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1 生 物 工 学 会 誌 第 86 巻 第 2 号 総 合 論 文 平 成 19 年 度 生 物 工 学 奨 励 賞 ( 斎 藤 賞 ) 受 賞 バイオキラルナイロンの 生 産 に 関 する 微 生 物 化 学 的 基 礎 研 究 芦 内 誠 Microbial and Enzymatic Production of Chiral Nylon Biopolymer Makoto Ashiuchi (Department of Agriculture, Faculty of Agriculture, Kochi University, 200 Monobe, Nankoku, Kochi ) Seibutsu-kogaku 86: 73 79, はじめに 二 十 世 紀 は 石 油 化 学 繊 維 の 時 代 ともいわれ,さまざま な 分 野 に 高 付 加 価 値 材 料 を 提 供 し, 先 端 的 な 産 業 技 術 の 創 出 にも 寄 与 してきた. 一 方, 資 源 枯 渇 や 環 境 問 題 への 懸 念 が 地 球 規 模 で 拡 がってくると, 多 様 な 産 業 領 域 で 脱 石 油 化 の 方 向 性 が 強 く 意 識 されるようになった 1). 材 料 開 発 分 野 でも 再 び 天 然 のバイオ 繊 維 ( 図 1)が 脚 光 を 浴 びる 状 況 になりつつある 1,2).なかでも, 微 生 物 繊 維 は 新 材 料 開 発 のための 有 力 なターゲットとして 最 も 注 目 さ れている 天 然 素 材 で, 生 分 解 性 材 料 としての 応 用 ととも に 超 微 細 繊 維 部 材 (ナノファイバー)としての 用 途 展 開 まで 期 待 されている. 本 稿 では,アミノ 酸 が 化 成 ナイロン 様 の 結 合 様 式 で 連 なったポリアミド 繊 維 性 物 質, 特 に 納 豆 の 糸 の 主 成 分 として 有 名 なポリ -γ- グルタミン 酸 ( 以 後,PGA と 略 す)を 取 り 上 げる.PGAに 係 るこれまでの 研 究 の 主 体 は 応 用 性 解 析 3 5) にあったといえる. 他 方,PGA 素 材 の 安 定 供 給 や 実 効 性 を 保 証 する 合 成 生 産 技 術 の 基 礎 的 な 研 究 は 後 回 しにされてきた 感 がある.ポリ 乳 酸 の 例 でも 分 かるように, 生 分 解 性 を 備 えた 新 機 能 材 料 はキラルポリ マーから 開 発 されるものと 予 想 される.したがって, 生 分 解 性 材 料 の 性 能 や 特 殊 機 能 性,またこれらの 特 性 発 現 に 係 る 再 現 性 を 保 証 する 目 的 から, 立 体 科 学 的 な 視 点 に 立 った 材 料 設 計, 特 に 立 体 規 則 性 を 制 御 するための 技 術 導 入 が 不 可 欠 となってくる.ここでは, 優 れた 立 体 化 学 性 (キラリティー)を 示 すPGA,いわゆるバイオキラル ナイロンの 微 生 物 化 学 合 成 ならびに 材 料 応 用 につながる 新 たな 機 能 性 についても 詳 解 する. 人 工 ポリグルタミン 酸 とバイオナイロンPGA 本 論 に 入 るに 先 立 ち,まずはPGAの 分 子 構 造 上 の 特 徴 について 理 解 を 高 める 必 要 がある. 構 成 単 位 のグルタミ ン 酸 は α- アミノ 基,α- カルボキシル 基,γ- カルボキシル 基 の3つの 反 応 性 に 優 れた 官 能 基 を 持 つ.したがって,そ の 結 合 様 式 によって,タンパク 質 と 同 質 のポリ-α-グルタ NH-C COOH 図 1. 化 学 繊 維 とバイオ 繊 維 図 2. 人 工 ポリ-α-グルタミン 酸 (A)と 天 然 ポリ-γ-グルタミン 酸 (B)の 分 子 構 造.グルタミン 酸 単 位 は 四 角 で 囲 んで 示 した. 著 者 紹 介 高 知 大 学 大 学 院 農 学 研 究 科 生 物 資 源 科 学 専 攻 ( 准 教 授 ) ashiuchi@cc.kochi-u.ac.jp 73

2 図 3.バイオキラルナイロンの 構 造 的 特 徴. 白 抜 きの 手 はアミ ノ 基, 黒 塗 りの 手 はカルボキシル 基 に 相 当 する. 顔 の 部 分 はポ リマーの 構 成 単 位 を 示 す.また,その 並 び 方 ( 図 2B, 影 付 き 部 分 に 相 当 )はタンパク 質 よりも 化 成 ナイロンの 基 本 骨 格 とよく 似 ている. ミン 酸 ( 図 2A)か,あるいはむしろ 化 成 ナイロンに 類 似 するPGA( 図 2B; 図 3)が 作 られる.これらの 基 本 骨 格 ( 図 2, 影 付 き)の 比 較 からも 分 かるように, 両 者 は 明 ら かに 異 質 材 料 である.すなわち, 主 鎖 部 分 がコンパクト で 側 鎖 同 士 の 間 隔 が 狭 い 前 者 では, 側 鎖 部 分 の 構 造 が 全 体 構 造 に 顕 著 に 影 響 する; 典 型 的 な 枝 分 れ 構 造 のポリア ミド 種 にあたる. 前 者 に 対 し, 後 者 は 直 鎖 性 の 繊 維 ポリ マー( 脂 肪 族 ポリアミドの 一 種 )と みなすことができる. さらに, 前 者 は 化 学 合 成 の 容 易 な 人 工 ポリグルタミン 酸 である 一 方, 後 者 は 人 工 合 成 が 非 常 に 困 難 な 材 料 3) という 違 いもある.PGAは 天 然 材 料 で, 安 全 性 や 環 境 負 荷 の 低 減 など, 前 者 にも 勝 る 優 位 な 機 能 性 を 持 ち 合 せて いる.しかし, 公 開 特 許 や 技 術 報 文 などを 見 ると,グル タミン 酸 の 重 合 ポリマーとして 十 把 一 絡 にされ,ど ちらも ポリグルタミン 酸 の 名 であたかも 同 じ 材 料 の ように 扱 われている 例 も 少 なくない. 誤 解 を 避 けるため に, 人 工 のポリ -α- グルタミン 酸 の 利 用 法 なのか 6,7), 天 然 ポリグルタミン 酸 であるPGAの 応 用 技 術 なのか, 技 術 評 価 も 含 め, 両 者 は 確 実 に 差 別 化 されるべきで 注 意 を 促 したい.また, 生 物 が 生 産 し 利 用 しているグルタミン 酸 ポリマーは,ポリ -α- グルタミン 酸 ではなく 主 に PGA で あるという 事 象 3) にも 注 目 していただきたい.タンパク 質 (α- ポリペプチド)の 合 成 システム リボソーム は 生 物 界 のほぼ 全 体 にわたり 保 存 され, 絹 糸 や 蜘 蛛 の 糸 は 事 実 リボソーム 依 存 的 に 生 産 される. 理 論 上 ポリ-α-グル タミン 酸 もリボソームの 働 きで 作 りだせる.にもかかわ らず, 天 然 に 存 在 するのはPGAである.PGAが 生 物 学 上 特 に 有 益 な 機 能 を 保 持 しているのか,さもなければポリ -α- グルタミン 酸 は 生 物 学 上 避 けなければならない 不 都 合 な 化 学 性 を 内 包 しているのかもしれない. バイオナイロンPGAのインビトロ 合 成 では,PGA はどのようにして 合 成 されるのであろう か? D- アミノ 酸 の 一 種 D- グルタミン 酸 を 豊 富 に 含 むというタンパク 質 や 一 般 のポリペプチドにはない 構 造 特 性 も 有 しており, 少 なくとも 非 リボソーム 依 存 のバイ オシステムによるものであることは 想 像 に 難 くない. 近 年,L- グルタミン 酸 含 有 培 地 で 培 養 した 納 豆 菌 を 用 い PGA を 発 酵 合 成 させるインビボ 研 究 が 精 力 的 に 進 めら れてきた 3,8).そのなかで PGA の 生 合 成 がペプチド 抗 生 物 質 の 生 合 成 機 構 を 模 倣 したチオテンプレート 仮 説 に 則 って 説 明 された 例 もある 9,10).しかし,この 仮 説 には 多 くの 問 題 点 が 指 摘 されてきた 3,11,12).たとえば, 従 来 の 発 酵 合 成 研 究 で 分 かるのは,L- グルタミン 酸 はあくま でも PGA の 生 産 に 重 要 な 培 地 成 分 ということのみで あって,これを 唯 一 の 生 合 成 基 質 とまで 断 定 するのは 困 難 な 点 や, 納 豆 菌 のPGAはグルタミン 酸 の 両 光 学 異 性 体 (D 体 と L 体 )がランダムに 連 結 したアタクティックポリ マー13) である 上, 分 子 サイズにおいても 均 一 性 を 欠 くな ど 3),チオテンプレート 機 構 に 従 って 合 成 されるポリア ミド 類 とは 明 らかに 異 なる 構 造 的 特 徴 が 見 られる 点 が 挙 げられる.さて, 図 3Bには, 立 体 規 則 性 に 優 れたバイオ ナイロン( 第 3の 手 が 規 則 的 に 上 に 伸 びたキラル 構 造 ) を 模 式 図 で 示 した. 実 際 には, 納 豆 菌 のPGAはこの 手 の 部 分 が 上 下 不 規 則 に 並 んでいる.キラルポリマーの 立 体 規 則 性 の 強 化 はその 高 機 能 材 料 化 につながる 重 要 課 題 で あり 3,14), 納 豆 菌 PGA 研 究 もこの 課 題 に 向 き 合 わざるを 得 ない.このような 状 況 打 破 と 課 題 解 決 を 目 指 し,まず PGAのインビトロ 合 成 について 検 討 した. 高 分 子 量 PGA をインビトロで 合 成 する 試 みはこれま でも 断 続 的 に 行 われてきた.しかしながら,PGA 合 成 シ ステムが 極 端 に 不 安 定 であったため 9),この 試 みに 目 立 った 進 展 はなかった. 最 近,インビトロで 合 成 された 微 量 の PGA でも 精 度 よく 回 収 できるマイクロ 精 製 技 術 15) の 開 発 に 成 功 し,これが 本 研 究 の 大 きなブレークスルー となった.たとえば, 納 豆 菌 種 において,PGA 合 成 活 性 は 細 胞 膜 に 局 在 することが 見 いだされた 16). 界 面 活 性 剤 などで 膜 酵 素 を 可 溶 化 すると, 本 合 成 活 性 が 完 全 に 失 わ れることも 明 らかにした. 先 にPGA 合 成 システムの 不 安 定 性 が 指 摘 されていたが, 膜 結 合 状 態 でのみ 機 能 発 現 す るという 本 システムの 特 性 はその 要 因 の 一 つと 考 えられ る.ちなみに, 膜 成 分 の 分 散 を 促 す 目 的 で 低 濃 度 の 界 面 活 性 剤 (~1 mm CHAPS)を 添 加 したところ,PGAのイ ンビトロ 合 成 に 好 結 果 を 与 えることが 判 明 した. 本 反 応 の 最 適 phは~7.0,mg 2+ は 機 能 発 現 に 必 須 であった 16). また,Zn 2+ は 低 濃 度 域 (~ 0.2 mm)では 本 反 応 を 促 進 するが, 逆 に 高 濃 度 域 (~ 5 mm)では 阻 害 的 に 働 くこ とも 分 かった 12). PGA 生 合 成 の 反 応 機 構 解 明 に 繋 がる 研 究 にも 取 り 組 んだ.まず, 副 反 応 として 発 生 する グルタミン 酸 依 存 ATP 加 水 分 解 に 注 目 し,これに 伴 って 生 成 される 核 酸 74 生 物 工 学 第 86 巻

3 種 を 調 べたところ,AMP ではなく ADP であることが 示 唆 された 17). 基 質 選 択 性 解 析 から,グルタミン 酸 の 立 体 化 学 性 (DL)に 対 する 選 択 性 は 厳 密 ではないことが 示 唆 された 16).また, 基 質 D- グルタミン 酸 からは D-PGA 鎖, 基 質 L-グルタミン 酸 からはL-PGA 鎖, 基 質 DL 混 合 グルタ ミン 酸 からは DL-PGA 鎖 が 各 々 合 成 された.この 結 果 は, PGA 鎖 の 伸 長 過 程 において,チオテンプレート 仮 説 で 提 唱 されてきた 特 殊 な 立 体 反 転 (L D) 9,10) は 発 生 しない ことを 意 味 している.また,このような 反 応 特 性 から, PGA 生 合 成 はアミド 連 結 機 構 18) に 則 って 進 行 するもの と 推 察 された 3). 事 実, 納 豆 菌 のPGA 合 成 遺 伝 子 群 にコー ドされる PgsBCA 複 合 体 のうち,その B 成 分 においてア ミド 連 結 酵 素 群 に 特 徴 的 なアミノ 酸 配 列 が 高 度 に 保 存 さ れていることが 分 かってきた 19). 現 在,PGA 合 成 反 応 は, 以 下 のメカニズムで 進 むと 予 想 されている. バイオナイロンPGAの 内 合 成 システム チオテンプレート 仮 説 ではPGAの 生 合 成 基 質 はL-グル タミン 酸 のみとされてきた. 一 方,アミド 連 結 機 構 によ れば, 納 豆 菌 種 の DL-PGAは DL 混 合 グルタミン 酸 から 合 成 されることになる. 不 明 瞭 な 部 分 が 残 るPGAの 内 合 成 システムについて 解 明 の 糸 口 を 得 るため, 納 豆 菌 種 の D- グルタミン 酸 供 給 酵 素 系 に 焦 点 を 当 てシステム 解 析 に 取 り 組 んだ.さて, 細 菌 の D-グルタミン 酸 供 給 ではグルタ ミン 酸 ラセマーゼの 働 きが 重 要 とされている 20). 本 アミ ノ 酸 は 確 かにペプチドグリカンの 生 合 成 に 必 須 だが 必 要 量 が 限 られているため, 本 酵 素 の 菌 体 内 活 性 は 一 般 に 検 出 できないほど 低 レベルである.ところが, 納 豆 菌 種 の 本 活 性 は 例 外 的 に 高 かった 21,22).この 事 実 は, 著 量 の D- グルタミン 酸 の 供 給 や 菌 体 内 プールの 形 成 が 納 豆 菌 の 生 理 学 上 重 要 なのか( 同 化 作 用 への 寄 与 ),D-グルタミン 酸 の 積 極 的 消 費 のためか( 異 化 作 用 への 寄 与 ),あるいはそ の 双 方 に 寄 与 する 可 能 性 を 示 唆 している. 興 味 深 いこと に, 納 豆 菌 や 枯 草 菌 は 二 種 の 機 能 性 グルタミン 酸 ラセ マーゼをアイソザイムとして 保 持 している 3,23). 一 つは RacE(Glr), 他 方 は YrpC(MurI)と 呼 ばれている 21,24). また,D-グルタミン 酸 供 給 との 関 係 では, 前 者 が 主 体 的 な 役 割 を 果 たし 後 者 はその 補 完 的 な 役 目 を 持 つ 25). 両 酵 素 を 欠 いた 変 異 株 では, 明 確 な D-グルタミン 酸 要 求 性 が 認 められた. また, 枯 草 菌 RacE 欠 損 株 (YrpCは 保 持 )では,D-グ ルタミン 酸 の 供 給 能 ( 内 合 成 能 )が 極 端 に 低 下 していた; この 変 異 株 を 宿 主 に PGA 合 成 システムを 強 制 発 現 させ 図 4.ポリ-γ-グルタミン 酸 の 内 合 成 システムと 納 豆 菌 種 の 膜 酵 素 画 分 を 利 用 したインビトロ 合 成.RacE, 高 触 媒 性 グルタミン 酸 ラセマーゼ;YrpC, 低 触 媒 性 グルタミン 酸 ラセマーゼ;PGS, ポリ -γ- グルタミン 酸 合 成 システム;DL-PGA,ポリ -γ-dl- グル タミン 酸 ;D-PGA,ポリ-γ-D-グルタミン 酸 ;L-PGA,ポリ-γ-L- グルタミン 酸. ることにより,D-グルタミン 酸 要 求 性 の 人 為 誘 導 が 可 能 となった 25). 以 上 の 結 果 は,PGAの 内 合 成 (インビボ 合 成 )においてもD-グルタミン 酸 が 生 合 成 基 質 の 一 つであ ることを 意 味 し, 上 述 のインビトロ 合 成 での 結 果 と 矛 盾 しないものであった. 予 想 されるPGA 内 合 成 システムの 概 要 を 図 4 にまとめた.これに 従 えば,グルタミン 酸 ラ セマーゼ 活 性 が 強 くD-グルタミン 酸 供 給 の 主 体 となって いる 細 菌 類 ( 納 豆 菌 など)では,PGAがDL 混 成 ポリマー として 発 酵 生 産 されることは 避 けられない.そのため, 立 体 規 則 性 に 優 れたPGAを 得 る 目 的 からすると,グルタ ミン 酸 ラセマーゼフリーの 膜 酵 素 画 分 が 利 用 できるイン ビトロ 合 成 は 非 常 に 優 れているといえる.その 一 方, 産 業 用 途 に 適 う 製 造 レベルを 実 現 するため,PGA 合 成 効 率 を 飛 躍 的 に 向 上 させるという 課 題 も 残 っている. 巨 大 菌 を 利 用 したバイオキラルナイロンL-PGAの 効 率 合 成 PGA のインビトロ 合 成 および 内 合 成 システムの 解 析 から,ここに 至 って, 菌 体 内 L-グルタミン 酸 のラセミ 化 が PGA のキラリティーにまで 多 大 な 影 響 を 及 ぼしてい ることが 分 かってきた.そこでまず, 代 表 的 なPGA 合 成 微 生 物 について,PGA キラリティーと D- グルタミン 酸 (D-Glu) 供 給 に 係 る 酵 素 活 性 の 見 かけの 相 関 を 調 査 し, 結 果 を 表 1 にまとめた. 納 豆 菌 や 韓 国 の 戦 国 醤 菌 な どの Bacillus subtilis では 比 較 的 高 いグルタミン 酸 ラセ マーゼ(GLRと 表 記 ) 活 性 を 有 する.また,インビボ 合 成 されたPGAの 立 体 化 学 性 (DL 比 率 )に 規 則 性 は 認 めら れず, 分 子 構 造 上 アタクティックということになる. 一 方, 炭 疽 菌 (Bacillus anthracis)はほぼ D 体 で 構 成 される D-PGAを 合 成 する 3). 文 献 によればGLR 活 性 は 認 められ ないものの, 顕 著 な D-アミノ 酸 アミノトランスフェラー ゼ(DATと 表 記 ) 活 性 が 検 出 されている 26).DATは, 他 2008 年 第 2 号 75

4 表 1.PGA 合 成 微 生 物 のD-グルタミン 酸 供 給 酵 素 活 性 PGA の D 体 D-Glu 供 給 酵 素 活 性 (U mg 1 ) a 微 生 物 含 有 率 (%) GLR DAT 文 献 納 豆 菌 65± , 21 戦 国 醤 菌 55±20 36 ~3 15, 16, 22 炭 疽 菌 100 b +++ b 3, 26 好 塩 古 細 菌 , 28 巨 大 菌 5.5±2.5 c < a 活 性 単 位 (U),nmol min 1. b, 活 性 検 出 されず;+++,きわめて 強 い 活 性. c 高 塩 液 体 培 地 (10% NaCl)を 使 用. の D-アミノ 酸 (D-アラニンやD-アスパラギン 酸 など)と α-ケトグルタル 酸 から, 基 質 D-アミノ 酸 に 対 応 するケト 酸 とD-グルタミン 酸 を 生 成 する 酵 素 である 3).GLRと 違 い,D-グルタミン 酸 の 合 成 にL-グルタミン 酸 の 存 在 は 必 須 条 件 とならない.したがってDATによれば, 原 理 上 細 胞 のグルタミン 酸 プールの D 比 率 を 一 方 的 に 高 めること も 可 能 である. さらに, 好 塩 古 細 菌 (Natrialba aegyptiaca)について 調 べたところ,GLR と DAT の 両 活 性 ともに 保 持 していな いことが 判 明 した 27). 興 味 深 いことに,この 極 限 環 境 微 生 物 が 合 成 するPGAは, 炭 疽 菌 PGAが 立 体 化 学 的 に 反 転 した 構 造 の L 型 ポリマーである 28).バイオキラルナイロ ン 新 材 料 として 種 々の 応 用 展 開 が 期 待 されているもの の, 元 来 生 息 環 境 中 で 発 生 する 乾 燥 と 脱 水 現 象 から 身 を 守 るように 合 成 される 一 種 の 環 境 適 応 因 子 と 考 えられ, 実 際, 量 産 化 の 基 礎 となる 液 体 培 養 法 ではPGAがほとん ど 合 成 できないという 致 命 的 な 欠 点 を 抱 えている.GLR と DAT の 活 性 を 指 標 に D- グルタミン 酸 供 給 系 の 調 査 を さらに 続 けたところ, 巨 大 菌 (Bacillus megaterium)もま たこの 両 酵 素 活 性 が 極 端 に 低 いことを 見 いだした 27) ( 表 1). 巨 大 菌 は 分 類 学 上 納 豆 菌 や 枯 草 菌 に 近 く, 生 育 条 件 から PGA 合 成 まで 酷 似 すると 信 じられてきた 3).と ころが, 納 豆 菌 のPGA 合 成 とは 多 くの 面 で 異 なることが 解 ってきた.たとえば, 巨 大 菌 PGAはL-グルタミン 酸 含 有 率 ( 光 学 純 度 に 相 当 )が 圧 倒 的 に 高 く( 表 1), 高 品 質 である. 巨 大 菌 は 本 来 好 塩 性 菌 ではないが, 高 塩 ストレ スに 曝 されると PGA 合 成 が 顕 著 に 誘 導 されることが 分 かってきた 27). 図 5 に 示 すように,NaCl 濃 度 が 2%を 超 えるとPGA 合 成 量 は 急 激 に 増 加 する; 細 菌 の 塩 応 答 バイ オナイロンポリマーの 最 初 の 発 見 例 にあたる.さらに, 海 水 の3 倍 に 相 当 する 塩 濃 度 (10%)までの 負 荷 に 伴 い, PGA 分 子 は 著 しく 伸 長 した( 図 5,SDS-PAGE);この 現 象 はここまでまったく 知 られていなかったものである. インビボ 合 成 PGAの 質 の 管 理 はこれまで 困 難 とされ てきたが, 巨 大 菌 PGAは 現 状 打 破 につながる 有 力 候 補 と 図 5. 巨 大 菌 の 塩 誘 導 性 バイオナイロンポリマー.バイオナイ ロンPGAは,SDS-PAGE 後,メチレンブルー 染 色 法 3) で 視 覚 化 できる( 上 図 ). して 重 要 性 が 増 している 29). バイオナイロンPGAの 酵 素 加 工 炭 疽 菌 は 莢 膜 成 分 としてD-PGAを 合 成 し 細 胞 表 層 を 覆 うことで 感 染 宿 主 の 免 疫 網 から 逃 れている 30). 免 疫 無 効 化 を 導 くポリマー 効 果 を 逆 手 に 取 れば, 先 端 医 薬 ( 抗 が ん 剤 など)の 副 作 用 軽 減 や 更 なる 高 機 能 化 まで 期 待 でき る 3,31).ただし, 炭 疽 菌 を 利 用 したポリマー 量 産 化 は 安 全 性 の 面 から 事 実 上 不 可 能 で,D 比 率 の 高 いPGAについ ても 新 たな 合 成 技 術 の 開 発 が 求 められていた. 納 豆 菌 種 のPGA 代 謝 ( 合 成 と 分 解 )オペロン, 特 にPGA 合 成 遺 伝 子 群 pgsbca のすぐ 下 流 に 存 在 する 新 機 能 遺 伝 子 (pgds; 以 前 は ywtd)の 研 究 32) がブレークスルーとなった. 本 遺 伝 子 産 物 PgdS 酵 素 では,アミダーゼ(アミド 加 水 分 解 酵 素 ) 様 ドメインが3つタンデムに 並 んでいる( 図 6). したがって,エンドペプチダーゼ 群 のなかでも 特 殊 な 構 造 と 機 能 を 備 えた 酵 素 と 考 えられた. 最 近, 本 酵 素 の 簡 易 精 製 法 の 開 発 に 成 功 した 32). 次 の 課 題 として, 簡 便 か つ 精 密 な 活 性 測 定 技 術 の 確 立 が 挙 げられ, 本 技 術 開 発 に も 取 り 組 んだ. 結 果, 先 に 構 築 したPGA 分 子 サイズ 解 析 図 6.ポリ-γ-グルタミン 酸 代 謝 オペロン 内 のpgdS (ywtd) 遺 伝 子 の 位 置 とPgdS 酵 素 の 構 造 特 性.PgdS 酵 素 のNはアミノ 基 末 端, C はカルボキシル 基 末 端 を 示 す. 色 付 きのボックスはアミダー ゼ 様 ドメイン 領 域 を 示 し, 特 に 中 央 のドメインには 活 性 発 現 に 必 須 のシステイン 残 基 (*)が 存 在 するものと 予 想 される. 76 生 物 工 学 第 86 巻

5 表 2.PgdS 酵 素 の 反 応 速 度 定 数 基 質 立 体 化 学 性 (D:L) K m (nm) V max (U mg 1 ) a 納 豆 菌 PGA 75: 巨 大 菌 PGA 20:80 b 好 塩 古 細 菌 PGA 0:100 c a 活 性 単 位 (U),1 分 間 に 1 nmol の PGA の 末 端 アミノ 基 を 形 成 する 触 媒 量. b 低 塩 固 体 培 地 (0.05% NaCl)を 使 用 34). c 活 性 検 出 されず. 法 16,33) の 適 用 が 有 効 であった 34). 具 体 的 には,1-fluoro- 2,4-dinitrobenzene(FDNB)による 化 学 定 量 法 を 用 いる もので, 既 存 技 術 の 適 用 35) と 比 較 して 簡 便 迅 速 で 再 現 性 定 量 性 の 面 でも 優 れていた 5,33). ここでは FDNB 法 を 用 い,PgdS 酵 素 の 性 質 を 調 査 し た. 納 豆 菌 のPGAにはよく 作 用 するものの, 人 工 のポリ -α- グルタミン 酸 にはまったく 作 用 しないことが 判 明 し た 34).すなわち, 本 酵 素 はグルタミン 酸 ポリマーでも 天 然 の 結 合 様 式 を 持 つものを 厳 密 に 認 識 していることを 意 味 する. 反 応 最 適 ph は~ 6.0, 最 適 温 度 は 30 ~ 40 C, 熱 安 定 性 は 50 C 付 近 であった 34). 本 酵 素 はその 反 応 に 補 酵 素 補 欠 因 子 を 一 切 要 求 しない. 一 方,チオール 修 飾 剤 の 添 加 によって 容 易 に 失 活 するため 34), 活 性 発 現 に 必 須 のシステイン 残 基 が 存 在 すると 示 唆 された. 続 いて, 立 体 化 学 性 の 異 なる PGA を 基 質 に 反 応 速 度 論 解 析 を 行 った( 表 2).K m 値 の 比 較 からD 比 率 の 高 いポリマーほ どよい 基 質 になることが 判 明 した.また, 納 豆 菌 PGAと 巨 大 菌 PGA に 対 する 最 大 反 応 速 度 は 比 較 的 近 い 値 と なった. 一 方, 好 塩 古 細 菌 の L-PGAは 基 質 にならなかっ たことから, 少 なくともPGA 鎖 中 の D 体 が 存 在 する 領 域 ( 配 列 )が 切 断 部 位 と 認 識 されていることが 分 かった 34). さて, 納 豆 菌 PGA を PgdS 酵 素 で 十 分 に 処 理 すると 次 の フローチャートのような 断 片 化 が 起 こる. このように, 本 酵 素 を 利 用 することでPGAの 立 体 規 則 性 が 効 果 的 に 改 善 できる 32).そこで, 新 たに PGA 加 工 酵 素 と 名 づけた. 本 反 応 機 構 に 係 る 知 識 ( 切 断 部 位 の 情 報 など)をさらに 深 めるため,PGA 加 工 断 片 の 両 末 端 構 造 について 解 析 を 進 めた. 具 体 的 には, 加 工 断 片 のア ミノ 基 末 端 配 列 は 納 豆 菌 の γ- グルタミルトランスフェ 図 7.ポリ -γ-グルタミン 酸 加 工 酵 素 の 推 定 反 応 機 構.PGA 鎖 の アミノ 基 末 端 を N,γ- カルボキシル 基 末 端 を C で 表 した.PGA の 一 部 を 拡 大 した 領 域 ( 黒 塗 り 部 分 )について,D 単 位 に 富 む 部 分 を,L 単 位 に 富 む 部 分 を で 表 した. 推 定 される 切 断 部 位 は 矢 印 で 示 した. ラーゼを 用 いて 解 析 し,カルボキシル 基 末 端 配 列 は 細 菌 性 カルボキシペプチダーゼGを 用 いて 解 析 した 34).その 結 果,D-rich PGAはもちろん L-rich PGAでもその 両 末 端 には D- グルタミン 酸 が 連 続 していることが 示 唆 された. すなわち,このことは 切 断 部 位 が PGA 鎖 の DD 連 結 部 位 であることを 意 味 する. 以 上 の 解 析 結 果 から, 本 酵 素 はPGA 鎖 中 の D-グルタミ ン 酸 に 富 む 領 域 を 認 識 しこれを 切 断 するエンドペプチ ダーゼ γ-glutamyl DD-amidohydrolase との 結 論 に 達 した( 図 7). 本 技 術 は, 炭 疽 菌 などの 安 全 上 問 題 のある 微 生 物 に 頼 ることなく, 納 豆 の 糸 という 食 物 材 料 と 納 豆 菌 起 源 の 酵 素 のみを 使 って 立 体 規 則 性 PGA が 加 工 合 成 できる 点 で 優 れている. 食 健 康 コスメ 医 療 などの 人 間 科 学 的 な 産 業 応 用 分 野 に, 特 段 の 安 全 性 を 誇 るバイオキラルナ イロン 素 材 を 提 供 するための 基 礎 を 築 いたものであり, 学 術 的 な 価 値 もある. バイオキラルナイロン L-PGAの 新 たな 応 用 性 ポリグルタミン 酸 に 係 る 先 行 技 術 を 調 査 すると, 事 実 上 人 工 のポリ-α-グルタミン 酸 によるものか,バイオナイ ロンでも 納 豆 菌 などの DL-PGA によるものに 限 られてい たことに 気 づく 3,5,36). 最 近,DL-PGA からの 機 能 材 料 化 の 効 率 や 再 現 性 に 問 題 があることが 指 摘 された 37). 同 時 に, 立 体 規 則 的 なPGAは 材 料 化 の 点 でも 優 れていること が 示 されている 37).キラル 材 料 の 性 能 は, 基 本 的 にその 立 体 規 則 性 の 影 響 下 にあることがポリ 乳 酸 の 例 からも 解 る 14).バイオナイロンのなかでもL-PGAは 新 素 材 の 部 類 に 入 るため 3), 特 に 応 用 性 に 関 し, 今 もなお 多 くの 未 開 領 域 が 残 されている.そこでまず, 環 境 ストレスに 対 す るバリア 機 能 を 解 析 するため, 大 腸 菌 ( 生 細 胞 )の L-PGA 共 存 下 での 生 育 特 性 を 調 べた.その 結 果, 本 来 ならば 増 殖 できないような 極 限 環 境 下 ( 強 アルカリや 高 塩 条 件 ) でも 生 育 能 が 高 まることを 発 見 した( 図 8).さらに, 多 様 な 物 理 化 学 的 ストレスによって 変 性 ( 機 能 喪 失 )しや すい 酵 素 に 対 してもバリア 機 能 を 発 揮 し, 超 安 定 化 に 寄 与 することが 判 明 した. 具 体 的 には, 耐 熱 性 アルカリ 耐 性 プロテアーゼ 耐 性 耐 凍 性 など, 多 様 なストレス 2008 年 第 2 号 77

6 図 8. 極 限 環 境 下 での 大 腸 菌 の 生 育 能 に 及 ぼすバイオキラルナ イロンの 効 果.(A)アルカリ 環 境 下 での 生 育.(B) 高 塩 環 境 下 での 生 育. 各 ph および 塩 濃 度 の LB 培 地 を 用 い,L-PGA 添 加 ( )および 無 添 加 ( )の 条 件 で 菌 体 培 養 した 40) ; 最 適 培 養 条 件 での 菌 体 濁 度 を 生 育 率 100%とし 他 の 条 件 での 生 育 率 を 算 出 した. 図 10.バイオキラルナイロンの 多 様 で 有 用 な 機 能 性,ならびに 新 バイオ 先 端 材 料 として 期 待 されている 多 角 的 産 業 応 用 展 開 いることも 分 かってきた. 多 機 能 性 新 素 材 バイオキラ ルナイロンのさらなる 活 用 を 図 り,バイオ 工 学 技 術 の 発 展 に 貢 献 したいと 考 えている. おわりに 図 9.バイオキラルナイロンの 接 着 性 試 験.(+)は 低 付 着 性 の セルロースアセテート 膜 を 高 付 着 性 タンパク 質 牛 血 清 アルブ ミン 溶 液 ( 上 図 )とバイオキラルナイロン 溶 液 ( 下 図 )に 浸 した 後, 水 洗 して 得 たサンプルを,( )は 試 験 溶 液 として 蒸 留 水 を 代 用 して 得 たコントロールサンプルを 示 す.タンパク 質 は トリパンブルー 染 色 法 41) で,バイオナイロンはメチレンブルー 染 色 法 で 選 択 的 に 視 覚 化 できる. 耐 性 がバイオキラルナイロンL-PGAの 添 加 のみで 賦 与 で きる 38).この 発 見 は, 材 料 応 用 の 面 で 特 に 注 目 に 値 する と 考 えられる. 極 限 環 境 微 生 物 が 生 合 成 するスーパーオ スモライトは エクストリモライト とも 呼 ばれ 39),バ イオ 工 学 上 の 新 応 用 が 期 待 されている.バイオキラルナ イロンはまさにこの 範 疇 に 入 るものと 考 えられる. 一 方, オスモライト( 適 合 溶 質 )はここに 至 るまで 細 胞 内 に 存 在 すると 思 われていたため, 図 らずも 本 例 が 菌 体 ( 細 胞 ) 外 に 存 在 するエクストリモライト 機 能 物 質 の 最 初 の 発 見 となった. 加 えて, 細 胞 外 で 機 能 することの 応 用 面 での 意 義 は 大 きく, 従 来 必 要 と 思 われてきた 遺 伝 子 組 換 えな どによる 機 能 導 入 や 細 胞 の 分 子 育 種 のような 煩 雑 な 人 為 操 作 が 不 要 となる.さらに, 図 9 に 示 すように,バイオ キラルナイロンは 物 質 表 面 への 接 着 被 膜 効 果 に 優 れて 汎 用 ナイロン 素 材 やアラミドスーパー 繊 維 に 代 表 され る 化 学 合 成 ポリアミドは 現 代 社 会 産 業 を 支 える 重 要 材 料 ということに 間 違 いはないものの, 脱 石 油 化 や 環 境 対 応 など, 突 きつけられた 課 題 も 多 い.バイオ 起 源 のキラ ル 材 料 への 転 換 は 今 日 的 な 要 請 となっているが, 立 体 規 則 性 の 強 化 や 合 成 効 率 の 向 上 量 産 化 など, 合 繊 開 発 で は 問 題 にならないものが 律 速 的 な 課 題 として 新 たに 浮 き 彫 りになってきた. 今 回,PGAの 機 能 材 料 化 につながる 最 重 要 課 題 立 体 規 則 性 の 強 化 制 御 に 対 応 できる 技 術 基 盤 を 築 くまで に 至 った.PGA の 潜 在 的 な 応 用 性 有 用 機 能 性 が 次 々と 発 見 されていることに 加 え,バイオキラルナイロンの 効 率 合 成 も 可 能 になってきた. 現 在, 本 材 料 はセルロース ナノファイバー バイオポリエステルに 次 ぐ 第 3 のバイ オ 先 端 材 料 として, 多 角 的 な 産 業 応 用 展 開 が 強 く 望 まれ ている( 図 10). 本 研 究 は 高 知 大 学 農 学 部 応 用 生 物 化 学 研 究 室 および 総 合 研 究 センター 遺 伝 子 実 験 施 設 で 行 った 仕 事 です.この 度 の 栄 誉 は, 研 究 室 に 在 籍 し 共 に 研 究 を 進 めてくれた 大 学 院 生 と 学 部 生 の 力 なくしては 得 られなかったものです.まず, 研 究 に 携 わっ てくれた 学 生 の 皆 さんに 感 謝 の 意 を 示 したいと 思 います. 筆 者 の 研 究 を 絶 えず 温 かい 目 で 支 えて 下 さいました 味 園 春 雄 先 生 ( 高 知 大 学 名 誉 教 授 ), 左 右 田 健 次 先 生 ( 京 都 大 学 名 誉 教 授, 関 西 大 学 名 誉 教 授 )に 深 謝 いたします. 研 究 の 方 向 性 を 見 定 める にあたり, 多 大 なるご 助 言 を 頂 きました 東 京 工 業 大 学 イノベー ション 研 究 推 進 体 の 本 宮 達 也 先 生 に 厚 く 御 礼 申 し 上 げます.ま た, 本 賞 の 受 賞 に 際 しまして, 推 薦 いただきました 九 州 大 学 農 学 研 究 院 の 大 島 敏 久 教 授 に 御 礼 申 し 上 げます. 共 同 研 究 者 であ 78 生 物 工 学 第 86 巻

7 ります 韓 国 国 民 大 学 の 成 文 喜 教 授, 東 洋 紡 績 株 式 会 社 敦 賀 バイ オ 研 究 所 の 曽 我 部 敦 氏 にこの 場 を 借 りて 感 謝 致 します. 最 後 に,ひとときのやすらぎと 活 力 をくれる 妻 と 息 子 と 一 緒 にこの 喜 びを 分 ち 合 いたいと 思 います. 文 1) 経 済 産 業 省 /NEDO 技 術 戦 略 マップ,ものづくり 分 野 (ファ イバー 分 野 ),p (2007). 2) 磯 貝 明 : 機 能 材 料, 27, (2007). 3) Ashiuchi, M. and Misono, H: Biopolymers (Fahnestock, S. R. and Steinbüchel, A.), Vol.7, p Wiley-VCH, Weinheim (2002). 4) Shih, I. L. and Van, Y. T.: Bioresour.. Technol., 79, (2001). 5) Sung, M. H., Park, C., Kim, C. J., Poo, H., Soda, K., and Ashiuchi, M: Chem. Rec., 5, (2005). 6) 森 本 惠 治, 谷 口 浩 司, 高 岸 徹, 林 壽 郎 : 生 体 材 料, 19, (2001). 7) 佐 藤 正 樹, 市 毛 昭 弘, 江 村 智 子, 中 平 隆 幸, 岩 淵 晋 : 高 分 子 学 会 予 稿 集, vol. 40, p. 526 (1991). 8) Kunioka, M. and Goto, A.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, (1994). 9) Troy, F. A.: J. Biol. Chem., 248, (1973). 10) 伊 藤 義 文 :バイオサイエンスとインダストリー, 57, (1999). 11) Ashiuchi, M., Kamei, T., and Misono, H.: J. Mol. Catal. B: Enzym., 23, (2003). 12) 芦 内 誠 : 生 化 学, 印 刷 中 (2008). 13) Tanaka, T., Fujita, K., Takenishi, S., and Taniguchi, M.: J. Ferment. Bioeng., 84, (1997). 14) Engelberg, I. and Kohn, J.: Biomaterials, 12, (1991). 15) Ashiuchi, M. and Misono, H.: D-Amino Acids: A New Frontier in Amino Acid and Protein Research Practical Methods and Protocols (Konno, R., Brückner, H., D Aniello, A., Fisher, G., Fujii, N., and Honma, H.), p , Nova Science Publishers, NY (2007). 16) Ashiuchi, M., Shimanouchi, K., Nakamura, H., Kamei, T., Soda, K., Park, C., Sung, M.H., and Misono, H.: Appl. Environ. Microbiol., 70, (2004). 17) Ashiuchi, M., Nawa, C., Kamei, T., Song, J. J., Hong, S. P., Sung, M. H., Soda, K., and Misono, H.: Eur. J. Biochem., 268, (2001). 18) Eveland, S. S., Pompliano, D. L., and Anderson, M. S.: Biochemistry, 36, (1997). 19) Ashiuchi, M., Soda, K., and Misono, H.: Biochem. Biophys. 献 Res. Commun., 263, 6 12 (1999). 20) Yoshimura, T. and Esaki, N.: J. Biosci. Bioeng., 96, (2003). 21) Ashiuchi, M., Tani, K., Soda, K., and Misono, H.: J. Biochem., 123, (1998). 22) Ashiuchi, M., Kamei,T., Baek, D. H., Shin, S. Y., Sung, M. H., Soda, K., Yagi, T., and Misono. H.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 57, (2001). 23) Ashiuchi, M., Soda, K., and Misono, H.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, (1999). 24) Ashiuchi, M., Kuwana, E., Komatsu, K. Soda, K., and Misono, H.: FEMS Microbiol. Lett., 223, (2003). 25) Ashiuchi, M., Nishikawa, Y., Matsunaga, K., Yamamoto, M., Shimanouchi, K., and Misono, H.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 362, (2007). 26) Thorne, C. B. and Molnar, D. M.: J. Bacteriol., 70, (1955). 27) Shimizu, K., Nakamura, H., and Ashiuchi, M.: Appl. Environ. Microbiol., 73, (2007). 28) Hezayen, F. F., Rehm, B. H. A., Tindall, B. J., and Steinbüchel, A.: Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 51, (2001). 29) 特 開 (2007). 30) Mock, M. and Fouet, A.: Annu. Rev. Microbiol., 55, (2001). 31) Shih, I. L., Van, Y. T., and Shen, M. H.: Mini Rev. Med. Chem., 4, (2004). 32) Ashiuchi, M., Nakamura, H., Yamamoto, T. Kamei, T., Soda, K., Park, C., Sung, M. H., Yagi, T., and Misono, H.: J. Mol. Catal. B: Enzym., 23, (2003). 33) Park, C., Choi, J. C., Choi, Y. H., Nakamura, H., Shimanouchi, K., Horiuchi, T., Misono, H., Sewaki, T., Soda, K., Ashiuchi, M., and Sung, M. H.: J. Mol. Catal. B: Enzym., 35, (2005). 34) Ashiuchi, M., Nakamura, H., Yamamoto, M., and Misono, H.: J. Biosci. Bioeng., 102, (2006). 35) Suzuki, T. and Tahara, Y.: J. Bacteriol., 185, (2003). 36) 37) 特 願 (2006). 38) 特 開 (2007). 39) Lentzen, G. and Schwarz, T.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 72, (2006). 40) Ashiuchi, M.: The 10th Pacific Polymer Conference (PPC10) Preprints, p.259 (2007). 41) Shen, W. C., Yang, D., and Ryser, H. J: Anal. Biochem., 142, (1984) 年 第 2 号 79

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