Number of both incidence and patient of food-borne diseases caused by Salmonella are still higher rank in total food-borne diseases, although they hav
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- ゆき こしの
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1 [ 食 品 科 学 部 ] バイダスを 用 いたサルモネラ 迅 速 検 出 法 の 検 討 財 団 法 人 沖 縄 県 環 境 科 学 センター 中 川 弘 福 村 圭 介 麻 布 大 学 中 村 菜 美 子 日 本 ビオメリュー 株 式 会 社 澤 口 勧 内 田 和 之 財 団 法 人 東 京 顕 微 鏡 院 伊 藤 武 沖 縄 県 浦 添 市 経 塚 720 番 地 * 神 奈 川 県 相 模 原 市 渕 野 辺 * 東 京 都 港 区 北 青 山 * 東 京 都 中 央 区 日 本 橋 箱 崎 町 44-1*4 Study of simple and rapid detection of Salmonella spp. using VIDAS Hiroshi Nakagawa*1, Keisuke Fukumura*1, Namiko Nakamura*2, Susumu Sawaguchi*3, Kazuyuki Uchida*3, Takeshi Ito*4 (*1 Okinawa Environmental Research & Technology Center, 720 Kyoduka, Urazoe, Okinawa ) (*2Azabu University, Fuchinobe, Sagamihara, Kanagawa-ken, ) (*3bioMerieux Japan Ltd., Kita-Aoyama, Minato-ku, Tokyo, ) (*4Tokyo Kenbikyoin Foundation, 44-1 Hakozaki-cho, Nihonbashi, Chuou-ku, Tokyo, ) 第 26 回 日 本 食 品 微 生 物 学 会 学 術 総 会 発 表 日 本 食 品 微 生 物 学 会 雑 誌 原 著 論 文 受 理 ( 平 成 18 年 6 月 2 日 ) 6
2 Number of both incidence and patient of food-borne diseases caused by Salmonella are still higher rank in total food-borne diseases, although they have been decreasing in years. Needs of simple and rapid alternative method for Salmonella testing have been very high in food industry because conventional culture method includes two enrichment procedures and takes more than five days to isolate typical colony of Salmonella, its identification etc. from food samples. VIDAS is an enzyme-linked fluorescent assay (ELFA)system which consists of instrument for fully automation and its reagents. In this study, we compared two protocols of VIDAS methods and conventional culture method for detecting Salmonella by using 40 food samples. Performances of protocols "VIDAS ICS + plate" and "VIDAS SLM AFNOR validated method" especially showed higher sensitivity than conventional culture method. These protocols were excellent also in terms of rapidity on time to results in addition to gain higher sensitivity. We also compared SMID2, new chromogenic agar plate for selective isolation of Salmonella with DHL agar, traditional agar plate for Salmonella testing. On SMID2, typical colonies of Salmonella were much easier to identify (mainly by its characteristic color), and frequency of appearance of typical colony by bacteria other than Salmonella were much lower, although recovery rate of Salmonella were not different between the two media. 7
3 1. 緒 言 近 年 サルモネラ 食 中 毒 は 減 少 傾 向 にあるが 依 然 として 件 数 患 者 数 共 に 上 位 を 占 めている サ ルモネラ 食 中 毒 の 主 要 な 原 因 食 品 としては 鶏 卵 と その 加 工 品 その 他 食 肉 類 とその 加 工 品 等 があげ られる 食 品 中 に 存 在 するサルモネラは 共 存 する 他 の 菌 と 比 較 して 菌 量 が 少 なく また 加 熱 冷 凍 あるいは 乾 燥 等 によって 損 傷 を 受 けている 場 合 が あるため 本 菌 を 検 出 する 際 には 従 来 から 前 増 菌 と 選 択 増 菌 の 2 段 階 の 培 養 が 行 われている そ のため 食 品 からのサルモネラの 分 離 同 定 には 5 日 間 以 上 を 要 することから 迅 速 で 簡 易 なサルモ ネラ 検 出 法 の 確 立 が 望 まれている 近 年 分 離 培 養 では 酵 素 基 質 培 地 が 確 認 試 験 では ELISA 等 の 免 疫 学 的 手 法 DNA プローブ 法 や PCR 法 等 の 病 因 遺 伝 子 検 索 さらに 生 化 学 的 性 状 試 験 を 応 用 し たもの 等 さまざまな 迅 速 検 査 法 が 開 発 実 用 化 さ れている 1),2) 自 動 免 疫 蛍 光 測 定 装 置 (ミニバイダス)および その 専 用 試 薬 を 用 いたサルモネラの 検 出 は 海 外 で 高 く 評 価 されており その 報 告 も 多 い 3),4),5) 本 研 究 は 食 品 中 のサルモネラの 検 出 について 自 動 免 疫 蛍 光 測 定 装 置 (ミニバイダス)およびそ の 専 用 試 薬 を 用 いたプロトコールを 日 本 におけ る 公 定 法 と 比 較 し その 有 用 性 について 検 討 した また 新 たに 開 発 されたサルモネラの 分 離 培 地 で ある SMID2 寒 天 平 板 培 地 の 評 価 もあわせて 行 っ た 2. 材 料 および 方 法 2-1サルモネラ 検 出 用 自 動 測 定 装 置 および 専 用 試 薬 ELFA(Enzyme Linked Fluorescent Assay)を 原 理 とするミニバイダス( 日 本 ビオメリュー)を 用 いた また 専 用 サルモネラ 用 試 薬 として バ イダスアッセイキットサルモネラ(VIDAS assay kit Salmonella 以 下 VIDAS SLM)およびバイダ ス ICS サルモネラ 濃 縮 用 キット(VIDAS Immuno- Concentration Salmonella 以 下 VIDAS ICS)を 用 いた 2-2 測 定 原 理 バイダス(ミニバイダス) バイダス(ミニバイダス)は ELFA を 原 理 と する 自 動 免 疫 蛍 光 測 定 装 置 である 専 用 試 薬 はスパーとストリップから 構 成 されて いる スパーの 内 壁 には 抗 体 が 固 相 されており 検 体 中 の 特 異 抗 原 を 捕 捉 する この 抗 原 にスト リップ 中 のアルカリフォスファターゼ 標 識 抗 体 が 結 合 し さらにアルカリフォスファターゼがスト リップ 中 の 4-メチルウンベリフェリルリン 酸 を 加 水 分 解 する 続 いて 蛍 光 強 度 が 測 定 され 判 定 まで 自 動 で 行 われる なお 上 述 した VIDAS ICS は 本 原 理 によりサルモネラを 特 異 的 に 集 菌 するため の 試 薬 である ミニバイダスの 検 出 項 目 ( 食 中 毒 関 連 )には E. coli O157 6) 7) サルモネラ 3) 4) 5) キャンピロバ クター 8) 黄 色 ブドウ 球 菌 由 来 エンテロトキシン 9) リステリア 10) リステリアモノサイトゲネス 11 12) があり 目 的 によって 専 用 試 薬 を 使 い 分 ける 測 定 時 間 は 検 出 項 目 によって 異 なり 約 分 である 2-3 供 試 菌 株 Salmonella Enteritidis IFO3313 ( 以 下 SE) Salmonella Typhimurium ATCC14028( 以 下 ST) 2-4 供 試 材 料 卵 類 ( 鶏 卵 温 泉 卵 ) 卵 加 工 品 (プリン カスター ド 菓 子 ポテトサラダ) 冷 凍 食 品 ( 餃 子 グラタン ピラフ 鶏 から 揚 げ) 肉 類 ( 豚 肉 生 姜 焼 き 用 豚 肉 馬 肉 ハンバーグパティ) 肉 加 工 品 (ソー セージ ローストビーフ 生 ハム) 野 菜 類 (カッ ト 野 菜 3 件 ) 鶏 肉 類 (もも 3 件 手 羽 先 骨 付 き 肉 軟 骨 チキンパティ 鶏 ミンチ 正 肉 ミンチ ささみミンチ 皮 2 件 砂 肝 2 件 もつ きん かん ハート レバー 3 件 )きのこ 類 (まいたけ) 8
4 の 合 計 40 検 体 を 用 いた それ 以 外 は で 時 間 培 養 した 2-5 供 試 材 料 の 細 菌 数 確 認 供 試 材 料 の 汚 染 度 合 を 確 認 するため 一 般 生 菌 数 および 大 腸 菌 群 数 を 以 下 の 方 法 で 測 定 した 供 試 材 料 25g を 滅 菌 ストマッカー 袋 に 採 取 し こ れに 滅 菌 済 み 生 理 食 塩 水 225ml を 加 えて 230rpm で 30 秒 間 ストマッキングし 必 要 に 応 じて 10 倍 ずつ 段 階 希 釈 した 後 シャーレ 2 枚 に 1ml ずつ 分 注 した 一 般 生 菌 数 は 標 準 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 )で 混 釈 して で 48 時 間 大 腸 菌 群 数 はデ ソキシコレート 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 )で 混 釈 して で 20 時 間 培 養 した 後 常 法 に 従 って 菌 数 を 算 出 した 2-6サルモネラ 接 種 試 験 法 ⑴ 接 種 菌 液 の 調 製 と 菌 数 確 認 接 種 菌 液 は 前 述 2 菌 株 を10 30cfu/100μl に なるよう 調 製 し 各 供 試 材 料 に 接 種 した 接 種 菌 液 の 菌 数 の 確 認 は 菌 液 をトリプトソイ 寒 天 培 地 ( 日 本 ビオメリュー: 以 下 TSA) 平 板 10 枚 にそれぞ れ100μl ずつ 滴 下 しコンラージ 棒 で 表 面 塗 抹 後 で 24 時 間 培 養 後 に 出 現 した 集 落 を 数 え 算 出 した ⑵ 供 試 材 料 の 調 製 と 菌 液 の 接 種 供 試 材 料 の 可 食 部 25g を 検 体 1 種 類 につき 3 件 それぞれ 滅 菌 ストマッカー 袋 に 無 菌 的 に 採 取 した うち 2 件 には SE または ST の 菌 液 をそ れぞれ 100μl 接 種 し 1 件 はサルモネラ 未 接 種 で 試 験 に 供 した 2-7サルモネラの 検 出 法 ⑴ 検 体 の 希 釈 および 前 増 菌 検 体 25g に 225ml の 滅 菌 ペプトン 緩 衝 液 ( 栄 研 化 学 : 以 下 BPW)を 加 え 230rpm で 30 秒 間 ストマッキングした その 後 公 定 法 における 卵 と 卵 加 工 品 ( 後 述 7-4-1)は で 時 間 ⑵ バイダス ICS+plate 法 (Fig. 1) 前 増 菌 液 0.8ml をバイダス ICS で 濃 縮 し 濃 縮 液 を DHL 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 : 以 下 DHL)お よび SMID2 寒 天 培 地 ( 日 本 ビオメリュー: 以 下 SMID2)に 塗 抹 し で 時 間 培 養 した サルモネラ 未 接 種 試 験 で 出 現 したサルモネラと 疑 われる 集 落 は TSI 培 地 ( 栄 研 化 学 : 以 下 TSI)お よび LIM 培 地 ( 栄 研 化 学 : 以 下 LIM)に 接 種 し で 時 間 培 養 した この 確 認 試 験 で サルモネラの 生 化 学 性 状 を 示 した 場 合 は O 多 価 血 清 (デンカ 生 研 )で 凝 集 したものをサルモネラ 陽 性 とした サルモネラを 接 種 した 供 試 材 料 につ いて 分 離 培 地 上 に 出 現 したサルモネラが 疑 われる 集 落 は SE を 接 種 したものについては O 多 価 血 清 で ST を 接 種 したものについては O4 血 清 (デ ンカ 生 研 )で 凝 集 したものをサルモネラ 陽 性 とし た Sample BPW 225ml VIDAS ICS DH S TSI I 25g 0.8ml ID2 16~20hrs. 40min. 22~26hrs. 22~26hrs. Interpretation(serotype testing if necessary) Fig. 1. VIDAS ICS+plate method 9
5 ⑶ バイダス SLM ; AFNOR( 仏 名 :Association Francaise de Normalisation) 承 認 法 (Fig. 2) 前 増 菌 液 0.1ml を 10ml の ラ パ ポ ー ト バ シ リ アディスソイブイヨン( 日 本 ビオメリュー: 以 下 RVS) へ 別 途 1ml を 10ml の ミ ュ ー ラ ー コ フマンテトラチオネートブイヨン( 日 本 ビオメ リュー: 以 下 MKTTn)へそれぞれ 接 種 した 前 者 は 42 後 者 は でそれぞれ 6 8 時 間 培 養 した 培 養 液 を 前 者 は 1ml 後 者 は 0.1ml それぞ れ 10ml の M ブイヨン( 日 本 ビオメリュー)に 接 種 し 42 で 時 間 培 養 した 培 養 後 各 々 の 培 養 液 から 1ml ずつ 採 取 し 混 ぜ 合 わせた 2ml を 100 で 15 分 熱 処 理 し その 0.5ml をバイダス SLM に 分 注 し ミニバイダスで 測 定 した ⑷ 公 定 法 0.1ml RVS 10ml BPW 225ml 42 6~8hrs. 0.1ml 1ml broth 10ml 1ml Sample 25g 42 16~20hrs. ⑷ -1. 卵 と 卵 加 工 品 (Fig. 3) Heating min. 0.5ml VIDAS S Interpretation 16~20hrs. 1ml KTTn 10ml broth 10ml 1ml 45min. Fig. 2. VIDAS S AFNOR validated method 前 増 菌 液 0.5ml を 10ml のラパポートバシリアディ スブイヨン( 日 本 ビオメリュー: 以 下 RV)とテ トラチオネートブイヨン( 栄 研 化 学 : 以 下 TT) にそれぞれ 接 種 し 42 で 時 間 培 養 した これら 培 養 液 1 白 金 耳 を DHL および SMID2 にそ れぞれ 画 線 塗 抹 し で 時 間 培 養 した サルモネラ 未 接 種 試 験 で 出 現 した 集 落 のうちサル モネラが 疑 われる 集 落 は TSI および LIM に 接 種 し で 時 間 培 養 した これらの 確 認 培 地 でサルモネラの 生 化 学 性 状 を 示 した 場 合 およ びサルモネラを 接 種 した 供 試 材 料 について 分 離 培 地 上 に 出 現 したサルモネラが 疑 われる 集 落 につい ては 血 清 学 的 試 験 でサルモネラの 有 無 を 判 定 し た RV 10ml Sample BPW 225ml 0.5ml 42 20~24hrs. TSI I 25g 20~24hrs. TT 10ml DH S ID2 18~24hrs. 18~24hrs. Interpretation(serotype testing if necessary) Fig. 3. Conventional culture method (For Eggs) ⑷ -2. 卵 以 外 の 食 品 (Fig 4) 前 増 菌 液 1.5ml を 15ml のハーナテトラチオネー トブイヨン( 栄 研 化 学 : 以 下 HTT)に 接 種 し 42 で 時 間 培 養 した 後 その 1 白 金 耳 を DHL および SMID2 に 画 線 塗 抹 し で 時 間 培 養 した サルモネラ 未 接 種 試 験 で 出 現 した 集 落 のうちサルモネラが 疑 われる 集 落 を 10
6 TSI および LIM に 接 種 し で 時 間 培 養 した これらの 確 認 培 地 でサルモネラの 生 化 学 性 状 を 示 した 場 合 およびサルモネラを 接 種 した 供 試 材 料 から 出 現 したサルモネラと 疑 われる 集 落 については 前 述 の 血 清 学 的 試 験 でサルモネラの 有 無 を 判 定 した 3. 結 果 Sample BPW 225ml HTT 15ml DH S TSI I 25g 1.5ml ID2 16~20hrs ~22hrs. 22~26hrs. 22~26hrs. Interpretation(serotype testing if necessary) Fig. 4. Conventional culture method (For samples except eggs) 3-1 供 試 材 料 からのサルモネラの 検 出 合 計 40 検 体 中 サルモネラが 検 出 されたもの は 公 定 法 で 7 件 バイダス ICS+plate 法 で 3 件 バイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 で 10 件 であった (Table 1) 3-2 食 品 にサルモネラを 添 加 した 場 合 の 各 法 によるサルモネラの 検 出 各 検 体 に SE( cfu/100μl) ST( cfu/100μl)を 接 種 し 公 定 法 バイダ ス ICS+plate 法 およびバイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 の 3 法 でサルモネラの 検 出 状 況 を 比 較 した 結 果 をそれぞれ Table 2 および Table 3 に 示 した SE を 接 種 し た 場 合 に サ ル モ ネ ラ が 検 出 さ れ た の は 公 定 法 で は 36 件 (90.0%) で あ っ た が バ イ ダ ス ICS+plate 法 お よ び バ イ ダ ス SLM ; AFNOR 承 認 法 では 39 件 (97.5%)であった ST を 接 種 した 場 合 は 公 定 法 では 39 件 (97.5%) バイダス ICS+plate 法 では 38 件 (95.0%) バイ ダス SLM ; AFNOR 承 認 法 では 40 件 (100%)か らサルモネラが 検 出 され いずれの 菌 を 接 種 した 場 合 においてもバイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 が 最 も 検 出 率 が 高 い 結 果 であった サルモネラを 接 種 した 合 計 80 試 験 におけるサルモネラの 検 出 は 公 定 法 では 75 件 (93.8%) バイダス ICS+plate 法 で は 77 件 (96.3%) バ イ ダ ス SLM ; AFNOR 承 認 法 では 79 件 (98.8%)で バイダスを 用 い た 両 プロトコールは 公 定 法 よりも 検 出 率 が 高 い 結 果 が 得 られた 3-3 公 定 法 との 一 致 率 サルモネラ 接 種 および 未 接 種 の 合 計 120 試 験 に おける 公 定 法 との 一 致 率 は バイダス ICS+plate 法 では 91.7% バイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 で は 92.5% であった また サルモネラを 接 種 し た 合 計 80 試 験 における 公 定 法 との 一 致 率 は バ イダス ICS+plate 法 バイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 ともに 95.0% であった 3-4 分 離 培 地 の 検 討 サルモネラ 未 接 種 の 試 験 品 40 検 体 およびサル モネラを 接 種 した 試 験 品 80 検 体 について 公 定 法 およびバイダス ICS+plate 法 での 合 計 240 試 験 検 体 のうち DHL では 150 検 体 SMID2 で 分 離 した 場 合 は 155 検 体 からサルモネラが 分 離 され 両 培 地 間 で 検 出 率 には 著 しい 差 は 認 められなかっ た 分 離 培 地 の 鑑 別 能 を 比 較 するため 分 離 培 地 上 でサルモネラが 疑 われた 検 体 と 培 地 別 の 結 果 を Table 4 に 示 した サルモネラ 未 接 種 の 40 検 体 において 培 地 上 でサルモネラが 疑 われたが 確 認 試 11
7 験 で 陰 性 と 判 定 された 検 体 ( 偽 陽 性 )について 分 離 培 地 別 にみると DHL は 公 定 法 では 15 検 体 バイダス ICS+plate 法 では 20 検 体 認 められたの に 対 し SMID2 は 公 定 法 では 3 検 体 バイダス ICS+plate 法 では 19 検 体 と SMID2 は 偽 陽 性 数 が 少 ない 結 果 であった またこれらサルモネラ が 疑 われる 集 落 を 形 成 した 検 体 は 一 般 細 菌 数 の 菌 数 が 高 いものや 大 腸 菌 群 が 検 出 されるなど 細 菌 の 汚 染 度 が 高 い 傾 向 であった Table 1. Detection of Salmonella from food samples tested icrobiological flora of Results samples(cfu/g) Category of food The name of foods Conventional VIDAS Total viable Total culture method ICS+plate S (AFNOR) count coliforms Egg Onsen tamago Raw egg Egg-processed Pudding food Custard cake Potato salad Frozen food Gyoza Gratin Pilaf Fried chicken eat Pork Pork seasoned with ginger Horse meat Hamburger patty Processed meat Sausage product Roast beef Uncured ham Vegetables Cut vegetables Cut vegetables Cut vegetables Chicken meat Thigh Thigh Thigh Wing Drumstick Cartilage Chicken putty Ground meat Ground meat Ground breast tender Skin Skin Gizzard Gizzard Giblets Ovary Heart iver iver iver ushroom aitake mushroom Number of tests Number of positive samples Accordance with conventional culture method (number of samples) Accordance rate with conventional culture method % 87.50% 12
8 Table 2. Comparison of each method for detection of Salmonella from food samples spiked with SE* Results Category of food The name of foods Conventional VIDAS culture method ICS+plate S (AFNOR) Egg Onsen tamago Raw egg Egg-processed Pudding food Custard cake Potato salad Frozen food Gyoza Gratin Pilaf Fried chicken eat Pork Pork seasoned with ginger Horse meat Hamburger patty Processed meat Sausage product Roast beef Uncured ham Vegetables Cut vegetables Cut vegetables Cut vegetables Chicken meat Thigh Thigh Thigh Wing Drumstick Cartilage Chicken putty Ground meat Ground meat Ground breast tender Skin Skin Gizzard Gizzard Giblets Ovary Heart iver iver iver ushroom aitake mushroom Number of tests Number of positive samples Positive rate Accordance with conventional culture method (number of samples) Accordance rate with conventional culture method *SE: Salmonella Enteritidis % 97.50% 97.50% % 92.50% Number of cells innoculated 13
9 Table 3. Comparison of each method for detection of Salmonella from food samples spiked with ST* Category of food ICS+plate S (AFNOR) Egg Onsen tamago Raw egg Egg-processed Pudding food Custard cake Potato salad Frozen food Gyoza Gratin Pilaf Fried chicken eat Pork Pork seasoned with ginger Horse meat Hamburger patty Processed meat Sausage product Roast beef Uncured ham Vegetables Cut vegetables Cut vegetables Cut vegetables Chicken meat Thigh Thigh Thigh Wing Drumstick Cartilage Chicken putty Ground meat Ground meat Ground breast tender Skin Skin Gizzard Gizzard Giblets Ovary Heart iver iver iver ushroom aitake mushroom Number of tests Number of positive samples Positive rate Accordance with conventional culture method (number of samples) Accordance rate with conventional culture method *ST: Salmonella Typhimurium The name of foods Conventional culture method Results VIDAS % 95.00% % % 97.50% Number of cells innoculated (cfu/25g) 14
10 Table 4. Samples detected typical colony of Salmonella on selective agar plate Category of food The name of foods Conventional culture method Results VIDAS ICS+plate DH S ID2 DH S ID2 Egg-processed food Potato salad - - ± - Frozen food Glatin ± eat Pork seasoned with ginger - - ± - Horse meat Hamburger patty ± - ± ± Vegetable Cut vegetables ± ± Cut vegetables ± Cut vegetables ± ± Chicken meat Thigh 1 ± - ± + Thigh 2 ± - ± ± Thigh 3 ± ± ± ± Wing ± + ± ± Drumstick - - ± - Cartilage ± - ± ± Ground meat 1 ± + ± ± Ground meat 2 ± - - ± Ground breast tender ± ± ± ± Skin 1 ± - ± ± Skin ± ± Gizzard 1 ± - ± ± Gizzard 2 ± ± ± ± Giblets ± + ± - Heart ± - ± ± iver 1 ± - - ± iver ± + ushroom aitake mushroom ± Total number Number of false positive samples** ± Sample confirmed negative by confirmation testing, althogh detected typical colonies on selective agar plate 15
11 4. 考 察 食 材 40 検 体 を 用 い 公 定 法 バイダス ICS+ plate 法 バイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 の 3 法 を 比 較 検 討 した その 結 果 バイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 が 公 定 法 およびバイダス ICS+plate 法 より も 高 い 検 出 率 を 示 し 他 の 2 法 より 優 れた 方 法 で あることが 示 唆 された バイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 は 選 択 増 菌 に ISO(International Organization for Standardization)のサルモネラ 検 査 (ISO6579) 13) に 指 定 されている RVS と MKTTn の 2 種 類 の 液 体 培 地 を 用 いており 公 定 法 の HTT だけでは 増 菌 され 難 かったサルモネラが 増 菌 されたと 考 え られると 共 に M ブイヨンでの 増 菌 過 程 を 加 え ることにより 鞭 毛 の 発 育 が 促 進 され 少 量 のサル モネラでも 検 出 が 可 能 となったと 考 えられる M ブイヨンは 培 地 成 分 のマンノースとクエン 酸 ナト リウムが 栄 養 素 となりサルモネラの 発 育 を 促 進 し マンノースが 鞭 毛 の 非 特 異 的 な 凝 集 を 抑 制 し 鞭 毛 の 発 育 を 促 進 することが 知 られている 14) バイダス ICS+plate 法 も サルモネラを 接 種 し た 場 合 の 検 出 率 は 公 定 法 よりも 高 い 結 果 であっ た このプロトコールでは ICS で 集 菌 することで 集 落 形 成 に 十 分 な 量 のサルモネラが 集 菌 できると ともにサルモネラ 以 外 の 菌 を 効 率 よく 排 除 するこ とができ これが 良 好 な 結 果 につながったものと 考 えられる しかしながら 今 回 試 験 に 供 した 食 材 は 大 腸 菌 群 による 汚 染 度 が 高 いものも 多 く ICS で 集 菌 し たにもかかわらず 分 離 培 地 でサルモネラを 分 離 す るのが 困 難 なものも 認 められた サルモネラ 未 接 種 時 に 三 法 いずれでもサルモネラが 検 出 された 検 体 の 大 腸 菌 群 数 は オーダーであった のに 対 し バイダス ICS+plate 法 のみでサルモネ ラが 検 出 できなかった 検 体 の 大 腸 菌 群 数 は オーダーであった 検 体 に 大 腸 菌 群 などの 夾 雑 菌 が 多 い 場 合 バイダス ICS での 集 菌 の 際 に 類 属 反 応 等 の 影 響 を 受 けることで 分 離 平 板 培 地 の 選 択 と 塗 抹 方 法 がサルモネラの 検 出 に 影 響 を 与 え ることが 推 察 される 食 品 では 増 菌 培 養 後 には 多 種 類 の 菌 が 存 在 し ており 全 体 に 占 める 目 的 菌 の 数 は 少 ないと 報 告 さ れている 15) 本 研 究 ではサルモネラ 損 傷 菌 の 回 復 を 目 的 として 前 増 菌 に BPW を 用 いたが これ により 食 品 中 に 存 在 する 大 腸 菌 群 等 の 夾 雑 菌 の 生 育 が 優 勢 になりやすかったことも 考 えられる 特 に 大 腸 菌 群 数 の 高 かったカット 野 菜 1 および 3 等 では サルモネラを 接 種 しても 検 出 できない 例 がみられた 夾 雑 菌 の 増 殖 抑 制 と 損 傷 菌 を 含 めた サルモネラの 回 収 どちらがより 重 要 かを 本 結 果 か ら 明 確 にすることは 困 難 であるが いずれにせよ サルモネラの 検 出 率 は 選 択 増 菌 培 地 により 大 きく 変 動 することから 16) サルモネラを 検 出 可 能 な 菌 量 にまで 確 実 に 増 殖 させ さらに 夾 雑 菌 の 影 響 を 抑 えることができる 増 菌 法 がサルモネラの 検 出 率 の 向 上 につながるものと 考 えられる 今 回 分 離 培 地 として 2 種 類 の 培 地 を 用 いた そのうち SMID2 は 日 本 ビオメリューが 新 たに 開 発 し た 培 地 で 前 身 の SMID と 比 較 す る と Salmonella Arizonae 等 の 鑑 別 が 可 能 になる 等 の 改 良 がなされたものである この SMID2 および DHL の 比 較 において 検 出 率 に 大 きな 差 は 認 め られなかった しかし サルモネラ 集 落 の 鑑 別 の 容 易 さは DHL と 比 較 し SMID2 は 定 形 集 落 の 色 調 が 明 瞭 であり かつ 偽 陽 性 の 頻 度 も 低 く 鑑 別 が 容 易 な 点 が 優 れた 結 果 であった この 要 因 とし ては DHL でのサルモネラの 検 出 は 硫 化 水 素 の 産 生 による 黒 色 集 落 を 指 標 にするが 多 くの 菌 が 抑 制 されるとはいえ Citrobacter freundii およ びProteus spp. もまた 黒 色 集 落 を 形 成 し しばし ばサルモネラと 見 誤 られることがあげられる 本 研 究 でも いくつかのサンプルで DHL に 発 育 し た 黒 色 集 落 がアピマニュアルキット( 日 本 ビオメ リュー)で Proteus と 同 定 された 一 方 SMID2 ではサルモネラに 特 異 的 なエステラーゼ 活 性 によ り 集 落 はピンク 赤 紫 色 を 呈 するが 本 試 験 では 青 紫 色 の 集 落 についても 全 てを 疑 わしい 集 落 と 16
12 判 定 した これらのうちサルモネラの 血 清 によ る 判 定 が 陰 性 となった 集 落 はProteus Serratia Enterobacter Aeromonas Pseudomonas と 同 定 された これらの 菌 を SMID2 に 画 線 塗 抹 し 集 落 を 形 成 させサルモネラの 集 落 と 比 較 したところ Pseudomonas についてはサルモネラ 集 落 との 鑑 別 は 困 難 であったが それ 以 外 は 色 調 等 の 鑑 別 が 可 能 であった したがって 判 定 に 慣 れることに より SMID2 に 発 育 した 集 落 の 判 定 が 容 易 になる と 考 えられる また 最 近 サルモネラの 代 表 的 な 生 化 学 的 性 状 である 硫 化 水 素 産 生 能 を 有 さない 株 が 食 中 毒 の 原 因 となることが 危 惧 されていること から 硫 化 水 素 非 産 生 のサルモネラであってもサ ルモネラと 判 定 できる SMID2 は 有 効 であると 考 えられる 以 上 バイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 は 比 較 し たプロトコール 中 最 も 検 出 感 度 が 高 く 検 出 時 間 も 公 定 法 より 約 2 日 短 縮 となった また バイ ダス ICS+plate 法 も 検 出 時 間 は 公 定 法 より 約 1 日 短 縮 でき 検 出 感 度 も 公 定 法 より 高 い 結 果 が 得 ら れた さらに 分 離 培 地 として DHL に 加 え SMID2 を 併 用 することで 平 板 上 のサルモネラ 集 落 の 鑑 別 も 容 易 かつ 確 実 となることから これらは 食 品 か らのサルモネラの 検 出 に 有 効 な 検 査 法 と 考 えられ る 5.まとめ 食 品 からのサルモネラの 検 出 について 公 定 法 とバイダスを 用 いた 2 通 りの 検 出 法 を 比 較 検 討 した また サルモネラの 分 離 培 地 SMID2 の 実 用 性 についても 併 せて 検 討 したところ 次 のような 結 果 を 得 た 1) 供 試 材 料 からのサルモネラの 検 出 は 合 計 40 検 体 中 公 定 法 で 7 件 バイダス ICS+plate 法 で 3 件 バイダス SLM ; AFNOR 承 認 法 で 10 件 であった 2)SE および ST をそれぞれ 接 種 した 合 計 80 試 験 におけるサルモネラの 検 出 は 公 定 法 では 75 件 (93.8%) バイダス ICS+plate 法 は 77 件 (96.3%) バイダス SLM;AFNOR 承 認 法 は 79 件 (98.8%)であった 3)バイダスを 用 いた 2 法 の 公 定 法 との 一 致 率 は % であった 4)サルモネラの 分 離 培 地 SMID2 は DHL と 比 較 し 検 出 率 に 著 しい 差 は 認 められなかったが サルモネラ 集 落 の 色 調 が 明 瞭 であり 鑑 別 が 容 易 で かつ 偽 陽 性 も 少 なかった 文 献 1) 大 畑 克 彦 本 田 敬 康 仁 科 徳 啓 : 電 気 ビーズを 用 いたサルモネラ 検 出 法 の 評 価 日 食 微 誌,14(2),97-100(1997). 2) 中 川 弘 : 食 品 衛 生 及 び 公 衆 衛 生 における 微 生 物 迅 速 検 出 法 の 課 題, 食 品 工 業,46(16),22-31(2003). 3)Kuang-Sheng, Y. : Comparison between VIDAS Automatic Enzyme-Linked Fluorescent Immunoassay and Culture Method for Salmonella Recovery from Pork Carcass Sponge Samples. J. Food Prot., 65, (2002). 4)Michael S. C. and Wendy A. L.:Evaluation of VIDAS Immuno- Concentration Salmonella Assay Plus Selective Plate Method (Hektoen, Bismuth Sulfite, Salmonella Identification)for Detection of Salmonella in Selected Food. Collaborative Study. J. of AOAC Int., 85, (2002). 5)VIDAS SLM kit for the rapid detection of Salmonella. AFNOR VALIDATION CERTIFICATE. 6)Vernozy-Rozand, C. : Detection of Escherichia coli O157 in French food samples using an immunomagnetic separation method and the VIDAS TM E.coli O157. Letters in Appli. Micro., 25, (1997). 7)Vernozy-Rozand C.: Evaluation of the VIDAS Methodology for Detection of Escherichia coli O157 in Food Samples. J. Food Prot. 61(7), (1998). 8)Michael T. M. and Norman J. S. : Vidas Detection of Campylobacter spp. in Poultry Samples. biomerieux Regional Customer Symposium (1996). 9)Dean C. and Pacita I. : Comparison of the TECRA and VIDAS immunoassay system for the detection of Staphylococcus Enterotoxins in Foods. Australian Government Analytical Laboratories(1999). 10)VIDAS LIS kit for the rapid detection of Listeria. AFNOR VALIDATION CERTIFICATE. 11)Graves, L.M. : Identification of Listeria monocytogenes by the VIDAS-system. American Society of Microbiology Annual Meeting in New Orleans, LA(1996). 12) 酒 井 史 彦 青 山 顕 司 篠 澤 映 子 山 縣 尚 丸 山 務 五 十 君 靜 信 柳 平 修 一 : ナチュラルチーズからのListeria monocytogenes 検 出 における 自 動 免 疫 蛍 光 測 定 装 置 の 利 用. 日 食 微 誌, 22(1),17-23 (2005). 13)ISO6579-Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection of Salmonella spp.,(2002) 14)SPERBER W. H., DEIBEL R. H. Accelerated Procedure for Salmonella detection in dried food and feeds involving only broth cultures and serological reactions Appl. Microbiol., 17, (1969). 15) 吉 敷 ゆみこ 石 崎 直 人 草 野 友 子 金 子 誠 二 宮 崎 奉 之 :ダイナビー ズおよびヤトロンビーズを 併 用 した 食 肉 からのサルモネラ 分 離 方 法 の 検 討 日 食 微 誌,17(3), (2000). 16) 楠 淳 伊 藤 武 :ELISAkit Locate による 食 肉 からのサルモネラ 検 出 法 日 食 微 誌,11(4), (1995). 17
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