ALS基金報告書

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1 研 究 課 題 SOD1 構 造 変 化 を 認 識 するモノクローナル 抗 体 に 基 づく 家 族 性 および 孤 発 性 ALS の 革 新 的 診 断 と 治 療 法 の 基 盤 開 発 変 異 型 SOD1 に 共 通 の 構 造 変 化 を 特 異 的 に 認 識 する 新 規 モノクローナル 抗 体 の 作 製 西 頭 英 起 宮 崎 大 学 医 学 部 機 能 生 化 学 分 野 2

2 抄 録 筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症 (Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS)は 運 動 神 経 が 特 異 的 に 障 害 される 極 めて 重 篤 な 神 経 変 性 疾 患 です ALS の 原 因 はいまだ に 不 明 ですが 約 1 割 の 患 者 は 遺 伝 子 異 常 で 発 症 し 特 に Cu, Zn superoxide dismutase (SOD1)という 酵 素 をコードする 遺 伝 子 の 様 々な 変 異 (100 種 類 以 上 )が 知 られています しかし 様 々な 変 異 型 SOD1 が ALS を 引 き 起 こ す 共 通 の 機 構 については 全 く 分 かっていませんでした 今 回 東 京 大 学 薬 学 部 細 胞 情 報 学 および 医 学 部 神 経 内 科 との 共 同 研 究 で ALS を 引 き 起 こす 変 異 型 SOD1 が 共 通 した 立 体 的 な 構 造 を 取 ることにより 神 経 毒 性 を 引 き 起 こすことを 世 界 で 初 めて 発 見 しました またこの 構 造 にのみ 反 応 する 抗 体 の 開 発 に 成 功 しました 本 研 究 成 果 は 2012 に Annals of Neurology 誌 に 公 表 するとともに 抗 体 の 国 際 特 許 を 申 請 中 です 今 回 作 成 した 抗 体 は 遺 伝 性 ALS の 新 しい 診 断 に 寄 与 すると 同 時 に 様 々なタ イプの SOD1 遺 伝 子 変 異 による ALS に 適 用 可 能 な 治 療 薬 の 開 発 に 繋 がる のではないかと 期 待 されます 3

3 はじめに ALS とは 筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症 (Amyotrophic Lateral Sclerosis:ALS)は 上 位 下 位 運 動 神 経 が 特 異 的 に 障 害 される 進 行 性 の 神 経 変 性 疾 患 である 1 発 症 する と 筋 萎 縮 および 筋 力 低 下 の 症 状 を 呈 し 呼 吸 筋 麻 痺 に 至 る 現 在 までに ALS 病 態 分 子 機 構 に 基 づく 根 本 的 な 治 療 法 はなく 人 工 呼 吸 器 の 装 着 を 施 さなければ 通 常 は 発 症 後 1 5 年 で 死 に 至 る 重 篤 な 疾 患 である ALS は 1974 年 に 厚 生 省 ( 当 時 )の 特 定 疾 患 に 指 定 されているが 2009 年 3 月 現 在 での 特 定 疾 患 医 療 受 給 者 数 は 8492 人 であり 毎 年 の 罹 患 者 は 約 2000 人 にのぼる 日 本 国 内 において 患 者 が 長 期 の 延 命 治 療 を 受 ける 例 が 増 加 したことや ALS は 主 に 壮 年 期 以 降 に 発 症 することから 高 齢 化 の 影 響 を 受 け 患 者 数 は 毎 年 増 え 続 けている( 難 病 医 学 研 究 財 団 難 病 情 報 センタ ーホームページ) 日 本 国 内 の 患 者 数 が 約 60 万 人 にのぼるアルツハイマー 病 や 約 15 万 人 のパーキンソン 病 と 比 較 すると ALS の 患 者 数 は 非 常 に 少 ない この ように 患 者 数 の 少 ない 難 病 の 治 療 薬 開 発 には 採 算 面 から 医 薬 品 メーカ ーは 消 極 的 にならざるを 得 ない 患 者 は リハビリテーションによる 筋 力 低 下 予 防 と グルタミン 酸 神 経 終 末 放 出 抑 制 剤 リルゾール( 商 品 名 : リルテック)による 一 時 的 な 進 行 遅 延 に 頼 るほかないのが 現 状 である リルゾールは ALS に 対 する2つの 臨 床 試 験 によって 延 命 効 果 があるこ とが 示 され 2,3 薬 剤 投 与 の 初 期 (6-15 ヶ 月 )および 疾 患 初 期 においては 効 果 を 示 すと 考 えられていたが 現 在 はその 治 療 効 果 について 疑 問 が 呈 され ている 4

4 ALS 発 症 の 原 因 遺 伝 子 ALS 全 体 の 約 90%を 孤 発 性 が 残 りの 約 10%を 遺 伝 による 家 族 性 が 占 める 4, 年 Cu Zn superoxide dismutase(sod1)の 遺 伝 子 変 異 が 家 族 性 ALS の 原 因 遺 伝 子 として 初 めて 報 告 された 6 その 後 現 在 までに ALS の 原 因 とされる 遺 伝 子 変 異 が 次 々と 報 告 されてきている 常 染 色 体 優 性 の 遺 伝 子 変 異 として SETX FUS/TLS VAPB TARDBP DCTN1 VCP ANG FIG4 DAO 7-14 が 常 染 色 体 劣 性 の 遺 伝 子 変 異 として ALS2 SPG11 が 報 告 されている 15,16 また 常 染 色 体 優 性 劣 性 の 両 形 式 に 関 して 報 告 がある 遺 伝 子 変 異 には SOD1 のほか 2010 年 に 報 告 された OPTN がある 17 SOD1 遺 伝 子 変 異 が ALS を 引 き 起 こす 機 構 SOD1 遺 伝 子 変 異 は 家 族 性 ALS 全 体 の 約 20% 孤 発 性 ALS の 約 3%を 占 め この 割 合 は 同 定 されている 原 因 遺 伝 子 の 中 で 最 大 である 18,19 デー タベース ALS ONLINE GENETICS DATABASE(ALSOD)には 100 種 類 以 上 もの SOD1 遺 伝 子 変 異 が 登 録 されており そのほとんどが 常 染 色 体 優 性 遺 伝 形 式 をとることが 報 告 されている 20 常 染 色 体 劣 性 遺 伝 形 式 をと るものには SOD1(D90A) 変 異 が 知 られている 単 独 症 例 に SOD1 遺 伝 子 変 異 が 認 められる 場 合 は 報 告 歴 のない 新 規 の 変 異 であるか もし くは 家 族 歴 の 聴 取 が 不 十 分 であるケースが 考 えられる ただし 家 族 歴 の 調 査 から 遺 伝 的 に 孤 発 性 ALS であることが 示 された 患 者 の1 人 に SOD1(H80R)の 新 生 突 然 変 異 が 認 められているように 26 孤 発 性 ALS 患 者 に SOD1 遺 伝 子 変 異 が 報 告 された 例 もある SOD1はホモダイマーを 形 成 し 各 サブユニットは Zn 2+ Cu 2+ イオン を1つずつ 配 位 している 27 活 性 中 心 の Cu 2+ イオンの 酸 化 還 元 を 通 して 5

5 スーパーオキサイド(O 2 )を 過 酸 化 水 素 へと 変 換 する Cu, Zn superoxide dismutase (SOD) 活 性 を 持 つ 抗 酸 化 酵 素 であることが 知 られている その ため SOD1 が 発 見 された 当 初 は SOD1 の 酵 素 活 性 の 変 化 が ALS の 発 症 原 因 と 考 えられていた しかし ALS に 関 連 する SOD1 遺 伝 子 変 異 の 中 には SOD 活 性 を 完 全 に 保 持 しているもの( 例 :A4V D90A G93A) 部 分 的 に 保 持 しているもの( 例 :H48Q D125H S134N) 完 全 に 失 ってい るもの( 例 :H46R G85R D124V)がそれぞれ 存 在 しており 28 さらに ヒト ALS 患 者 における ALS 症 状 と SOD 活 性 喪 失 との 間 には 相 関 性 がな いとの 報 告 もある 29 また SOD1 ノックアウトマウスが ALS の 病 態 を 示 さないこと 30 一 方 で 複 数 の 変 異 型 SOD1 トランスジェニックマウス が ALS 様 の 運 動 障 害 性 症 状 を 示 すこと 31 が 報 告 されている 以 上 のこ とから SOD1 遺 伝 子 変 異 による 家 族 性 ALS の 原 因 を SOD1 の 酵 素 活 性 低 下 など loss of function に 求 めることは 困 難 であり 変 異 型 SOD1 タン パク 質 が 新 規 に 獲 得 した 運 動 神 経 に 対 する 細 胞 毒 性 (gain of toxic function)が ALS の 原 因 であると 考 えられている 変 異 型 SOD1 の 細 胞 毒 性 が 運 動 神 経 細 胞 死 を 引 き 起 こす 機 構 として これまでに ROS による 酸 化 ストレス カスパーゼの 活 性 化 ユビキ チン プロテアソーム 系 によるタンパク 質 分 解 システムの 障 害 ミト 37, ,43 コンドリア 機 能 異 常 軸 索 輸 送 障 害 神 経 興 奮 毒 性 膜 間 タ イトジャンクションタンパク 質 の 喪 失 44,45 シナプス 小 胞 の 異 常 46 細 胞 骨 格 の 異 常 47 異 常 封 入 体 および 凝 集 体 の 形 成 48 そして 小 胞 体 ストレス 49 などが 報 告 されている 50 SOD1 遺 伝 子 変 異 による 小 胞 体 ストレスを 介 した ALS 誘 導 機 構 小 胞 体 は 新 規 に 合 成 されたポリペプチド 鎖 のフォールディングの 場 6

6 として 重 要 である 分 泌 タンパク 質 および 膜 タンパク 質 は リボソーム で 合 成 されたのち 小 胞 体 においてフォールディングを 受 け 正 しい 構 造 へと 折 りたたまれる 小 胞 体 には シャペロンやタンパク 質 ジスルフ ィドイソメラーゼ(PDI)などのフォールディングに 関 わる 酵 素 が 数 多 く 存 在 し これらの 助 けにより 分 泌 タンパク 質 膜 タンパク 質 は 効 率 的 に フォールディングを 受 ける しかしながら 中 にはフォールディングに 失 敗 するタンパク 質 ( 不 良 タンパク 質 )も 存 在 する この 場 合 は 小 胞 体 品 質 管 理 機 構 が 働 き 小 胞 体 シャペロンによってリフォールディングを 受 けるか もしくは 小 胞 体 関 連 分 解 (Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation:ERAD)によって 細 胞 質 側 へ 輸 送 され ユビキチン プロテ アソーム 系 で 分 解 される このように 小 胞 体 には 適 切 なフォールデ ィングを 受 け 正 しい 折 りたたみ 構 造 を 形 成 したタンパク 質 をそれ 以 降 の 分 泌 経 路 に 送 る 分 子 機 構 がある 一 方 不 良 タンパク 質 の 分 解 を 促 す 機 構 も 存 在 する これらの 機 構 のバランスに 変 化 が 生 じると 小 胞 体 内 に 不 良 タンパク 質 が 蓄 積 する これを 小 胞 体 ストレスと 呼 ぶ 具 体 的 には 1 環 境 から ストレスを 受 けフォールディングおよび 分 解 の 機 構 が 破 綻 した 場 合 2 小 胞 体 の 処 理 能 力 を 超 える 不 良 タンパク 質 が 小 胞 体 内 に 蓄 積 した 場 合 3 遺 伝 子 変 異 により 正 しくフォールディングされることが 不 可 能 なタン パク 質 が 合 成 された 場 合 などが 小 胞 体 ストレスの 原 因 として 挙 げられ る これに 対 し 細 胞 には 不 良 タンパク 質 の 蓄 積 を 防 ぐことで 小 胞 体 の 機 能 を 回 復 しようとする 応 答 機 構 が 備 わっており これを 小 胞 体 スト レス 応 答 (Unfolded Protein Response:UPR)と 呼 ぶ 51,52 近 年 小 胞 体 ストレスは 様 々な 神 経 変 性 疾 患 に 関 与 することが 示 唆 さ れており 53,54 ALS の 病 態 に 関 与 する 変 異 型 SOD1 が 小 胞 体 ストレスを 誘 7

7 導 するという 報 告 もある しかしながら ALS において 変 異 型 SOD1 が 小 胞 体 ストレスおよび 運 動 神 経 細 胞 死 を 誘 導 する 分 子 機 構 は 不 明 であ った 2008 年 我 々のグループは 3 種 類 の 変 異 型 SOD1(A4V G85R G93A) が 小 胞 体 膜 貫 通 型 タンパク 質 Derlin-1 の 細 胞 質 に 面 した C 末 端 12 アミノ 酸 (CT4)に 結 合 し ERAD(Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation: ERAD)を 阻 害 することにより 小 胞 体 ストレスを 介 して 運 動 神 経 細 胞 死 を 引 き 起 こすことを 明 らかにした 49 ERAD は 1BiP などの 小 胞 体 シャ ペロンによる 不 良 タンパク 質 の 認 識 2 不 良 タンパク 質 の 小 胞 体 内 腔 か ら 細 胞 質 への 逆 輸 送 3ユビキチン 化 およびそれに 続 く 不 良 タンパク 質 のプロテアソームへの 輸 送 4ユビキチン プロテアソーム 系 による 分 解 の 順 に 起 こる Derlin-1 は 小 胞 体 膜 において p97 と 複 合 体 を 形 成 し 基 質 の 逆 輸 送 に 重 要 な 役 割 を 果 たす 分 子 として 2004 年 に 同 定 された 58,59 その 後 小 胞 体 内 の 基 質 が 細 胞 質 に 逆 輸 送 される 過 程 を in vitro で 再 構 成 した 系 において 逆 輸 送 が Derlin-1 に 対 する 抗 体 で 阻 害 されたこと からも Derlin-1 と ERAD との 関 連 が 強 く 示 唆 されている 60 哺 乳 類 におけるホモログとしては Derlin-2 Derlin-3 が 知 られており これらの Derlin ファミリーは N 末 端 と C 末 端 がともに 細 胞 質 側 を 向 い た 小 胞 体 膜 に 局 在 する4 回 膜 貫 通 型 のタンパク 質 である 我 々の 報 告 において RNAi による 運 動 神 経 系 細 胞 NSC34 でのノックダウン 実 験 か ら Derlin-1 の 発 現 抑 制 そのものは 小 胞 体 ストレスを 誘 導 しないことが 明 らかにされた これについては Derlin-2 および Derlin-3 が 代 償 的 に 機 能 し ている 可 能 性 が 考 えられるが Derlin-2 と Derlin-3 は 変 異 型 SOD1 と 結 合 しないことが 示 されている(Nishitoh et al., 2008) また RNAi による Derlin-1 の 発 現 抑 制 は 変 異 型 SOD1 による 小 胞 体 ストレスを 抑 制 した 8

8 (Nishitoh et al., 2008) よって 変 異 型 SOD1 による 小 胞 体 ストレス 誘 導 は Derlin-1 の 機 能 喪 失 によるものではなく 変 異 型 SOD1 が Derlin-1 との 結 合 を 介 して Derlin-1 の 獲 得 性 機 能 異 常 を 導 き ERAD を 阻 害 するために 起 こるものであることが 明 らかとなった 抗 変 異 型 SOD1 抗 体 を 用 いた ALS 病 態 関 連 性 の 変 異 型 SOD1 の 解 析 初 めて 抗 変 異 型 SOD1 抗 体 を 利 用 した 変 異 型 SOD1 の 解 析 が 行 われた のは ALS 患 者 の 脊 髄 および 脳 の 組 織 染 色 および 組 織 ホモジネートの イムノブロットによるものであった 61 この 解 析 以 来 変 異 型 SOD1 を 特 異 的 に 認 識 する 抗 体 は 現 在 までに 報 告 のあるものだけで 15 種 類 以 上 存 在 する 抗 体 を 用 いて 示 された 内 容 は 多 岐 にわたっており 1 変 異 型 SOD1 が 野 生 型 SOD1 とは 異 なり モノマーを 形 成 することの 示 唆 変 異 型 SOD1 の 細 胞 内 局 在 3 変 異 型 SOD1 が 特 異 的 に 他 の 分 子 と 相 互 作 用 することの 示 唆 4 変 異 型 SOD1 が 野 生 型 SOD1 の 変 異 型 化 を 引 き 起 こすこと 63,66,67 5 抗 体 を 用 いた ALS 治 療 の 可 能 性 68 6SOD1 変 異 を 持 つ ALS 患 者 サンプルにおいて SOD1の β barrel 構 造 が 崩 れている 69 ことの 示 唆 7ALS 患 者 剖 検 とトランスジェニックマウスにおいては 変 異 型 SOD1の 凝 集 体 および 変 異 型 SOD1 の 運 動 神 経 とアストロサイ 61 ト 内 の 封 入 体 が 脊 髄 前 角 に 蓄 積 することの 示 唆 などがある このように 抗 変 異 型 SOD1 抗 体 は 数 多 くの 異 なる 分 子 機 構 および 現 象 の 解 明 に 利 用 することができ 有 用 性 と 汎 用 性 が 非 常 に 高 い 一 方 で これまでの 抗 体 を 用 いた 解 析 において 使 用 されている 変 異 型 SOD1 は A4V G37R G85R G93A といった 代 表 的 なものに 限 られており すべ ての 変 異 型 SOD1 について 共 通 の 分 子 機 構 を 証 明 した 報 告 は 存 在 しない また 病 態 分 子 メカニズムに 基 づいて 作 製 された 抗 体 もほとんどない 9

9 よって これらの 報 告 の 中 で 示 されているのは 一 部 の 変 異 型 SOD1 に 限 定 して 見 られる 現 象 であり ALS と 関 連 する 変 異 型 SOD1 すべてに 共 通 の 機 構 であるか 否 かは 不 明 である 本 研 究 の 目 的 3 種 類 の 変 異 型 SOD1(A4V G85R G93A)が Derlin-1(CT4)と 結 合 し ERAD を 阻 害 することにより 小 胞 体 ストレスを 介 して 運 動 神 経 細 胞 死 を 引 き 起 こすことを 明 らかにしたのは 前 述 のとおりである 49 その 後 の 研 究 において ALSOD に 登 録 されている 130 種 類 および 本 学 医 学 系 研 究 科 神 経 内 科 において 発 見 された2 種 類 をあわせた 132 種 類 の 変 異 型 SOD1 と Derlin-1(CT4)との 結 合 を 検 討 したところ 124 種 類 もの 変 異 型 SOD1 が Derlin-1 と 結 合 することが 判 明 した さらに Derlin1- と 結 合 しない V7E E21G E21K T54R L67R D96N D96V V148I の8 種 類 の 変 異 型 SOD1 は 小 胞 体 ストレスを 誘 導 せず 運 動 神 経 細 胞 死 も 引 き 起 こさないという 結 果 が 得 られている 70 このことから 変 異 型 SOD1 は Derlin-1 との 結 合 を 介 して ALS の 発 症 に 関 与 しているのではな いかと 推 測 されたが 100 種 類 以 上 の 変 異 型 SOD1 がどのような 機 構 で Derlin-1 と 結 合 するのかは 不 明 であった そこで Derlin-1 と 結 合 し 小 胞 体 ストレス 誘 導 性 の 運 動 神 経 細 胞 死 を 引 き 起 こす 変 異 型 SOD1 に 共 通 する 分 子 機 構 の 検 討 を 行 った SOD1 の 変 異 は SOD1 一 次 配 列 の 全 域 に 広 がっている よって Derlin-1 と 結 合 するすべての 変 異 型 SOD1 が アミノ 酸 変 異 の 入 った 部 位 に 新 た な 結 合 面 を 獲 得 するとは 考 えにくい このことから 野 生 型 SOD1 は DBR を 分 子 内 にもともと 保 持 しており アミノ 酸 変 異 によってこれが 露 出 す ることで Derlin-1 との 結 合 が 可 能 になるのではないかと 考 えた そこで 10

10 Derlin-1 と 結 合 する 2 種 類 の 変 異 型 SOD1(G85R G93A)の Derlin-1 結 合 領 域 (Derlin-1 binding region : DBR)を 検 討 したところ SOD1(5-18)の 14 アミノ 酸 が Derlin-1 との 結 合 に 必 要 十 分 であることが 明 らかにされた これより 野 生 型 SOD1 では 隠 されている DBR が アミノ 酸 変 異 に 伴 う 構 造 変 化 により 分 子 表 面 に 露 出 するのではないかと 考 えた この 仮 説 を 生 化 学 的 に 証 明 するため DBR を 露 出 した 変 異 型 SOD1 を 特 異 的 に 認 識 するモノクローナル 抗 体 を 作 製 し 変 異 型 SOD1 が Derlin-1 と 結 合 する 分 子 機 構 を 明 らかにすることで ALS を 引 き 起 こす 共 通 の 分 子 機 構 の 解 明 を 目 指 した 結 果 1. 抗 DBR 抗 体 MS785 は DBR を 露 出 した 変 異 型 SOD1 を 特 異 的 に 免 疫 沈 降 できる 序 論 に 記 載 したとおり 野 生 型 SOD1 では 隠 されている DBR(5-18aa) が アミノ 酸 変 異 に 伴 う 構 造 変 化 により 分 子 表 面 に 露 出 するのではない かと 考 えた Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 は DBR を 露 出 している という 構 造 変 化 仮 説 が 正 しければ DBR を 抗 原 として 免 疫 することによ り 細 胞 内 において DBR を 露 出 した 変 異 型 SOD1 を 特 異 的 に 認 識 するモ ノクローナル 抗 体 が 得 られると 考 えた そこで この 仮 説 を 証 明 するた め DBR を 抗 原 としてラットモノクローナル 抗 体 の 作 製 に 取 り 組 んだ SOD1 の DBR す な わ ち 5-18 aa ペ プ チ ド の NH2-VCVLKGDGPVQGII-COOH 配 列 内 には 疎 水 性 アミノ 酸 (V L I)が 多 く 水 溶 性 が 低 いため 凝 集 を 起 こしやすいと 予 想 された そこ 11

11 で aa を 削 った SOD1 の 6-16 aa ペプチドを 抗 原 に 選 択 した ま た 細 胞 内 における DBR 露 出 を 特 異 的 に 認 識 する 抗 体 を 得 るためには 細 胞 融 合 で 得 られたクローンを 免 疫 沈 降 によるスクリーニングで 絞 り 込 む 方 法 が 適 切 であると 判 断 した そこで ELISA による 一 次 スクリーニ ングの 後 に 陽 性 クローンの 培 養 上 清 を 回 収 し 各 培 養 上 清 について 変 異 型 SOD1 の 免 疫 沈 降 を 二 次 スクリーニングとして 行 うこととした T 細 胞 依 存 性 抗 原 である KLH とコンジュゲートした SOD1(6-16)ペプチ ド 抗 原 を 3 匹 のラットへ 後 肢 肉 球 より 免 疫 した 免 疫 の 14 日 後 にラッ トよりリンパ 節 を 摘 出 し ポリエチレングリコールを 用 いてマウス 由 来 ミエローマ SP2 との 細 胞 融 合 を 行 った 融 合 細 胞 (ハイブリドーマ)は ラット1 匹 につき4 枚 の 96 well プレートへ 播 種 した 細 胞 融 合 より 10 日 後 KLH コンジュゲート 化 SOD1(6-16) ペプチド およびネガティブ コントロールとしての KLH を 抗 原 とし ハイブリドーマ 培 養 上 清 を 用 い て ELISA スクリーニングを 行 った 各 well について 490 nm における 吸 光 度 を 測 定 し 以 下 の2つの 目 的 から 陽 性 well の 判 定 基 準 を 決 定 した 1ELISA 後 に 免 疫 沈 降 による 二 次 スクリーニングを 予 定 していたため 陽 性 well をすべて 24 well プレートへスケールアップして 培 養 し 上 清 を 回 収 する 必 要 があった また 免 疫 沈 降 スクリーニングをできるだけ 短 期 間 で 終 わらせ 後 のステップに 進 むためにも 2 週 間 以 内 に 二 次 スク リーニングを 終 える 必 要 があった 以 上 の2つの 作 業 を 行 うことが 可 能 なクローン 数 は 約 300 個 以 内 であると 判 断 し 抗 原 吸 着 プレートにおい て 490 nm での 吸 光 度 が 高 い 順 にクローンを 選 択 したところ 吸 光 度 が 0 66 以 上 の 値 を 示 す 287 個 のクローンが 得 られた 2 今 回 は ELISA のネガティブコントロール 用 に KLH 吸 着 プレートを 用 いたが これに 対 して 発 色 する well が 見 られた そこで 肉 眼 において 抗 原 吸 着 プレートでの 発 色 が KLH 吸 着 プレートでの 発 色 よりも 高 い と 見 分 けられる 吸 光 度 の 差 を 1 well ずつ 目 視 することによって 無 作 為 に 12

12 約 20 well 分 検 討 したところ 約 0.1 以 上 であった この 結 果 に 基 づき 490 nm における( 抗 原 吸 着 プレートでの 吸 光 度 )-(KLH プレートで の 吸 光 度 )の 値 が 0.1 未 満 になる well を 判 別 したところ 21 well 存 在 した 1で 選 択 された 287 個 のクローンから 21 個 のクローンを 除 くと 残 りが 266 個 となり 免 疫 沈 降 スクリーニングによる 更 なる 絞 り 込 みを 行 うのに 十 分 なクローン 数 が 残 ったことから この 判 定 基 準 を 適 用 した ELISA 陽 性 well の 判 定 基 準 1( 抗 原 に 対 する 吸 光 度 ) ( 抗 原 に 対 する 吸 光 度 )ー(KLH に 対 する 吸 光 度 ) 0.1 得 られた 陽 性 well は ラット 1 匹 目 由 来 の4 枚 の ELISA プレートより 24 個 2 匹 目 由 来 より 208 個 3 匹 目 由 来 より 34 個 であった ラット 1-3 匹 目 を 合 計 すると 全 1152 well より 前 述 のとおり 266 well の 陽 性 ク ローンが 得 られた 陽 性 ポリクローンについてはすべて 96 well プレートから 24 well プレ ートへスケールアップを 行 い その 培 養 上 清 を 用 いて 免 疫 沈 降 による 二 次 スクリーニングを 行 った HEK293A 細 胞 に FLAG-SOD1(G93A)を 過 剰 発 現 させ 細 胞 ライセートを 各 培 養 上 清 により 免 疫 沈 降 した この 結 果 FLAG-SOD1(G93A)を 免 疫 沈 降 する 陽 性 クローンとして#242 #406 #659 #785 #1175 の5 個 を 得 た 続 いて これらのクローンから 野 生 型 SOD1 を 免 疫 沈 降 するクローン を 除 外 するため 免 疫 沈 降 による 野 生 型 SOD1 と 変 異 型 SOD1 の 比 較 を 行 った HEK293A 細 胞 に FLAG-SOD1(WT)および FLAG-SOD1(G85R) を 過 剰 発 現 させ 細 胞 ライセートを 各 培 養 上 清 により 免 疫 沈 降 した そ の 結 果 FLAG-SOD1(G85R)を 認 識 し FLAG-SOD1(WT)を 認 識 しないク ローンとして #406 #659 #785 の3 個 を 得 た これらの 陽 性 ポリクロ 13

13 ーナル 抗 体 を mutant SOD1-specific antibody clone の 略 よ り MS406 MS659 MS785 と 名 付 けた 3つの 抗 体 はすべて 限 界 希 釈 に よりモノクローン 化 し 後 の 解 析 に 用 いた さらに 免 疫 沈 降 およびイムノブロットによる 検 出 を 行 い 抗 体 の 認 識 が DBR を 保 持 した 変 異 型 SOD1 の 立 体 構 造 に 特 異 的 なものであるか 否 かを 検 討 した その 結 果 MS785 は 免 疫 沈 降 において 変 異 型 SOD1 を 認 識 し 野 生 型 および DBR を 欠 損 した 変 異 型 SOD1(G85R(Δ1-20) G93A(Δ1-20))を 認 識 しないことが 判 明 した 一 方 市 販 の SOD1 ポリク ローナル 抗 体 である SOD100 および SOD1 モノクローナル 抗 体 である 8A1(エピトープ 未 同 定 )を 用 いて 免 疫 沈 降 を 行 うと 野 生 型 SOD1 と 変 異 型 SOD1 の 両 方 を 認 識 した 加 えて MS785 をイムノブロットに 用 い てタンパク 質 を 変 性 させた 状 態 で 検 出 すると 変 異 型 のみならず 野 生 型 SOD1 をも 認 識 することが 明 らかとなった 以 上 より 作 製 した MS785 は DBR を 露 出 した 変 異 型 SOD1 を 特 異 的 に 免 疫 沈 降 できる 抗 体 であると 言 える 2. 抗 DBR 抗 体 MS785 は Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 を 特 異 的 に 認 識 する SOD1(1-20)の 部 分 配 列 ペプチドを 発 現 させるベクターを 用 いて MS785 のエピトープを 同 定 したところ SOD1 の 8-14aa であることが 明 らかとなった 次 に Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 が DBR を 露 出 し ているかどうかを 検 討 するため MS785 を 用 いて 132 種 類 すべての 変 異 型 SOD1 の 免 疫 沈 降 実 験 を 行 った HEK293A 細 胞 に 野 生 型 および 変 異 型 SOD1 の 各 コンストラクトを 過 剰 発 現 させ 細 胞 ライセートを MS785 培 養 上 清 により 免 疫 沈 降 した その 結 果 エピトープ 領 域 である 8-14aa 14

14 に 変 異 を 持 つものを 除 く すべての Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 が 免 疫 沈 降 された これより Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 は MS785 のエピトープ 領 域 に 変 異 を 持 つものを 除 き すべて DBR の 露 出 という 共 通 の 構 造 変 化 を 起 こしていることが 明 らかとなった したがって MS785 は SOD1 遺 伝 子 変 異 に 起 因 する ALS の 診 断 ツールへと 応 用 できる 可 能 性 を 持 つこ とが 示 唆 された 3. 抗 SOD1(30-40) 抗 体 MS27 は DBR を 露 出 した 変 異 型 SOD1 を 特 異 的 に 免 疫 沈 降 できる MS785 は エピトープ 領 域 に 変 異 を 持 つ SOD1 の DBR 露 出 を 検 出 でき ないため DBR 露 出 が Derlin-1 と 結 合 可 能 な すべて の 変 異 型 SOD1 に 共 通 な 分 子 機 構 であることを 示 せないという 問 題 点 があった また これは MS785 を ALS 診 断 ツールへ 応 用 するにあたり エピトープ 領 域 に 変 異 を 持 つ SOD1 の DBR 露 出 を 検 出 できないという 問 題 になると 考 えら れた DBR が 露 出 するような 構 造 変 化 が 生 じると それに 接 する 領 域 も 野 生 型 SOD1 とは 異 なる 構 造 に 変 化 するのではないかと 予 想 した SOD1 は8 本 の β strand より 成 る β barrel 構 造 を 持 ち DBR は 3rd β strand に 対 応 す る 領 域 である SOD1(30-40)と 近 接 している そこで SOD1(30-40)に 対 す るラットモノクローナル 抗 体 を 作 製 しようと 考 えた SOD1(30-40)ペプチド 抗 原 を 2 匹 のラットへ 後 肢 肉 球 より 免 疫 した 免 疫 の 14 日 後 にラットよりリンパ 節 を 摘 出 し ポリエチレングリコール を 用 いてマウス 由 来 ミエローマ SP2 との 細 胞 融 合 を 行 った 融 合 細 胞 (ハ 15

15 イブリドーマ)は ラット1 匹 につき4 枚 の 96 well プレートへ 播 種 した 細 胞 融 合 より 10 日 後 KLH コンジュゲート 化 SOD1(30-40) ペプチドを 抗 原 とし ハイブリドーマ 培 養 上 清 を 用 いて ELISA スクリーニングを 行 った 各 well について 490 nm における 吸 光 度 を 測 定 し 以 下 の 目 的 か ら 陽 性 well の 判 定 基 準 を 決 定 した MS785 と 同 様 ELISA 後 に 免 疫 沈 降 による2 次 スクリーニングを 予 定 していたため 陽 性 well をすべて 24 well プレートへスケールアップして 培 養 し 上 清 を 回 収 する 必 要 があった また 免 疫 沈 降 スクリーニング をできるだけ 短 期 間 で 終 わらせ 後 のステップに 進 むためにも 2 週 間 以 内 に 二 次 スクリーニングを 終 える 必 要 があった 以 上 の2つの 作 業 を 行 うことが 可 能 なクローン 数 は 約 300 個 以 内 であると 判 断 し 抗 原 吸 着 プレートにおいて 490 nm の 吸 光 度 が 高 い 順 にクローンを 選 択 した 肉 眼 によって 発 色 が 確 認 できる well は 吸 光 度 が 0.2 以 上 の 値 を 示 していたこ とから この 値 を 陽 性 well の 下 限 に 設 定 したところ 65 個 のクローンが 得 られた ELISA 陽 性 well の 判 定 基 準 (KLH コンジュゲート 化 SOD1(30-40)ペプチドに 対 する 吸 光 度 ) 0.2 得 られた 陽 性 well は ラット 1 匹 目 由 来 の4 枚 の ELISA プレートより 59 個 2 匹 目 由 来 より 6 個 であった ラット1 2 匹 目 を 合 計 すると 全 768 well より 前 述 のとおり 65 well の 陽 性 クローンが 得 られた 陽 性 ポリクローンについてはすべて 96 well プレートから 24 well プレ ートへスケールアップを 行 い その 培 養 上 清 を 用 いて 免 疫 沈 降 による 二 次 スクリーニングを 行 った HEK293A 細 胞 に FLAG-SOD1(G93A)を 過 剰 発 現 させ 細 胞 ライセートを 各 培 養 上 清 により 免 疫 沈 降 した この 結 果 FLAG-SOD1(G93A)を 免 疫 沈 降 する 陽 性 クローンとして#25 #27 の 2 個 を 16

16 得 た 続 いて これらのクローンから 野 生 型 SOD1 を 免 疫 沈 降 するクローン を 除 外 するため 免 疫 沈 降 による 野 生 型 SOD1 と 変 異 型 SOD1 の 比 較 を 行 った HEK293A 細 胞 に FLAG-SOD1(WT)および FLAG-SOD1(A4V G85R G93A)を 過 剰 発 現 させ 細 胞 ライセートを 各 培 養 上 清 により 免 疫 沈 降 した その 結 果 #25 #27 はいずれも FLAG-SOD1(A4V G85R G93A)を 認 識 し FLAG-SOD1(WT)を 認 識 しないクローンであることが 判 明 した これらの 陽 性 ポリクローナル 抗 体 を mutant SOD1-specific antibody clone の 略 より MS25 MS27 と 名 付 けた 2つの 抗 体 はす べて 限 界 希 釈 によりモノクローン 化 し 以 降 の 解 析 には MS27 を 用 いた 次 に 免 疫 沈 降 およびイムノブロットによる 検 出 を 行 い 抗 体 の 認 識 が 抗 原 部 位 を 保 持 した 変 異 型 SOD1 の 立 体 構 造 に 特 異 的 なものであるか 否 かを 検 討 した その 結 果 MS27 は 免 疫 沈 降 において 変 異 型 SOD1 を 認 識 し 野 生 型 および DBR と 抗 原 部 位 を 欠 損 した 変 異 型 SOD1(G85R(Δ1-40) G93A(Δ1-40))を 認 識 しないことが 判 明 した 一 方 で 前 述 のとおり 市 販 の SOD1 ポリクローナル 抗 体 である SOD100 および SOD1 モノクローナル 抗 体 である 8A1(エピトープ 未 同 定 )を 用 いて 免 疫 沈 降 を 行 うと 野 生 型 SOD1 と 変 異 型 SOD1 の 両 方 を 認 識 した さらに MS27 をイムノブロットに 用 いてタンパク 質 を 変 性 させた 状 態 で 検 出 す ると 変 異 型 のみならず 野 生 型 SOD1 をも 認 識 することが 明 らかとなっ た 以 上 より MS27 は aa を 露 出 した 変 異 型 SOD1 の 構 造 を 特 異 的 に 免 疫 沈 降 できる 抗 体 であると 言 える 4. 抗 SOD1(30-40) 抗 体 MS27 は Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 17

17 を 特 異 的 に 認 識 する MS27 を 用 いて 代 表 的 な 変 異 型 SOD1 である(A4V G85R G93A)の 免 疫 沈 降 を 行 った 結 果 3つの 変 異 型 はすべて 免 疫 沈 降 され SOD1(30-40) が 露 出 していることが 示 唆 された また SOD1(30-40)の 部 分 配 列 ペプ チドを 発 現 させるベクターを 用 いて MS27 のエピトープを 同 定 したとこ ろ 32-38aa であることが 明 らかとなった 続 いて 他 の DBR を 露 出 した 変 異 型 SOD1 において SOD1(30-40)の 露 出 が 起 こっているのではないかと 考 え MS27 を 用 いて 132 種 類 すべての 変 異 型 SOD1 の 免 疫 沈 降 を 行 った HEK293A 細 胞 に 野 生 型 および 変 異 型 SOD1 の 各 コンストラクトを 過 剰 発 現 させ 細 胞 ライセートを MS27 培 養 上 清 により 免 疫 沈 降 した その 結 果 エピトープ 領 域 である 32-38aa および 近 傍 の 40aa に 変 異 の 入 ったものを 除 く Derlin-1 と 結 合 するすべ ての 変 異 型 SOD1 が 免 疫 沈 降 された すなわち エピトープ 領 域 および その 近 傍 の 変 異 を 除 き MS785 で 免 疫 沈 降 された 変 異 型 SOD1 が MS27 でも 同 様 に 免 疫 沈 降 された よって Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 は MS27 エピトープ 領 域 に 変 異 を 持 つものを 除 き すべて aa の 露 出 という 共 通 の 構 造 変 化 を 起 こしていることが 明 らかとなった 5.まとめ 以 上 のように エピトープの 異 なる2 種 類 の 抗 変 異 型 SOD1 抗 体 MS785 MS27 は 各 エピトープ 領 域 における 変 異 を 除 き 共 通 して Derlin-1 と 結 合 するすべての 変 異 型 SOD1 を 免 疫 沈 降 した これより Derlin-1 との 結 合 を 検 討 した 132 種 類 の 変 異 型 SOD1 のうち 124 種 類 の Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 に DBR の 露 出 および aa の 露 出 という 構 造 変 化 が 生 じていることが 明 らかとなった 18

18 考 察 1.DBR を 露 出 し Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 は SOD1(30-40) をも 露 出 している 全 変 異 型 SOD1 の 免 疫 沈 降 を 行 った 結 果 エピトープおよびその 近 傍 領 域 の 変 異 を 除 き MS785 で 認 識 された 変 異 型 SOD1 はすべて MS27 に よっても 認 識 された このことから エピトープの 異 なるこれら2つの 抗 体 による 認 識 には 相 関 性 があると 言 える すなわち DBR を 露 出 し Derlin-1 と 結 合 する 変 異 型 SOD1 は SOD1(30-40)も 露 出 していると 考 えられる よって このような 構 造 変 化 が ALS 病 態 に 関 連 する 変 異 型 SOD1 に 共 通 するものであることが 強 く 示 唆 された 2.MS785 および MS27 は SOD1 遺 伝 子 変 異 に 起 因 する ALS の 診 断 ツールおよび 治 療 薬 へ 応 用 できる 可 能 性 を 有 する MS785 を 用 いて 全 変 異 型 SOD1 の 免 疫 沈 降 を 行 った 際 には エピトー プである 8-14aa に 変 異 をもつ SOD1 の DBR 露 出 を 検 出 できなかった し かし それとは 異 なるエピトープ(32-38aa)を 持 つ MS27 を 用 いて 同 様 に 全 変 異 型 SOD1 の 免 疫 沈 降 を 行 った 結 果 MS785 のエピトープ 領 域 に 変 異 を 持 つ SOD1 も 免 疫 沈 降 された よって MS785 と MS27 の2 種 類 の 抗 変 異 型 SOD1 抗 体 を 用 いることで Derlin-1 と 結 合 するような 構 造 変 化 を 起 こしたすべての 変 異 型 SOD1 を 検 出 できると 考 えられる 以 上 よ り これらを SOD1 遺 伝 子 変 異 に 起 因 する ALS の 診 断 ツールおよび 治 療 薬 へ 応 用 できる 可 能 性 が 示 された 19

19 すでに 現 在 本 学 医 学 系 研 究 科 神 経 内 科 より 健 常 者 または SOD1 遺 伝 子 変 異 を 持 つヒト ALS 患 者 由 来 の B 細 胞 株 をご 供 与 頂 いており それ を MS785 で 免 疫 沈 降 することによって B 細 胞 中 の 内 在 性 SOD1 の DBR 露 出 を 検 討 し 終 えている その 結 果 健 常 者 由 来 の B 細 胞 においては 内 在 性 SOD1 が 全 く 免 疫 沈 降 されなかったのに 対 し SOD1 遺 伝 子 変 異 を 有 する ALS 患 者 由 来 の 14 種 類 すべての 細 胞 において 内 在 性 SOD1 が 免 疫 沈 降 された 70 よって MS785 を SOD1 遺 伝 子 変 異 が 原 因 となる ALS 診 断 ツールへ 応 用 できる 可 能 性 がある 今 後 MS27 を 用 いて 同 様 の 免 疫 沈 降 実 験 を 行 い B 細 胞 中 の 内 在 性 SOD1 が aa を 露 出 しているかど うかについても 検 討 する 予 定 である 抗 変 異 型 SOD1 抗 体 が SOD1 変 異 を 持 たない 孤 発 性 ALS 患 者 の 脊 髄 組 織 を 染 色 したとの 報 告 が 複 数 あることから 66,67 孤 発 性 ALS における 野 生 型 SOD1 の 変 異 型 化 も 示 唆 されている よって 今 回 作 製 した 抗 体 は SOD1 変 異 を 持 たない 孤 発 性 ALS の 診 断 ツールへも 応 用 できる 可 能 性 が あると 考 えられる 20

20 参 考 文 献 1. Cleveland DW, Rothstein JD. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nature reviews. Neuroscience 2001; 2: Bensimon G, Lacomblez L, Meininger V. A controlled trial of riluzole in amyotrophic lateral sclerosis. ALS/Riluzole Study Group. The New England journal of medicine 1994; 330: Miller RG, Bouchard JP, Duquette P et al. Clinical trials of riluzole in patients with ALS. ALS/Riluzole Study Group-II. Neurology 1996; 47: S86-90; discussion S Hand CK, Rouleau GA. Familial amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve 2002; 25: Pasinelli P, Brown RH. Molecular biology of amyotrophic lateral sclerosis: insights from genetics. Nat Rev Neurosci 2006; 7: Rosen DR, Siddique T, Patterson D et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 1993; 362: Chen YZ, Bennett CL, Huynh HM et al. DNA/RNA helicase gene mutations in a form of juvenile amyotrophic lateral sclerosis (ALS4). American journal of human genetics 2004; 74: Kwiatkowski TJ, Jr., Bosco DA, Leclerc AL et al. Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis. Science 2009; 323: Nishimura AL, Mitne-Neto M, Silva HC et al. A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. American journal of human genetics 2004; 75:

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