 50~70%に 達 する (b) 亜 急 性 型 は 秋 から 冬 にかけての 水 温 下 降 期 に 流 行 し 死 亡 率 は 急 性 型 より 低 いが 2~6 ヶ 月 で 10~50%に 達 する (c) 慢 性 型 の 死 亡 率 は 約 10%と 低 いが 商 品 サイズの 魚 や 親 魚 に 発 生 しやすい 点 が 問 題 となる 3 感 染 耐 過 魚 はキャリアとなり 主 として 腸 管 内 に 原 因 菌 を 長 期 にわたり 保 持 し 過 密 飼 育 低 酸 素 高 水 温 ハンドリングなどのストレスにより 本 病 の 発 生 および 環 境 中 への 原 因 菌 の 排 出 を 繰 り 返 す 4 水 温 13 以 上 多 くは 水 温 18 前 後 で 発 生 する 5 垂 直 感 染 の 可 能 性 を 示 唆 する 報 告 もあるが 本 病 の 発 生 のほとんどは 水 平 感 染 の 結 果 と 考 えられ る 感 染 耐 過 魚 がキャリアとなるほか 外 見 上 健 康 なコイ ザリガニなどからも 本 菌 の 排 菌 が 確 認 されている 病 性 鑑 定 資 料 47
2 (5) 消 毒 1 一 般 細 菌 に 対 する 消 毒 法 が 有 効 (a) 器 具 :70%エタノール 3~5%クレゾール オートクレーブによる 滅 菌 乾 熱 滅 菌 (b) 手 指 :70%エタノール 0.1~1.0% 逆 性 石 鹸 (c) 池 :0.02% 次 亜 塩 素 酸 ソーダ (6) 防 除 法 (a) 血 清 型 の 一 致 が 前 提 となるが 全 菌 体 不 活 化 ワクチンが 有 効 である (b) 発 病 群 の 移 動 感 染 耐 過 群 の 親 魚 としての 飼 育 は 行 わない (c) 発 病 池 を 消 毒 する 2. 診 断 手 法 (1) 臨 床 検 査 麻 酔 剤 : 0.5% MS222(Tricaine;3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate) FA100 (オイゲノール)など 記 録 用 ノート 2 取 り 上 げ 前 遊 泳 状 況 を 観 察 する 3 取 り 上 げ (a) 少 なくとも 5 尾 の 瀕 死 魚 または 当 該 疾 病 の 外 観 症 状 を 示 している 死 亡 直 後 の 個 体 を 採 取 す る (b) 生 魚 は 麻 酔 剤 で 麻 酔 する 大 型 魚 では 撲 殺 する (c) 外 観 症 状 を 記 載 する 4 ERM 罹 病 魚 の 症 状 (a) 遊 泳 が 緩 慢 体 色 黒 化 両 眼 球 の 突 出 (b) 口 腔 内 口 吻 部 下 顎 および 鰭 基 部 等 の 皮 膚 に 発 赤 や 点 状 出 血 ( 写 真 1 2) (c) ただし 列 記 した 症 状 を 呈 さない 症 例 も 報 告 されている (2) 剖 検 70%アルコール 綿 解 剖 器 具 ガスバーナー(アルコールランプ ライター) 2 手 技 (a) 魚 体 表 面 をアルコール 綿 またはアルコール 噴 霧 器 で 消 毒 し 滅 菌 したハサミ ピンセット などで 解 剖 する (b) 内 臓 器 の 異 常 を 調 べ 剖 検 所 見 を 記 載 する 3 判 定 (a) ERM 罹 病 魚 は 肝 臓 膵 臓 脂 肪 組 織 鰾 腸 間 膜 腸 後 部 筋 肉 などに 出 血 がみられる( 写 真 3 4) 脾 臓 は 腫 大 する (b) 胃 には 水 様 物 が 貯 留 し 腸 内 には 黄 色 の 粘 液 が 認 められる (3) 細 菌 の 分 離 培 養 白 金 耳 (ループ 線 ) ビニールテープ 保 冷 箱 ( 発 泡 スチロール 等 ) 氷 ( 冷 却 剤 ) ビニール 袋 ラベル 48 特 定 疾 病 診 断 マニュアル
3 写 真 1 ERM に 罹 病 したニジマス 稚 魚 尻 鰭 基 部 や 尾 柄 部 皮 下 に 出 血 ( 矢 印 )がみられる (S. Lapatra 博 士 提 供 ) 写 真 2 ERM 罹 病 魚 (ニジマス)の 症 状 写 真 左 : 口 腔 内 上 側 の 皮 下 出 血 ( 下 顎 を 切 除 して 撮 影 ) 写 真 中 央 : 胸 部 腹 面 の 皮 下 出 血 写 真 右 : 口 腔 内 下 側 の 皮 下 出 血 ( 上 顎 吻 部 を 切 除 して 撮 影 ) ( 吉 水 守 博 士 提 供 ) 写 真 3 ERM 罹 病 魚 (ニジマス) 脂 肪 組 織 および 腸 間 膜 に 出 血 がみられる (S. Lapatra 博 士 提 供 ) 写 真 4 ERM 罹 病 魚 (ニジマス) 鰾 ( 白 矢 印 )および 腹 膜 ( 黒 矢 印 )に 出 血 がみられる (S. Lapatra 博 士 提 供 ) トリプトソーヤ 寒 天 培 地 (TSA 培 地 日 水 製 薬 ) インキュベーター(25 ) 2 検 査 試 料 (a) できるだけ 発 生 現 場 で 細 菌 分 離 を 行 う (b) やむを 得 ず 検 査 機 関 まで 搬 送 して 菌 分 離 を 行 う 場 合 は 生 きたままビニール 袋 などで 酸 素 詰 めにし 水 温 変 動 に 注 意 する または 検 査 魚 を 現 場 で 即 殺 後 個 体 ごとに 別 々に 無 菌 の 密 閉 可 能 な 容 器 に 包 装 し 氷 冷 または 冷 蔵 状 態 で 24 時 間 以 内 に 検 査 機 関 まで 搬 送 する 検 査 魚 として 死 魚 しか 入 手 できない 場 合 は なるべく 新 鮮 なものを 採 取 し 個 体 ごとにビニール 袋 な 病 性 鑑 定 資 料 49
4 どで 密 閉 包 装 し 氷 冷 または 冷 蔵 状 態 で 搬 送 する 検 査 魚 には 採 取 場 所 および 日 時 を 明 記 した ラベルを 添 付 する (c) 魚 体 サイズによる 検 査 部 位 全 長 5 cm 以 下 の 魚 では 腎 臓 を 含 む 内 臓 全 体 を 試 料 とする 全 長 5 cm 以 上 の 魚 では 腎 臓 を 試 料 とする 3 菌 分 離 (a) 検 査 魚 の 腎 臓 を 滅 菌 したハサミ ピンセッ トなどで 露 出 させる 通 常 は 解 剖 後 腹 側 から 鰾 を 除 去 し 腎 臓 を 露 出 させる 死 亡 後 時 間 が 経 過 し 内 臓 ( 特 に 腸 管 )の 損 傷 融 解 が 予 想 される 場 合 には 背 部 皮 膚 を 70%アルコール 綿 または 噴 霧 器 で 消 毒 した 後 背 側 から 背 骨 まで 切 開 し 腎 臓 を 露 出 させる( 写 真 5) 写 真 5 菌 分 離 のために 背 面 から 切 開 したニジマス ( 矢 印 は 腎 臓 ) (b) 白 金 耳 を 用 いて 腎 臓 を TSA 培 地 に 塗 抹 する (c) 菌 体 塗 抹 後 のシャーレはビニールテープ 等 で 密 閉 後 検 査 機 関 まで 保 冷 庫 に 十 分 量 の 氷 ま たは 冷 媒 を 入 れ 0~4 に 保 ちながら 搬 送 する 試 料 は 凍 結 しないよう 注 意 する 4 培 養 (a) 試 料 接 種 した 培 地 は 25 で 3 日 間 培 養 する (b) 毎 日 目 視 にて 観 察 し 出 現 するコロニーの 形 態 ( 直 径 色 透 明 感 コロニー 周 縁 の 形 状 コロニー 全 体 の 形 状 )を 観 察 する (c) 試 料 接 種 した 培 地 にコロニーが 現 れたら 5. 細 菌 検 査 の 手 順 に 従 って 細 菌 の 同 定 に 着 手 する (d) 3 日 後 においてもコロニーが 出 現 しなければ 試 料 は 陰 性 と 診 断 する 5 Y. ruckeri の 性 状 TSA 培 地 では コロニーは 円 形 で 小 さく 乳 白 色 で 半 透 明 構 造 は 均 質 表 面 は 平 滑 辺 縁 は 平 滑 で 明 瞭 色 素 の 産 生 はない( 写 真 6) 写 真 6 トリプトソーヤ 寒 天 培 地 における Yersinia ruckeri のコロニー (48 時 間 培 養 後 ) 左 : 透 過 光 で 撮 影 右 : 落 射 光 で 撮 影 (4) 細 菌 検 査 3% 水 酸 化 カリウム 水 溶 液 スライドグラス 50 特 定 疾 病 診 断 マニュアル
5 市 販 のチトクローム オキシダーゼ 試 験 用 ろ 紙 ( 日 水 製 薬 ) 先 を 丸 くしたガラス 棒 2 グラム 鑑 別 (a) 3% 水 酸 化 カリウム 水 溶 液 をスライドグラスに 1 滴 のせ それに 平 板 培 地 上 のコロニーを 白 金 耳 で 取 って よく 混 ぜる (b) 液 が 粘 稠 で 糸 を 引 くようになればグラム 陰 性 菌 変 化 がなければグラム 陽 性 菌 である 写 真 7 チトクローム オキシダーゼ 試 験 結 果 Y. ruckeri は 陰 性 ( 右 矢 印 ) 左 は 陽 性 対 照 3 チトクローム オキシダーゼ 試 験 (a) 試 験 紙 を 水 で 湿 らせ ガラス 棒 などで 被 検 菌 を 試 験 紙 の 表 面 になすりつける なお ニク ロム 線 は 擬 陽 性 の 原 因 となるため 用 いない (b) 1 分 以 内 に 深 青 色 を 呈 するものを 陽 性 無 変 化 を 陰 性 とする( 写 真 7) 4 Y. ruckeri の 性 状 (a) グラム 陰 性 (b) チトクローム オキシダーゼ 陰 性 5 判 定 (a) 上 記 4の 性 状 がすべて 満 たされる 場 合 は PCR 検 査 へと 進 む (b) 上 記 4の 性 状 が 満 たされない 場 合 は 陰 性 と 診 断 する (5) PCR 検 査 ( 初 動 診 断 ) (a) 分 離 コロニー (b) PCR 検 査 使 用 機 器 および 試 薬 (サーマルサイクラー マイクロピペット マイクロチューブ 酵 素 試 薬 類 電 気 泳 動 装 置 および 試 薬 類 など) (c) プライマー YER3:5'-CGA GGA GGA AGG GTT AAG T-3' YER4:5'-AAG GCA CCA AGG CAT CTC T-3' 増 幅 産 物 サイズ:588bp 2 手 技 (a) 熱 抽 出 法 または 適 当 な DNA 抽 出 キットにより 菌 体 DNA を 抽 出 する DNA 抽 出 に 用 いたマ イクロチューブやマイクロチップなどはオートクレーブで 滅 菌 して 廃 棄 する 熱 抽 出 ;マイクロピペットチップ 等 を 用 いて 釣 菌 した 少 量 の 菌 体 を 100μL の TE バッファー (10mM Tris-HCl ph8.0 1mM EDTA) に 懸 濁 し 98 で 10 分 間 加 熱 処 理 する 遠 心 分 離 (12,000rpm 3 分 間 )に 供 し 菌 体 残 滓 を 沈 殿 させ 上 清 1μL を PCR の 鋳 型 として 用 いる DNA 抽 出 キット; 使 用 するキットのマニュアルに 従 う (b) 抽 出 した 核 酸 および 陽 性 対 照 DNA をテンプレートとして 上 記 のプライマーおよび PCR 試 薬 を 用 いて PCR を 行 う 反 応 は 最 初 に 94 で 5 分 間 続 いて 94 で 40 秒 間 60 で 40 秒 間 72 で 1 分 間 を 30 サイクル 最 後 に 72 で 5 分 間 行 う ただし 使 用 する PCR 試 薬 のマニュアルに 最 初 の 変 性 反 応 条 件 の 指 定 がある 場 合 は それに 従 う (c) PCR 終 了 後 増 幅 産 物 を 適 当 な DNA 分 子 量 マーカーとともに 2% 程 度 のアガロースゲルで 電 気 泳 動 を 行 う (d) 臭 化 エチジウム 存 在 下 トランスイルミネーターにより 分 子 量 588bp のバンドの 有 無 を 観 察 する 病 性 鑑 定 資 料 51
6 3 判 定 目 的 のバンドが 検 出 された 場 合 は 陽 性 と 判 定 し 確 定 診 断 のため 養 殖 研 究 所 に 分 離 菌 体 を 送 付 する (6) PCR 検 査 ( 最 終 診 断 ) (a) 分 離 コロニー (b) PCR 検 査 使 用 機 器 および 試 薬 (サーマルサイクラー マイクロピペット マイクロチューブ 酵 素 試 薬 類 電 気 泳 動 装 置 など) (c) プライマー ruck1:5'-cag CGG AAA GTA GCT TG-3' ruck2:5'-tgt TCA GTG CTA TTA ACA CTT AA-3' 増 幅 産 物 サイズ:409bp 2 手 技 (a) 熱 抽 出 法 または 適 当 な DNA 抽 出 キットにより 菌 体 DNA を 抽 出 する DNA 抽 出 に 用 いたマ イクロチューブやマイクロチップなどはオートクレーブで 滅 菌 して 廃 棄 する 熱 抽 出 ;マイクロピペットチップ 等 を 用 いて 釣 菌 した 少 量 の 菌 体 を 100μL の TE バッファー (10mM Tris-HCl ph8.0 1mM EDTA) に 懸 濁 し 98 で 10 分 間 加 熱 処 理 する 遠 心 分 離 (12,000rpm 3 分 間 )に 供 し 菌 体 残 滓 を 沈 殿 させ 上 清 1μL を PCR の 鋳 型 として 用 いる DNA 抽 出 キット; 使 用 するキットのマニュアルに 従 う (b) 抽 出 した 核 酸 および 陽 性 対 照 DNA をテンプレートとして 上 記 のプライマーおよび PCR 試 薬 を 用 いて PCR を 行 う 反 応 は 最 初 に 94 で 5 分 間 続 いて 94 で 30 秒 間 55 で 30 秒 間 72 で 1 分 間 を 35 サイクル 最 後 に 72 で 5 分 間 行 う ただし 使 用 する PCR 試 薬 のマニュアルに 最 初 の 変 性 反 応 条 件 の 指 定 がある 場 合 は それに 従 う (c) PCR 終 了 後 増 幅 産 物 を 適 当 な DNA 分 子 量 マーカーとともに 2% 程 度 のアガロースゲルで 電 気 泳 動 を 行 う (d) 臭 化 エチジウム 存 在 下 トランスイルミネーターにより 分 子 量 409bp のバンドの 有 無 を 観 察 する 3 判 定 目 的 のバンドが 検 出 された 場 合 は 陽 性 と 判 定 する 3. 確 定 診 断 のための 養 殖 研 究 所 への 送 付 1 細 菌 検 査 および PCR 検 査 で 陽 性 と 判 定 された 分 離 コロニーを TSA 培 地 に 接 種 し 25 で 24~48 時 間 培 養 する 2 シャーレをビニールテープ 等 で 密 閉 し キムタオル 等 の 吸 水 パッドで 包 む 3 防 水 防 漏 性 の 袋 に 入 れ 密 封 する ジップ 付 き 袋 の 場 合 は ジップを 閉 めテープ 等 で 密 封 する 4 吸 水 パッドとともに 試 料 を 防 水 防 漏 性 の 袋 に 入 れ 密 封 する 5 試 料 と 保 冷 剤 ( 氷 ドライアイスは 不 可 )とともに 発 泡 スチロールに 入 れ 緩 衝 材 等 で 隙 間 をう める 6 当 該 個 体 の 臨 床 検 査 剖 検 記 録 細 菌 検 査 記 録 PCR 検 査 記 録 を 添 付 する 7 発 泡 スチロールの 蓋 を 閉 め テープ 等 で 密 封 する 8 養 殖 研 究 所 魚 病 診 断 研 修 センターに 電 話 し( 電 話 番 号 ) 試 料 送 付 の 旨 を 伝 え 送 付 日 時 を 打 ち 合 わせる 52 特 定 疾 病 診 断 マニュアル
7 9 冷 蔵 宅 配 便 で 送 付 する 4. 備 考 (1) 培 地 の 調 製 法 1 精 製 水 ( 蒸 留 水 または 脱 イオン 水 )に 培 地 成 分 を 溶 解 し オートクレーブを 使 用 して 分 間 滅 菌 する 2 通 常 のシャーレ( 直 径 90 mm)を 用 いて 寒 天 平 板 培 地 を 作 製 する 場 合 培 地 の 量 は 1 枚 あたり 20 ml を 目 安 とする 3 寒 天 粉 末 には 細 菌 の 発 育 阻 害 作 用 のある 微 量 成 分 が 含 まれるので Bacto agar(difco)など 精 製 度 のよい 寒 天 を 使 用 する 4 寒 天 平 板 培 地 は 調 製 後 すぐには 使 用 せず ある 程 度 平 板 表 面 が 乾 燥 してから 使 用 する 5 細 菌 検 査 用 培 地 類 は 日 水 製 薬 栄 研 化 学 Difco BBL Oxoid などから 市 販 されている (2) 検 査 試 料 使 用 器 具 などの 処 理 1 検 査 試 料 ( 病 魚 )は 検 査 後 速 やかにオートクレーブにより 滅 菌 後 廃 棄 する 2 網 などの 採 捕 用 具 輸 送 用 コンテナーおよびバケツ 長 靴 など 病 魚 あるいは 飼 育 水 と 接 触 した 可 能 性 のあるもの 検 査 に 用 いた 器 具 などは 病 原 体 による 汚 染 伝 播 を 防 止 するために 洗 浄 再 使 用 あるいは 廃 棄 の 前 に 必 ずすべて 消 毒 をする 5. 参 考 文 献 日 本 水 産 資 源 保 護 協 会 (1996):エンテリックレッドマウス 病 魚 類 および 貝 類 の 病 原 体 の 検 出 と 同 定 法 ( 第 4 版 ) 魚 類 防 疫 技 術 書 シリーズ XIV LeJeune, J. T. and F. R. Rurangirwa (2000): Polymerase chain reaction for definitive identification of Yersinia ruckeri. J. Vet. Diagn. Invest., 12, Furones, M. D., C. J. Rodgers and C. B. Munn (1993): Yersinia ruckeri, the causal agent of enteric redmouth disease (ERM) in fish. Annual Rev. Fish Dis., 3, Del Cerro, A., I. Marquez and J. A. Guijarro (2002): Simultaneous detection of Aeromonas salmonicida, Flavobacterium psychrophilum and Yersinia ruckeri, three major fish pathogens, by multiplex PCR. Appl. Environ. Microbiol., 68, 坂 井 貴 光 大 迫 典 久 飯 田 貴 次 (2006):レッドマウス 病 原 因 菌 の 簡 易 迅 速 検 出 法 について. 魚 病 研 究, 41, 病 性 鑑 定 資 料 53
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