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1 ( ) 水 素 発 生 用 バイオ 分 子 デバイスの 開 発 研 究 代 表 者 Matthias Rögner 研 究 分 担 者 三 宅 淳 Karl-Erich Jäger Thomas Happe Jean-Luc Popot 羽 藤 正 勝 馬 場 照 彦 ルール 大 学 ボッフム:ドイツ 産 業 技 術 総 合 研 究 所 : 日 本 ルール 大 学 ボッフム:ドイツ ボン 大 学 :ドイツ CNRS, 国 立 科 学 研 究 センター:フランス 産 業 技 術 総 合 研 究 所 : 日 本 産 業 技 術 総 合 研 究 所 : 日 本 研 究 期 間 :2001 年 4 月 ~2004 年 3 月 概 要 太 陽 エネルギーを 用 いて 水 から 水 素 を 生 産 可 能 なバイオ 分 子 デバイスの 開 発 を 目 的 とする 当 該 デバイスは バ イオ 分 子 である 光 化 学 系 1 2(PS1, PS2, 光 による 水 分 解 反 応 を 行 うタンパク 質 ) ヒドロゲナーゼ(H 2 ase, プロトンを 還 元 し 水 素 発 生 を 行 うタンパク 質 )と 人 工 物 質 のITO 電 極 メチルビオロゲン(メディエーター)で 構 成 される これら の 要 素 分 子 を 電 極 基 板 上 に 三 次 元 的 に 組 織 化 することにより 光 エネルギーを 水 素 エネルギーに 変 換 するデバイス の 構 築 が 可 能 である PS2による 水 分 解 反 応 PS1による 電 荷 分 離 H 2 aseによるプロトンの 還 元 反 応 から 成 る 各 反 応 行 程 全 てを 電 極 基 板 上 で 行 うことは 開 発 期 間 中 には 成 功 しなかった しかし 基 板 上 へのPS1とH 2 aseの 積 層 は 可 能 であり 各 々の 活 性 は 基 板 上 でも 維 持 された また 基 板 上 のH 2 aseと 溶 液 中 のPS1との 間 で 光 駆 動 型 の 水 素 発 生 反 応 が 観 察 された 当 該 研 究 は バイオ 分 子 と 人 工 物 質 のカップリングというナノバイオテクノロジーの 一 分 野 を 構 築 することが 可 能 と 考 える キーワード: バイオ 分 子 デバイス 光 合 成 水 素 ヒドロゲナーゼ 1.はじめに 当 該 プロジェクトは 生 物 学 的 モジュール(バイオ 分 子 デバイス)を 用 いた 太 陽 光 エネルギーと 水 からの 直 接 的 な 水 素 生 産 に 寄 与 するモデル システムの 構 築 を 目 的 としている バイオ 分 子 デバイスの 構 成 要 素 は 光 合 成 微 生 物 由 来 の 光 化 学 系 ヒドロゲナーゼ 電 子 伝 達 鎖 などとこれらの 機 能 性 タンパク 質 を 安 定 化 する 化 学 物 質 である 当 該 プロジェクトを 通 して 適 当 な 電 極 基 板 上 にヒドロゲナーゼなどを 積 層 固 定 化 し 電 気 化 学 的 な 水 素 発 生 に 成 功 し

2 た 当 該 プロジェクトの 目 的 を 達 成 するためには 光 化 学 系 の 工 学 的 なアプローチと 長 時 間 の 光 照 射 条 件 下 にお いても 機 能 性 タンパク 質 の 配 向 性 や 安 定 性 を 保 つことが 不 可 欠 である 当 該 プロジェクトの 研 究 成 果 は 機 能 性 タン パク 質 の 質 的 量 的 効 率 的 な 改 善 による 高 速 化 機 能 性 タンパク 質 を 長 期 に 安 定 化 させる 特 定 の 化 学 物 質 の 添 加 光 化 学 系 1と 光 化 学 系 2を 用 いたエネルギー 変 換 構 造 の 最 適 化 などを 解 決 することにより 高 効 率 なバイオ 分 子 デバイスの 開 発 が 可 能 であることを 示 唆 した 機 能 性 タンパク 質 を 安 定 化 させる 化 学 物 質 は アンピィポールと 呼 ば れる 天 然 物 由 来 もしくは 人 工 的 に 合 成 された 特 別 な 脂 質 分 子 や 完 全 合 成 された 高 分 子 である 当 該 デバイスの 開 発 に 適 当 なアンピィポールの 設 計 選 択 により 疎 水 性 の 膜 タンパク 質 である 光 化 学 系 1と 光 化 学 系 2を 完 全 に 水 溶 性 タンパク 質 にすることが 可 能 となる この 研 究 結 果 は 水 素 発 生 用 バイオ 分 子 デバイスの 設 計 組 織 化 における 機 能 性 タンパク 質 のハンドリングを 容 易 にするために 非 常 に 重 要 と 考 える 当 該 プロジェクトでは 様 々な 電 極 基 板 表 面 の 性 状 を 評 価 し デバイス 上 のヒドロゲナーゼ 活 性 を 電 流 電 圧 曲 線 (CVカーブ)の 測 定 により 明 らかにすることに 成 功 した 当 該 技 術 は 水 からの 光 駆 動 型 水 素 発 生 がモデルシステム においても 可 能 であることを 証 明 した さらに 水 素 発 生 ユニットであるヒドロゲナーゼの 質 的 量 的 な 改 善 を 試 み 様 々な 微 生 物 から 高 効 率 高 安 定 性 を 有 するヒドロゲナーゼのスクリーニングの 検 討 を 行 った 当 該 デバイスの 開 発 において 最 も 深 刻 な 問 題 であるヒドロゲナーゼの 酸 素 感 受 性 を 解 決 するため タンパク 質 工 学 により 最 も 高 活 性 なヒ ドロゲナーゼの 選 択 を 試 みている 当 該 研 究 は 現 在 も 進 行 中 であり ヒドロゲナーゼの 活 性 向 上 とスクリーニング 方 法 について 直 接 的 な 変 異 株 の 育 種 方 法 や 直 接 的 な 水 素 発 生 のための 研 究 を 行 っている 当 該 NEDO-プロジェクトの 研 究 成 果 は 太 陽 光 と 水 からの 最 も 効 率 的 な 光 水 素 生 産 のために 評 価 された 全 ての 構 成 要 素 から 成 るバイオ 分 子 デバイスを 工 業 的 に 生 産 出 来 る 可 能 性 を 示 唆 した 全 ての 最 適 化 された 自 己 組 織 化 機 能 を 有 する 機 能 性 タンパク 質 - 藍 色 細 菌 様 の-の 人 工 物 上 での 組 織 化 は 様 々な 機 能 の 発 現 を 目 的 としたバイオ 分 子 デバイス 開 発 における 基 礎 的 な 知 見 を 得 られたばかりでなく 少 なくとも 実 現 が 可 能 であることを 示 唆 した 当 該 プ ロジェクトにおけるバイオ 分 子 デバイスの 概 念 図 を 示 す :

3 当 該 プロジェクトのトピックと 目 的 は 水 素 を 生 産 することが 可 能 な 半 人 工 的 なデバイス( 水 素 発 生 用 バイオ 分 子 デ バイス)の 構 築 にある 本 デバイスの 駆 動 エネルギーは 太 陽 光 から 供 給 される 光 エネルギーと 酸 素 発 生 型 光 合 成 ( 植 物 型 光 合 成 )による 水 からの 引 き 抜 かれた 電 子 を 利 用 できなくてはならない これらのエネルギーは 基 本 的 にフリ ーであり 酸 素 発 生 型 光 合 成 反 応 による 水 分 解 は 何 億 年 も 以 前 から 構 造 やシステムが 自 然 界 で 最 適 化 されてい る 我 々の 戦 略 は 当 該 デバイスの 開 発 に 最 適 な 天 然 物 由 来 の 器 官 や 人 工 的 な 材 料 を 活 用 することにある 我 々 は 天 然 物 由 来 の 器 官 として 光 の 集 光 荷 電 分 離 に 適 した 安 定 した 光 合 成 器 官 水 素 発 生 用 触 媒 としてのヒドロゲ ナーゼを 選 択 した これらの 天 然 物 由 来 の 器 官 タンパク 質 は 人 工 的 な 界 面 活 性 剤 脂 質 高 分 子 などで 安 定 化 し なければならない また 電 子 は 最 適 な 電 子 供 与 体 電 子 受 容 体 間 を 伝 達 されなければならなく 同 時 に 電 子 はこ れらの 人 工 的 な 物 質 を 固 定 化 するのにも 使 われる これらの 天 然 物 と 人 工 物 による 反 応 プロセスは 最 終 的 には 自 己 修 復 自 己 組 織 化 機 能 を 有 する 自 然 のデバイスと 同 じにならなくてはならない 本 報 告 書 は 水 素 発 生 用 バイオ 分 子 デバイスの 開 発 に 必 要 な 各 天 然 物 人 工 物 の 選 択 方 法 組 織 化 について 報 告 する 図 2. 水 素 発 生 用 デバイスの 概 念 図 : a) 短 - 中 期 的 な 開 発 目 標 システム( 構 築 可 能 な 様 々なシステムの 一 例 ) b) 中 - 長 期 的 な 開 発 目 標 システム( 自 己 修 復 組 織 化 が 可 能 なシステム). 2. 実 験 方 法 ヒドロゲナーゼ 光 合 成 器 官 電 子 伝 達 物 質 (チトクロームcなど)などの 天 然 物 由 来 の 分 子 は 定 法 に 従 い 藍 色 細 菌 (Thermosynechococcus elongatus) 光 合 成 細 菌 など(Thiocapsa 属 Rhodospirillum rubrum, E. Coli)と 緑 藻 類 ( 種 々のChlamydomonas)のような 微 生 物 から 抽 出 され 精 製 される バイオ 分 子 を 安 定 してデバイス 化 する 際 に 用 い る 人 工 合 成 した 糖 脂 質 (Mal 3 Phyt 2 など)とアンピィポールは 当 該 プロジェクト 実 施 中 に 独 自 に 設 計 し 合 成 された ラングミュア-ブロージェット 法 によるバイオ 分 子 の 固 定 化 は シラン 修 飾 されたガラス ITO- 電 極 または 金 属 電 極 上 で 行 われた 3. 実 験 結 果 3-1.デバイス 作 製 のためのバイオ 分 子 の 選 択 方 法 と 最 適 化 好 熱 性 藍 色 細 菌 Thermosynechococcus elongatusの 光 化 学 系 1と 光 化 学 系 2は 優 れた 安 定 性 と 比 活 性 を 有 し 水 素 発 生 用 バイオ 分 子 デバイスの 開 発 に 最 適 であった 両 光 合 成 器 官 をヒスチジンによって 標 識 することで 25リット

4 ルのフォトバイオリアクターを 用 いた 後 の 抽 出 精 製 工 程 を 簡 易 化 した 光 化 学 系 1と 光 化 学 系 2の 活 性 と 長 期 に 渡 る 安 定 性 は 可 溶 化 の 為 の 界 面 活 性 剤 を 前 述 の 糖 脂 質 やアンピィポールにすることで さらに 改 善 された 脂 質 の 場 合 には 一 連 の 人 工 的 に 設 計 された 脂 質 の 間 で 最 適 なものは Mal 3 Phyt 2 ( 驚 異 的 な 安 定 性 を 有 する 糖 脂 質 )であっ た 可 能 な 選 択 肢 として 三 次 元 的 に 合 成 された 脂 質 による 基 礎 実 験 を 行 った とりわけ 溶 解 性 と 長 期 安 定 性 ( 日 単 位 から 週 単 位 まで)は アンピィポールを 用 いることにより 改 善 することが 可 能 であった 基 本 的 なアンピィポール から 始 めて 安 定 性 はNAPol Lの 使 用 によって 増 加 した そして アンピィポールは 特 に 酸 性 ph 条 件 における 安 定 性 維 持 のために 設 計 された Thiocapsa roseopersinicaのni-fe-ヒドロゲナーゼが 極 めて 良 好 な 安 定 性 と 酸 素 耐 性 を 有 することから 当 該 デバイスに 使 用 するヒドロゲナーゼとして 選 択 した 同 時 にChlamydomonasのFe-ヒドロゲナー ゼ( 最 も 単 純 で 最 も 高 活 性 )についても 工 学 的 な 利 用 を 試 みた 40 株 以 上 の 緑 藻 類 Chlamydomonas moewusiiをスクリ ーニングし 高 活 性 ヒドロゲナーゼの 単 離 を 試 み 緑 藻 の5 倍 以 上 活 性 が 高 いヒドロゲナーゼを 単 離 することに 成 功 し た その 緑 藻 を 用 いて ヒドロゲナーゼ 大 量 発 現 を 目 的 とした 遺 伝 子 工 学 的 な 検 討 を 試 みた 3-2. 超 薄 タンパク 質 膜 の 作 成 安 定 したPS1 PS2やヒドロゲナーゼの 単 分 子 膜 は ポリビオロゲン 類 (PBV POV PDVとPBenV)などを 含 む 緩 衝 溶 液 表 面 で 形 成 される ヒドロゲナーゼ PS1やPS2とこれらの 混 合 物 界 面 活 性 剤 から 成 るラングミュア-ブロージェ ット 膜 は 水 晶 振 動 子 ITOガラス ガラスカーボン 電 極 表 面 に 形 成 され 紫 外 - 可 視 スペクトルやヒドロゲナーゼの 活 性 を 測 定 される 水 平 引 き 上 げ 方 法 は 従 来 の 垂 直 引 き 上 げ 方 法 より 安 定 した 膜 が 形 成 することが 可 能 であった 修 飾 電 極 上 に 形 成 したPS1/ 高 分 子 (ビオロゲン) 複 合 体 LB 膜 のサイクリック-ボルタングラムの 測 定 により 顕 著 な 還 元 ピークを 計 測 した この 結 果 は 電 極 基 板 上 に 組 織 化 されたバイオ 分 子 - 人 工 物 間 における 電 子 の 授 受 に 伴 う 反 応 であり 光 合 成 のシステムが 電 極 基 板 上 で 再 構 成 できたことを 示 している PS1の 代 わりに 光 増 感 剤 として 知 られ る 亜 鉛 ポルフィリン 化 合 物 (ZnTMPyPなど)を 使 用 した 超 薄 膜 の 形 成 も 可 能 であり 亜 鉛 ポルフィリン 化 合 物 を 使 用 し たデバイスでは 光 駆 動 型 の 水 素 発 生 や 電 流 の 発 生 が 可 能 であった ガラスカーボン 電 極 ITO 電 極 ビオロゲン 修 飾 したITO 電 極 表 面 上 に 形 成 されたヒドロゲナーゼ 単 分 子 膜 の 電 気 化 学 的 な 水 素 発 生 が 測 定 可 能 であった ビオロゲンによって 修 飾 されたITO 電 極 では ヒドロゲナーゼ- 電 極 間 の 電 子 伝 達 効 率 が 向 上 することが 確 認 された また H 2 aseをガラスカーボン 電 極 上 にクレイとポリビオロゲンから 成 る 複 合 キャスティング 膜 の 作 成 に 供 した 電 子 伝 達 効 率 は クレイのみの 膜 よりクレイとポリビオロゲンを 複 合 した 膜 によって 大 幅 に 向 上 した クレイ/ポリビオロゲ ン 膜 はガラスカーボン 電 極 表 面 で 高 い 安 定 性 を 示 した 我 々はクレイ/ポリビオロゲン 膜 の 水 素 センサーとしての 可 能 性 も 検 討 し 商 業 的 に 用 いられている 白 金 電 極 よりも 優 れた 性 質 を 有 していることを 明 らかにした 3-3. デバイスの 作 成 様 々なアプローチにより 当 該 デバイスの 開 発 を 試 みた PS1とPS2は ガラスまたは 電 極 表 面 (ITO 金 その 他 )に 単 層 構 造 もしくは 多 層 構 造 で 固 定 化 が 可 能 である 我 々は 人 工 的 な 糖 脂 質 分 子 にPS1 等 を 分 離 する 積 層 方 法 を 構 築 した この 積 層 方 法 により 8 層 に 光 合 成 系 を 電 極 表 面 上 に 積 層 した 修 飾 電 極 上 に 形 成 した8 層 のPS1/ 高 分 子 (ビ オロゲン) 複 合 体 LB 膜 のサイクリック-ボルタングラムを 測 定 し 顕 著 な 還 元 ピークを 計 測 した これはビオロゲンが 光 り 駆 動 型 水 素 発 生 反 応 における 電 子 伝 達 の 効 率 を 向 上 させたためと 考 えた PS1 メルカプト 酢 酸 メチルビオロゲンとヒドロゲナーゼから 成 る 溶 液 系 の 実 験 では 光 駆 動 型 水 素 の 発 生 が 観 察 された また 人 工 的 な 光 増 感 剤 であるポルフィリン EDTA メチルビオロゲンの 系 においても 光 駆 動 型 の 水 素 発 生 が 観 察 された 2 種 類 の 測 定 システムは PS1を 用 いた 光 駆 動 型 水 素 発 生 用 にバイオット 社 によって 共 同 開 発 され

5 た 本 測 定 装 置 によって 溶 液 中 のPS1 由 来 の 光 駆 動 型 水 素 発 生 反 応 を 水 素 電 極 によって 測 定 した 図 3. 水 素 発 生 用 デバイスの 実 験 概 念 図 バイオ 分 子 の 高 機 能 化 高 酸 素 耐 性 を 有 したヒドロゲナーゼを 発 現 させるために 我 々は 最 初 にChlamydomonasのFe-ヒドロゲナーゼを 発 現 系 の 探 索 をランダムミューテーション サイトスペシフィックなミューテーションによって 試 みた これらの 試 みは 非 常 に 困 難 であったが 我 々は 最 終 的 にClostridium acetobutylicumにおける 異 種 発 現 系 の 構 築 に 成 功 した C. acetobutylicumは 緑 藻 ( 特 にH-クラスター)と 類 似 のFe-ヒドロゲナーゼを 有 している 緑 藻 C. reinhardtiiのhyda 遺 伝 子 は 新 規 のベクターにクローンされC. acetobutylicumに 導 入 された C. acetobutylicum 内 で 発 現 した 藻 類 のヒドロ ゲナーゼは 単 離 され 高 い 比 活 性 を 有 していることが 確 認 された これは ランダムミューテーション サイトスペシフ ィックなミューテーションによって 酵 素 の 酸 素 耐 性 を 向 上 させる 決 定 的 な 手 法 である 同 時 に ヒドロゲナーゼの 新 規 発 現 系 の 構 築 を 紅 色 非 硫 黄 性 光 合 成 細 菌 (Rhodospirillaceae 科 )で 成 功 した 2つの 発 現 系 により 別 の 緑 藻 類 (Chlamydomonas moewusii)のヒドロゲナーゼについても 大 量 発 現 を 試 みている この 酵 素 は 多 くの 緑 藻 類 から 高 い 選 択 圧 によるスクリーニングによって 発 見 され 通 常 の 緑 藻 Fe-ヒドロゲナーゼよりも5 倍 以 上 高 い 活 性 を 有 している

6 4. 考 察 光 合 成 器 官 を 可 溶 化 する 技 術 的 課 題 を 解 決 し 全 てのバイオ 分 子 を 様 々な 人 工 物 上 に 固 定 化 する 技 術 (LB 法 水 平 垂 直 引 き 上 げ 法 標 識 方 法 など)を 開 発 した ヒドロゲナーゼの 活 性 は 溶 液 中 もしくは 電 極 基 板 上 の 単 分 子 膜 においても 維 持 された 電 極 基 板 上 に 固 定 化 した 光 合 成 器 官 の 活 性 は 測 定 することができなかった これは 分 子 をさらに 高 密 度 化 配 向 制 御 を 高 めることで 解 決 可 能 と 考 える また サイズの 大 きい 基 盤 の 作 成 技 術 高 感 度 な 検 出 システムの 開 発 人 工 的 な 電 子 供 与 体 電 子 受 容 体 の 設 計 合 成 技 術 の 開 発 により 光 合 成 活 性 を 利 用 できる 技 術 となる 当 該 プロジェクトで 得 られた 結 果 により 光 合 成 器 官 とヒドロゲナーゼのカップリングの 可 能 性 が 見 いださ れた 5. 結 論 水 素 発 生 用 バイオ 分 子 デバイスの 構 築 を 可 能 にする 要 素 技 術 の 開 発 に 成 功 した PS1とポルフィリンLB 膜 は 光 駆 動 型 水 素 生 産 に 適 した 材 料 であることが 示 された 水 素 発 生 のためのPS1とヒドロゲナーゼのカップリングが 可 能 であり PS2も 電 極 基 盤 上 に 単 分 子 膜 として 固 定 化 可 能 であった また 新 規 界 面 活 性 剤 等 の 開 発 により 全 てのバ イオ 分 子 の 活 性 維 持 時 間 が 時 間 単 位 から 日 または 週 単 位 に 延 長 することが 可 能 であった 緑 藻 類 からFe-ヒドロゲ ナーゼを 大 量 に 得 るための 新 規 発 現 系 の 構 築 が 可 能 であった また 異 種 ヒドロゲナーゼの 遺 伝 子 の 発 現 も 可 能 で あった 6. 今 後 の 展 望 当 該 プロジェクトを 通 して バイオ 分 子 のハンドリングを 容 易 にする 化 学 物 質 の 合 成 ハンドリング 技 術 の 向 上 によ り 目 的 のバイオ 分 子 を 人 為 的 に 組 織 化 する 技 術 が 開 発 された 本 技 術 は バイオ 分 子 と 人 工 物 をカップリング 技 術 であり 生 体 由 来 の 高 機 能 物 質 の 活 用 や 高 機 能 な 新 規 人 工 材 料 等 のカップリングより 各 種 デバイスを 構 築 するこ とが 可 能 であると 思 われる 7. 謝 辞 当 該 研 究 は ネド 国 際 共 同 研 究 グラントによってサポートされた 高 安 定 性 ヒドロゲナーゼは ロシア 科 学 アカデミ ーのNゾーリン 博 士 から 提 供 を 受 けた 8. 引 用 文 献 [1] BIOHYDROGEN II (Miyake, J., Matsunaga, T., Pietro, A. S., eds.), Elsevier, London, UK, (2002). [2] BIOHYDROGEN III (Miyake, J., Igarashi, Y., Roegner, M., eds.), Elsevier, London, UK, (2003).

7 本 研 究 テーマによる 代 表 的 な 発 表 論 文 特 許 等 のリスト 論 文 [1] BIOHYDROGEN II (Miyake, J., Matsunaga, T., Pietro, A. S., eds.), Elsevier, London, UK, (2002). [2] BIOHYDROGEN 2002 (Special issue of BioHydrogen2002 published by International Journal of Hydrogen Energy), Elsevier, London, UK, (2003). [3] BIOHYDROGEN III (Miyake, J., Igarashi, Y. Roegner, M, eds.), Special reviewed book of Expert meeting on Biohydrogen, Elsevier, London, UK, (2003). 口 頭 発 表 [1] J.Miyake et al., Molecular engineering approach for biohydrogen production, Expert Meeting on BioHydrogen- Scope and View for Future -, Kyoto, (2002). [2] J.Miyake et al., Organized ultrathin films of PSI and porphyrins for photoinduced hydrogen evolution, International NEDO-Meeting on Biohydrogen-Present status and outlook, Paris, (2003). [3] M.Roegner et al., Semiartificial device: The photosynthesis part, International NEDO-Meeting on Biohydrogen- Present status and outlook, Paris, (2003). [4] J.Miyake et al., Biohydrogen in the next-generation energy system, 6th International Marine Biotechnology Conference, 5th Asia pacific Marine Biotechnology Conference, Chiba, (2003).

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