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1 参 考 資 料 1 諸 外 国 における 生 物 応 答 を 用 いた 排 水 試 験 の 導 入 状 況 生 物 応 答 を 用 いた 排 水 試 験 法 ( 検 討 案 ) 事 業 場 排 水 実 態 調 査 結 果 化 学 物 質 排 出 把 握 管 理 促 進 法 による 第 1 種 指 定 化 学 物 質 の 公 共 用 水 域 への 排 出 状 況 米 国 WET 試 験 における 排 水 改 善 手 法 生 物 応 答 を 利 用 した 水 環 境 管 理 手 法 に 関 する 検 討 会 委 員 名 簿

2 ( 参 考 1) 諸 外 国 における 生 物 応 答 を 用 いた 排 水 試 験 の 導 入 状 況 米 国 カナダ 韓 国 イギリス ドイツ 法 制 度 における 位 置 付 け 規 制 上 の 要 件 ( 排 出 許 可 制 度 ) 規 制 上 の 要 件 ( 排 出 許 可 制 度 ) 規 制 上 の 要 件 規 制 なし 規 制 上 の 要 件 導 入 の 目 的 発 生 源 抑 制 水 環 境 保 全 発 生 源 抑 制 水 環 境 保 全 発 生 源 抑 制 水 環 境 保 全 (+ 発 生 源 対 策 ) 発 生 源 抑 制 業 種 によって 技 術 (BAT)ベースの 排 水 基 準 を 設 定 試 験 生 物 藻 類 無 脊 椎 動 物 魚 類 藻 類 大 型 植 物 無 脊 椎 動 物 魚 類 無 脊 椎 動 物 藻 類 無 脊 椎 動 物 魚 類 藻 類 無 脊 椎 動 物 魚 類 試 験 手 法 淡 水 生 物 *1 [ 急 ],,h ミジンコ 急 性 毒 性 試 験 ニセネコゼミジンコ,ミジンコ,オオミジンコ [ 急 ],,h 魚 類 急 性 毒 性 試 験 ファットヘッドミノー,ニジマス,カワマス [ 慢 ]h 藻 類 生 長 阻 害 試 験 ムレミカヅキモ [ 慢 ]-d ミジンコ 毒 性 試 験 ( 生 残 繁 殖 ) ニセネコゼミジンコ [ 慢 ]d 魚 類 仔 魚 毒 性 試 験 ( 生 残 成 長 ) ファットヘッドミノー [ 慢 ]d 魚 類 胚 仔 魚 期 毒 性 試 験 ( 生 残 催 奇 形 性 ) ファットヘッドミノー 海 洋 生 物 *1 [ 急 ],,h アミ 科 急 性 毒 性 試 験 [ 急 ],,h 魚 類 急 性 毒 性 試 験 シープスヘッドミノー,トウゴロウイワシの 仲 間 [ 慢 ]-d ワツナギソウ 生 長 阻 害 試 験 [ 慢 ]d アミ 科 毒 性 試 験 ( 生 残 成 長 繁 殖 ) [ 慢 ]d 魚 類 仔 魚 毒 性 試 験 ( 生 残 成 長 ) シープスヘッドミノー,トウゴロウイワシの 仲 間 [ 慢 ]d 魚 類 胚 仔 魚 期 毒 性 試 験 ( 生 残 催 奇 形 性 ) シープスヘッドミノー [ 慢 ]1h0min ウニ 受 精 試 験 ( 精 子 1 時 間 暴 露 後 卵 子 を 追 加 し0 分 暴 露 ) 淡 水 生 物 * [ 急 ]オオミジンコ 急 性 毒 性 試 験 [ 急 ]ニジマス 急 性 毒 性 試 験 [ 慢 ]h 藻 類 生 長 阻 害 試 験 ムレミカヅキモ [ 慢 ]d ウキクサ 増 殖 試 験 [ 慢 ]-d ニセネコゼミジンコ 繁 殖 試 験 ( 腹 慢 性 毒 性 試 験 ) [ 慢 ]d 魚 類 胚 仔 魚 期 毒 性 試 験 ( 死 亡 成 長 ) ファットヘッドミノー [ 慢 ] 魚 類 初 期 生 活 段 階 試 験 ニジマス 1 胚 試 験 (d): 発 育 胚 仔 魚 試 験 ( 対 照 区 で 胚 が 半 数 以 上 ふ 化 してから d):ふ 化 異 常 仔 魚 の 発 育 変 形 胚 ~ 稚 魚 試 験 ( 対 照 区 生 残 魚 が 遊 泳 し 始 めてから 0d): 死 亡 成 長 遊 泳 遅 延 異 常 行 動 海 洋 生 物 * [ 慢 ]-d ワツナギソウ 生 長 阻 害 試 験 ( 米 国 と 同 様 ) [ 慢 ]min ウニ 綱 受 精 試 験 [ 慢 ]d 魚 類 仔 魚 試 験 ( 米 国 と 同 様 ) トウゴロウイワシ の 仲 間 淡 水 生 物 [ 急 ]h オオミジンコ 遊 泳 阻 害 試 験 淡 水 生 物 [ 急 ]h 藻 類 生 長 阻 害 試 験 ムレミカヅキモ [ 急 ]h オオミジンコ 遊 泳 阻 害 試 験 [ 急 ]h 魚 類 急 性 毒 性 試 験 ニジマス 海 洋 生 物 [ 急 ]h 藻 類 生 長 阻 害 試 験 スケレトネマ [ 急 ]h オイスター 胚 発 達 試 験 マガキ [ 急 ]h 魚 類 急 性 毒 性 試 験 イシビラメと 同 属 種 淡 水 生 物 ( 急 性 ( 一 部 慢 性 )) [ 慢 ]h 藻 類 生 長 阻 害 試 験 [ 急 ]h オオミジンコ 遊 泳 阻 害 試 験 [ 急 ]h 魚 類 胚 試 験 ゼブラフィッシュ 0min 発 光 バクテリア 試 験 変 異 原 性 試 験 試 験 対 象 水 事 業 場 排 水 放 流 先 の 公 共 用 水 事 業 場 排 水 放 流 先 の 公 共 用 水 ( 製 紙 業 金 属 鉱 業 ) 事 業 場 排 水 事 業 場 排 水 放 流 先 の 公 共 用 水 ( 影 響 が 出 てきた 場 合 のみ) 主 に 事 業 場 排 水 公 共 用 水 ( 河 川 ) 対 象 とする 事 業 場 汚 染 物 質 ( 有 害 物 質 アンモニア 塩 素 等 )を 排 出 している 事 業 場 詳 細 な 規 定 は 州 Regionによって 異 なる* 製 紙 業 (PPER 1 年 改 正 ) 金 属 鉱 業 (MMER) 平 均,00m / 日 以 上 排 出 している 事 業 場 (Wastewater Systems Effluent Regulations 01 年 改 訂 01 年 から 法 的 義 務 へ) 下 水 処 理 場 を 含 む 全 ての 事 業 場 ( 業 種 排 水 量 別 に 段 階 的 に 導 入 ) 下 水 処 理 場 一 部 の 業 種 の 工 場 [ 急 ]: 急 性 毒 性 試 験 [ 慢 ]: 慢 性 毒 性 試 験 *1: 事 業 場 排 水 を 試 験 対 象 とする 場 合 排 水 の 塩 分 濃 度 にかかわらず 放 流 先 の 公 共 用 水 の 塩 分 濃 度 が1,000mg/L 未 満 の 場 合 は 淡 水 生 物 を 用 いて 試 験 を 実 施 する 放 流 先 の 公 共 用 水 の 塩 分 濃 度 が1,000mg/L 以 上 の 場 合 は 排 水 が 塩 分 を 含 有 するときは 海 洋 生 物 を 用 いて 試 験 を 実 施 し 排 水 が 塩 分 を 含 有 しないときは 排 水 の 塩 分 濃 度 を 放 流 先 の 塩 分 濃 度 に 調 整 して 海 洋 生 物 で 試 験 を 実 施 若 しくは 州 の 水 質 基 準 で 海 洋 生 物 の 利 用 が 規 定 されていないときは 淡 水 生 物 で 試 験 を 実 施 する 州 ごとにどの 試 験 を 何 種 類 用 いるか 規 定 されている 例 :バージニア 州 では 無 脊 椎 動 物 と 魚 類 の 種 ウィスコンシン 州 では 淡 水 生 物 について 急 性 試 験 を 種 慢 性 試 験 を 種 *: 例 :バージニア 州 下 水 処 理 場 0 箇 所 ( 排 水 量 0 万 ガロン/ 日 以 上 ) 一 般 事 業 場 箇 所 *: 放 流 先 の 公 共 用 水 が 淡 水 の 場 合 は 淡 水 生 物 海 水 の 場 合 は 海 洋 生 物 を 用 いて 試 験 を 実 施 する 参 -1-1

3 ( 参 考 ) 生 物 応 答 を 用 いた 排 水 試 験 法 ( 検 討 案 ) 生 物 応 答 を 用 いた 排 水 試 験 法 ( 検 討 案 ) 平 成 年 月 排 水 ( 環 境 水 ) 管 理 のバイオアッセイ 技 術 検 討 分 科 会 参 -- 表 紙

4 目 次 第 1 部 はじめに... 1 第 部 排 水 の 採 取 採 取 計 画 対 象 とする 排 水 採 取 計 画 の 立 案 において 参 考 となる 事 項 その 他 の 参 考 情 報.... 排 水 の 採 取 と 取 り 扱 い....1 適 用 範 囲.... 排 水 の 採 取.... 試 料 の 輸 送 方 法.... 試 験 機 関 における 試 料 の 取 り 扱 い... 第 部 試 験 の 実 施 試 験 計 画 の 立 案 試 験 計 画 立 案 の 流 れ 実 施 する 試 験 ( 試 験 生 物 )の 選 定 試 験 濃 度 の 設 定 スケジュールの 策 定 留 意 事 項.... 胚 仔 魚 期 の 魚 類 を 用 いる 短 期 毒 性 試 験 法....1 試 験 の 概 要.... 試 験 生 物.... 試 験 用 水.... 試 験 容 器 装 置 および 器 具.... 試 験 方 法 および 条 件.... 結 果 の 算 出 方 法 参 考 文 献... 1.ニセネコゼミジンコを 用 いるミジンコ 繁 殖 試 験 法 試 験 の 概 要 試 験 生 物 試 験 用 水 試 験 容 器 装 置 および 器 具 試 験 方 法 および 条 件.... 結 果 の 算 出 方 法.... 参 考 文 献.... 淡 水 藻 類 を 用 いる 生 長 阻 害 試 験 法....1 試 験 の 概 要.... 試 験 生 物... 参 --i

5 培 養 方 法.... 試 験 容 器 装 置 および 器 具.... 試 験 方 法 および 条 件.... 結 果 の 算 出 方 法.... 参 考 文 献... 第 部 試 験 結 果 のとりまとめ 統 計 解 析 - 無 影 響 濃 度 (NOEC)の 算 出 定 義 解 析 手 順 の 概 要 各 試 験 法 における 解 析 手 順 ECx/ICx の 算 出 参 考 文 献.... 試 験 結 果 のとりまとめ....1 基 本 的 な 事 項.... 補 足 的 な 事 項... 第 部 試 験 結 果 の 信 頼 性 評 価 基 本 的 な 事 項.... 試 験 結 果 の 信 頼 性 にかかわる 事 項.... 試 験 成 立 要 件.... 標 準 物 質 を 用 いた 感 受 性 試 験... 注 1 初 版 :01 年 月 1 日 注 第 二 版 :01 年 月 1 日 注 第 三 版 :01 年 月 0 日 注 1: 生 物 応 答 手 法 を 用 いた 排 水 試 験 に 関 する 技 術 セミナー(01 年 月 1 日 開 催 )にて 配 付 (セミナー 後 再 推 敲 し 誤 字 脱 字 等 を 修 正 ) 注 : 生 物 応 答 手 法 を 用 いた 排 水 試 験 に 関 する 技 術 セミナー( 平 成 年 度 )(01 年 月 1 日 開 催 )にて 配 付 注 : 排 水 管 理 等 に 用 いる 生 物 応 答 手 法 に 関 する 技 術 セミナー( 平 成 年 度 )(01 年 月 0 日 開 催 )にて 配 付 参 --ii

6 第 1 部 はじめに 本 試 験 法 ( 検 討 案 )は 事 業 場 排 水 の 水 生 生 物 への 総 体 的 な 影 響 の 程 度 を 魚 類 甲 殻 類 藻 類 の 種 の 生 物 を 用 いて 把 握 することを 目 的 とするものである 本 書 では 排 水 の 採 取 か ら 試 験 の 実 施 まで 利 用 者 が 使 いやすいよう できるだけ 具 体 的 に 記 載 し 各 項 目 で 独 立 し て 利 用 できる 構 成 としている なお 本 検 討 案 の 内 容 は 試 行 試 験 を 実 施 する 中 で 明 らかと なった 課 題 や 科 学 技 術 の 進 歩 などを 踏 まえて 適 宜 改 訂 する 第 部 排 水 の 採 取 1. 採 取 計 画 1.1 対 象 とする 排 水 事 業 場 から 排 出 される 代 表 的 な 排 水 を 採 取 することを 基 本 とする しかし 化 学 物 質 の 使 用 工 程 を 考 慮 して 工 程 内 の 排 水 などを 採 取 することも 有 効 である 1. 採 取 計 画 の 立 案 において 参 考 となる 事 項 採 取 計 画 の 立 案 にあたっては 以 下 の 点 を 参 考 に 効 率 的 かつ 有 効 的 に 行 うことが 望 まし い なお 以 下 の 事 項 は 参 考 情 報 であり 強 要 するものではない 1 排 水 の 質 ( 有 害 性 変 動 性 など) ( 具 体 的 な 考 慮 事 項 ) 水 生 生 物 への 影 響 が 懸 念 される 化 学 物 質 が 排 水 中 に 含 まれる 可 能 性 がある 場 合 当 該 化 学 物 質 についての 情 報 (SDS シート 使 用 実 績 物 理 化 学 性 状 など)を 収 集 する 排 水 の 質 についてその 変 動 や 傾 向 を 示 す 情 報 がない 場 合 は 排 水 の 質 の 変 動 要 因 を 考 慮 の 上 経 時 的 な 採 取 の 可 否 を 検 討 する 排 水 の 質 の 変 動 に 応 じて 採 取 方 法 (グラブ(スポット) 採 水 あるいはコンポジット 採 水. 項 参 照 )を 選 択 する 特 にグラブ 採 水 の 場 合 はそのタイミング コンポジッ ト 採 水 の 場 合 は 時 間 と 回 数 を 考 慮 する 採 取 方 法 採 取 地 点 の 状 況 に 適 切 な 採 水 器 具 装 置 を 用 いる 排 出 の 特 徴 ( 連 続 放 流 間 欠 放 流 など) ( 具 体 的 な 考 慮 事 項 ) 事 業 場 の 操 業 計 画 操 業 日 誌 などを 参 考 にして 平 常 操 業 時 でありかつ 排 水 量 が 大 き く 変 動 していない 時 に 採 取 を 行 う バッチ 式 処 理 や 間 欠 放 流 を 行 っている 事 業 場 排 水 については 排 水 中 の 有 害 な 物 質 の 挙 動 に 配 慮 した 採 取 方 法 を 検 討 する 連 続 放 流 排 水 の 場 合 でも 日 間 変 動 月 間 変 動 がある 場 合 は 排 水 の 発 生 源 ( 製 造 品 目 製 造 量 の 変 動 など)を 考 慮 し 排 水 処 理 工 程 での 処 理 時 間 を 加 味 した 上 で 最 も 負 荷 が 高 いと 予 想 される 時 期 時 間 に 採 取 を 行 うことが 望 ましい 採 取 時 に 通 常 排 水 中 に 含 まれないと 考 えられる 不 純 物 ( 浮 遊 物 やゴミなど)は 除 外 してもよい 参 --1

7 排 水 口 の 特 徴 ( 排 水 口 の 位 置 構 造 数 排 水 の 種 類 など) ( 具 体 的 な 考 慮 事 項 ) 複 数 の 排 水 口 が 存 在 する 場 合 や 排 水 の 種 類 などを 考 慮 して 排 水 の 採 取 地 点 を 決 定 す ることが 望 ましい( 詳 細 は.(1)を 参 照 ) その 他 採 取 計 画 は 採 水 側 の 事 情 だけではなく 試 験 を 迅 速 かつ 確 実 に 行 えるように 考 慮 し て 立 案 されることが 望 ましい 1. その 他 の 参 考 情 報 排 水 採 取 を 行 う 者 は 秘 密 保 持 の 範 囲 内 で 事 前 に 排 水 の 情 報 を 収 集 しておくことが 望 まし い 具 体 的 に 下 記 の 事 項 などが 挙 げられる 1 事 業 場 で 扱 っている 化 学 物 質 ( 物 質 名 量 使 用 時 の 形 態 使 用 場 所 該 当 する 法 制 度 ( 化 学 物 質 排 出 把 握 管 理 促 進 法 化 学 物 質 審 査 規 制 法 ほか)) 排 水 に 含 まれるまたは 含 まれる 可 能 性 のある 化 学 物 質 ( 基 準 項 目 などを 基 本 に 可 能 で あれば 含 有 化 学 物 質 予 想 される 変 化 物 など) 排 水 の 状 況 ( 基 本 的 な 水 質 測 定 項 目 BODなどの 変 動 有 無 処 理 排 水 量 の 変 動 幅 排 水 処 理 方 法 排 水 口 の 位 置 と 周 囲 の 状 況 排 水 の 系 統 図 ) 用 水 の 水 源 および 水 質 排 出 先 の 公 共 用 水 域 の 状 況 ( 可 能 であれば 水 位 流 量 など また 川 右 岸 橋 下 流 00 mなど 具 体 的 に 記 載 ) 法 制 度 への 対 応 ( 水 質 汚 濁 防 止 法 上 の 特 定 施 設 地 方 条 例 自 主 的 な 排 水 監 視 項 目 など) その 他 ( 操 業 日 誌 採 水 時 間 事 業 場 側 の 担 当 者 採 取 後 の 取 り 扱 いなど 後 日 採 水 時 の 問 題 点 などの 確 認 を 可 能 とする 情 報 ) なお 第 三 者 機 関 が 採 取 計 画 を 立 案 し 実 施 する 場 合 は 事 業 者 に 情 報 の 開 示 を 求 めるこ とが 望 ましいが 困 難 な 場 合 においては 公 的 機 関 において 公 表 されている 情 報 などの 収 集 に 努 める. 排 水 の 採 取 と 取 り 扱 い.1 適 用 範 囲 本 検 討 案 は 生 物 応 答 手 法 (バイオアッセイ)を 用 いて 排 水 の 生 物 影 響 を 評 価 する 場 合 の 排 水 の 採 取 に 適 用 される なお 事 業 場 などから 排 出 される 排 水 について バイオアッセイを 実 施 するために 必 要 な 排 水 の 採 取 保 存 および 輸 送 などの 方 法 並 びに 留 意 事 項 については 本 検 討 案 に 示 されてい るが 必 要 に 応 じて 日 本 工 業 規 格 ( 以 下 JIS という )K 00( 工 業 用 水 工 場 排 水 の 試 料 採 取 方 法 ) JIS K 0--1~( 水 質 -サンプリング- 第 1 部 ~ 第 部 )も 参 照 することが 推 奨 される 参 --

8 排 水 の 採 取 (1) 採 取 地 点 原 則 として 排 水 を 公 共 用 水 域 に 排 出 する 最 終 排 水 口 を 採 取 地 点 とする( 水 質 汚 濁 防 止 法 により 届 出 されている 排 水 口 ) ただし 以 下 に 示 す 事 例 を 参 考 に 適 切 な 場 所 ( 位 置 )を 採 取 地 点 とすることが 望 ましい 1) 最 終 排 水 口 の 位 置 構 造 などの 物 理 的 要 因 により 採 取 が 困 難 な 場 合 事 業 場 の 排 水 の 最 終 処 理 施 設 と 最 終 排 水 口 間 で 採 取 が 可 能 または 適 した 地 点 を 選 択 する 採 取 地 点 の 決 定 に 際 しては 当 該 事 業 場 以 外 の 排 水 の 影 響 が 全 くないか 極 めて 小 さく かつ 当 該 事 業 場 の 特 性 を 最 もよく 示 していると 考 えられる 排 水 ( 場 所 種 類 )で あることを 考 慮 する ) 同 一 事 業 場 内 に 複 数 の 最 終 排 水 口 が 存 在 する 場 合 事 業 場 内 のすべての 排 水 口 で 採 取 し 排 水 量 比 に 合 わせて 混 合 したものを 代 表 排 水 と する または 排 水 の 種 類 量 などを 考 慮 し 明 らかに 当 該 事 業 場 を 代 表 すると 考 えられ る 排 水 が 存 在 する 場 合 その 特 定 の 排 水 口 を 採 取 地 点 とする 採 取 地 点 の 決 定 に 際 して は 当 該 事 業 場 と 相 談 の 上 で 適 切 に 判 断 することが 望 ましい ) 最 終 放 流 水 に 海 水 などが 含 まれている 場 合 本 検 討 案 では 淡 水 生 物 種 を 用 いていることから 採 取 した 排 水 に 海 水 が 含 まれると 生 物 試 験 が 成 立 しない よって 最 終 排 水 口 で 海 水 の 混 入 が 考 えられる 場 合 は 海 水 の 影 響 を 受 けない 範 囲 で 最 終 排 水 口 に 近 い 場 所 ( 位 置 )を 採 取 地 点 とする )その 他 事 業 場 の 状 況 に 応 じ 排 水 の 生 物 影 響 を 評 価 する 上 で 最 も 妥 当 であると 判 断 される 地 点 を 専 門 家 と 相 談 の 上 決 定 しても 構 わない 例 えば 最 終 排 水 口 より 前 の 排 水 経 路 にお いて 事 業 場 固 有 ではない 排 水 ( 雨 水 生 活 排 水 など)や 化 学 物 質 の 影 響 が 考 えられな い 排 水 ( 冷 却 水 など)が 混 合 されている 場 合 や 塩 素 処 理 による 影 響 が 懸 念 される 場 合 それらが 混 合 する 前 に 採 取 することもありうる () 採 取 方 法 と 採 取 時 間 1) 採 取 方 法 排 水 の 採 取 方 法 は グラブ(スポット) 採 水 とコンポジット 採 水 に 類 別 される バイオ アッセイに 供 する 排 水 は 事 業 場 の 稼 働 状 況 などを 考 慮 して 最 も 適 切 な 条 件 で 採 水 を 行 う ことが 望 ましい 排 水 の 変 動 性 などを 考 慮 しなければならない 場 合 にはコンポジット 採 水 が 推 奨 される しかし 採 水 担 当 者 の 負 担 などを 考 慮 して 事 業 場 の 定 常 操 業 時 に 1 日 1 ~ 数 回 のグラブ 採 水 を 行 い それぞれ 試 験 に 供 することも 可 能 である 1グラブ(スポット) 採 水 : 特 定 の 時 間 に 1 回 だけ 採 取 する 方 法 グラブ(スポット) 採 水 には 採 取 にかかるコストが 少 ないなどの 利 点 がある 反 面 特 定 の 時 間 に 1 回 だ け 採 取 した 排 水 であるため 必 ずしも 事 業 場 排 水 の 平 均 的 または 代 表 的 な 排 水 ではな 参 --

9 い 可 能 性 もある コンポジット 採 水 : 持 続 的 または 間 欠 的 に 採 取 した 排 水 を 混 合 する 方 法 コンポジッ ト 採 水 は グラブ(スポット) 採 水 に 比 べて 事 業 場 排 水 の 平 均 的 または 代 表 的 な 水 質 を 得 ることが 可 能 ではあるが 時 間 とコストがかかる 考 慮 事 項 平 均 的 な 操 業 時 でも 排 水 の 質 が 日 内 または 日 間 で 大 きく 変 動 することが 分 かってい る 時 間 帯 たとえば 機 器 の 稼 働 時 や 点 検 時 に 定 常 時 と 異 なる 排 水 が 排 出 される 場 合 などに 注 意 する 必 要 がある 間 欠 排 水 を 行 っている 場 合 たとえば 排 水 を 一 時 的 に 貯 留 して 一 定 時 間 後 に 排 出 す る 場 合 などに 注 意 する 必 要 がある 使 用 する 原 材 料 あるいは 製 造 する 製 品 の 変 更 などによって 排 水 の 質 が 大 きく 変 化 する ことが 判 明 した 場 合 には 改 めて 採 取 を 行 うことが 望 ましい ) 採 取 時 間 排 水 の 質 が 日 内 または 日 間 で 変 動 することが 分 かっている 場 合 採 取 を 行 う 日 時 を 決 定 するための 目 安 ( 判 断 基 準 )を 定 めておくことが 望 ましい たとえば 継 時 的 にモニタリ ングされた COD( 化 学 的 酸 素 要 求 量 )を 指 標 として 最 も CODが 高 い 時 に 採 取 を 行 うこ とが 考 えられる 排 水 の CODと 生 物 影 響 とは 必 ずしも 相 関 しないが 事 業 場 の 活 動 ( 操 業 ) に 伴 う 排 出 負 荷 が 最 も 高 い 状 態 と 想 定 され より 安 全 側 に 立 つ 採 取 ができると 考 えられる なお 排 水 の 評 価 結 果 の 信 頼 性 を 担 保 する 上 で 同 一 排 水 を 複 数 の 試 験 機 関 でバイオア ッセイ(または 化 学 分 析 など)に 供 し 結 果 のばらつきなどを 把 握 することは 重 要 であり 質 の 変 化 が 想 定 される 排 水 では それらも 考 慮 して 採 取 方 法 などを 計 画 することも 有 効 な 手 段 である 排 水 の 種 類 や 特 徴 によって 推 奨 される 採 取 方 法 が 異 なる 場 合 もあるため JIS K 0--( 水 質 -サンプリング- 第 部 )を 参 照 し あらかじめ 適 切 な 採 取 方 法 を 選 択 して おくことが 推 奨 される () 採 取 に 使 用 する 器 具 および 装 置 採 取 に 使 用 する 器 具 や 装 置 などは 採 取 地 点 の 状 況 ( 高 さや 足 場 など) 排 水 の 質 ( 含 有 することが 想 定 される 化 学 物 質 など) 採 水 方 法 (グラブ(スポット) 採 水 またはコンポジ ット 採 水 )に 応 じて 適 切 なものを 選 択 する たとえば グラブ(スポット) 採 水 の 場 合 には バケツや 柄 付 きひしゃく 採 水 器 などを 使 用 する 一 方 コンポジット 採 水 の 場 合 には 排 水 を 連 続 的 または 間 欠 的 に 自 動 採 取 できる 装 置 を 使 用 することが 望 ましい いず れの 場 合 においても 採 取 には 排 水 の 汚 染 (コンタミネーション)を 招 かないように 適 切 に 洗 浄 された 清 浄 な 器 具 や 装 置 を 使 用 する なお 排 水 の 採 取 に 使 用 できる 器 具 および 装 置 などの 種 類 特 徴 および 使 用 方 法 などに 関 しては 別 途 JIS K 00および K 0-- を 参 照 することが 推 奨 される () 試 料 容 器 および 採 取 量 採 取 した 排 水 ( 以 下 試 料 )を 入 れる 容 器 ( 試 料 容 器 )には できるだけ 不 活 性 かつ 破 損 しにくい 材 質 のものを 用 いる 排 水 の 質 ( 容 器 への 吸 着 )や 採 取 時 の 状 況 など( 採 取 量 参 --

10 など)に 応 じて 選 択 する たとえば 密 栓 できる ~ L 容 の 褐 色 ガラス 製 容 器 や 液 体 用 の 折 りたたみ 式 ポリタンクが 挙 げられる 輸 送 時 はできるだけ 遮 光 する 排 水 の 必 要 採 取 量 は 生 物 1 試 験 分 として L 程 度 必 要 とするが 実 施 を 予 定 しているバイオアッセイの 種 類 と 量 化 学 分 析 実 施 の 有 無 保 存 試 料 の 必 要 性 などに 応 じて 採 水 量 を 調 整 する なお バイオアッセイとは 別 に 化 学 分 析 などを 行 う 場 合 には 別 途 試 料 容 器 を 用 意 し 輸 送 中 の 損 失 を 最 小 限 にするための 工 夫 をすることが 望 ましい () 試 料 採 取 時 の 記 録 試 料 採 取 時 には 以 下 の 内 容 を 記 録 する 1) 試 料 の 名 称 (またはその 識 別 記 号 ) 明 瞭 かつ 容 易 に 消 えない 方 法 で 記 載 またはラ ベルを 添 付 する ) 採 取 日 時 ( 作 業 の 開 始 時 刻 と 終 了 時 刻 ) ) 採 取 地 点 ( 可 能 であれば 採 取 地 点 を 示 した 排 水 経 路 図 ) ) 試 料 の 性 状 ( 水 温 色 調 浮 遊 物 臭 気 および phなど) ) 採 取 担 当 者 立 会 者 の 氏 名 ) 採 取 方 法 ) 採 取 試 料 量 ) 採 取 時 の 状 況 ( 天 候 気 温 など) ) その 他 試 験 結 果 に 影 響 を 与 えると 考 えられる 事 象 また 採 取 を 行 った 排 水 口 での 一 日 あたりの 排 水 量 年 間 排 水 量 事 業 場 の 操 業 日 誌 排 水 について 過 去 ( 採 取 時 の 直 近 )に 測 定 された COD(または BOD) ph SSなどのデー タ( 事 業 場 が 保 有 する 記 録 の 写 し) 排 水 の 放 流 先 の 状 況 ( 放 流 先 が 河 川 の 場 合 にはその 水 量 や 河 床 の 状 況 )などを 採 取 時 の 記 録 に 添 付 しておくことが 望 ましい. 試 料 の 輸 送 方 法 バイオアッセイは 採 取 終 了 時 から 時 間 以 内 にばく 露 を 開 始 することが 望 ましい その ため 試 料 は 速 やかに 以 下 の 処 理 を 行 い 保 冷 しながら 輸 送 する 宅 配 便 で 輸 送 する 場 合 に は 冷 蔵 指 定 (0~ )にする 試 料 輸 送 中 の 揮 発 性 物 質 の 損 失 を 最 小 にするため できる 限 り 気 相 部 分 がない 状 態 で 容 器 を 密 栓 ( 密 封 )する 試 料 を 容 器 に 封 入 後 できるだけ 速 やかに 粗 熱 を 取 り( 可 能 であれは 氷 水 中 で 水 温 を 付 近 まで 低 下 させる) 輸 送 用 の 容 器 に 収 容 する( 試 料 容 器 がガラス 製 容 器 の 場 合 は 輸 送 中 の 破 損 を 防 ぐために 各 容 器 の 間 に 緩 衝 材 ( 発 泡 スチロールなど)を 入 れ る) なお このとき 内 容 証 明 も 同 封 しておく. 試 験 機 関 における 試 料 の 取 扱 い (1) 試 料 の 受 け 入 れ 試 験 施 設 は 輸 送 で 受 け 入 れた 試 料 について 同 封 の 内 容 証 明 と 照 合 して 同 一 性 を 確 認 する また 搬 入 日 時 搬 入 ( 輸 送 ) 方 法 搬 入 時 の 状 態 ( 試 料 の 漏 えい 容 器 破 損 の 有 無 など) 水 温 および 受 け 入 れ 担 当 者 の 氏 名 などを 記 録 する 参 --

11 () 試 料 の 前 処 理 排 水 の 生 物 影 響 評 価 を 適 切 に 行 うには 試 料 は 採 取 終 了 時 から 時 間 以 内 にバイオアッ セイに 供 することが 望 ましい そのため 試 験 機 関 は 試 料 の 搬 入 後 直 ちにバイオアッ セイを 開 始 できるように 事 前 の 準 備 を 行 う 試 験 機 関 が 排 水 採 取 後 時 間 以 内 にバイオア ッセイが 開 始 できない 場 合 には 改 めて 採 取 を 行 うか 開 始 できない 理 由 を 示 して 関 係 各 所 の 合 意 を 得 た 上 で 試 験 を 実 施 する 1) 試 験 機 関 に 搬 入 された 試 料 は 遮 光 および 保 冷 された 状 態 で 試 験 施 設 に 搬 入 後 粗 大 な 夾 雑 物 を 除 去 する 目 的 で 速 やかに 目 開 き 約 0 µmのプランクトンネット(ナイロ ン 製 )で 通 水 し 粗 大 な 夾 雑 物 を 除 去 する なお 藻 類 用 の 試 料 は ろ 過 滅 菌 (0.~0. µm)が 認 められていることから( 第 部..1 項 ) ろ 過 中 の 目 詰 まりが 懸 念 される 場 合 事 前 にガラス 繊 維 ろ 紙 (GF/F 孔 径 0. μm) でろ 過 することが 望 ましい ) 粗 大 な 夾 雑 物 を 除 去 した 後 当 日 使 用 分 を 除 いて 一 日 に 使 用 する 分 量 ずつ 密 栓 でき るガラス 製 容 器 に 試 料 を 分 注 し できるだけ 速 やかに 暗 所 (または 遮 光 容 器 )にて 冷 蔵 保 存 (0~ )する これらの 保 存 容 器 には 試 料 の 名 称 (またはその 識 別 記 号 ) および 容 器 個 別 の 識 別 記 号 などを 記 載 しておく ) 残 留 塩 素 SS TOC ph 硬 度 塩 分 (もしくは 電 気 伝 導 率 )などの 水 質 分 析 を 行 う ) なお 粗 大 な 夾 雑 物 を 除 去 前 の 排 水 についても 残 留 塩 素 SS TOC phなどを 測 定 しておくことが 望 ましい () 試 料 の 水 質 測 定 バイオアッセイに 用 いる 試 料 は 試 験 に 供 する 前 に 一 部 をガラスビーカーに 分 取 して ph および 溶 存 酸 素 ( 以 下 DO)を 測 定 する phは 排 水 基 準 を 遵 守 していれば.~. の 範 囲 内 であるため 原 則 として 調 整 しない ただし 輸 送 貯 蔵 途 中 で phが. 未 満 あるい は. 以 上 に 変 化 した 場 合 はその 限 りではない phが. 未 満 の 場 合 には 水 酸 化 ナトリウ ム(NaOH 1 N 程 度 )の 添 加 により ph. 付 近 に phが.を 超 える 場 合 には 塩 酸 (HCl 1 N 程 度 )の 添 加 により ph. 付 近 に 調 整 する また DOが 飽 和 濃 度 の 0% 未 満 の 場 合 には 先 端 の 口 径 が 1 mm 程 度 のガラス 管 (パス ツールピペットなど)を 用 いて 緩 やかに 通 気 し 溶 存 酸 素 が 飽 和 濃 度 の 0% 以 上 になった 時 点 で 止 める () バイオアッセイ 終 了 後 の 試 料 の 取 扱 い 試 験 施 設 で 保 存 する 試 料 については バイオアッセイの 終 了 後 適 切 な 方 法 により 処 分 する 事 業 者 の 要 望 などにより バイオアッセイの 再 実 施 などに 備 えた 長 期 保 存 も 可 能 で あるが 1 年 を 経 過 した 試 料 については 適 宜 処 分 しても 構 わない () バイオアッセイ 終 了 後 の 試 験 生 物 の 取 扱 い 試 験 終 了 後 の 試 験 生 物 は 回 収 し 環 境 中 に 排 出 されないよう 適 切 に 処 理 する 参 --

12 第 部 試 験 の 実 施 1. 試 験 計 画 の 立 案 1.1 試 験 計 画 立 案 の 流 れ 試 料 採 取 後 に 速 やかに 試 験 を 開 始 できるように 採 取 計 画 と 試 験 計 画 の 立 案 に 当 たっては あらかじめよく 調 整 しておく 必 要 がある よって 試 験 計 画 は 採 取 担 当 者 と 試 験 担 当 者 の 合 意 の 上 に 作 成 されなければならない 1. 実 施 する 試 験 ( 試 験 生 物 ) 魚 類 甲 殻 類 藻 類 の 種 の 生 物 を 用 い 標 準 化 された 試 験 法 に 基 づき 実 施 されることを 基 本 とする 排 水 の 自 然 環 境 への 影 響 についてより 理 解 を 深 めるために 上 記 生 物 以 外 の 試 験 を 追 加 で 行 うことは 構 わない 本 検 討 案 ではゼブラフィッシュ メダカ( 魚 類 ) ニセネコ ゼミジンコ( 甲 殻 類 ) ムレミカヅキモ( 藻 類 )を 用 いた 短 期 慢 性 毒 性 試 験 法 を 示 す 試 験 開 始 前 にそれぞれの 試 験 生 物 を 供 給 機 関 (たとえば 国 立 環 境 研 究 所 )から 入 手 し 馴 化 しておく また 入 手 した 生 物 について 標 準 物 質 による 感 受 性 試 験 を 実 施 しておくこと が 望 ましい 試 験 は 十 分 な 経 験 を 有 する 試 験 機 関 によって 実 施 されなければならない( 試 験 機 関 の 認 証 制 度 については 未 定 ) 1. 試 験 濃 度 の 設 定 試 験 に 用 いる 排 水 は 試 験 用 水 を 用 いて 希 釈 し 指 定 濃 度 に 調 製 する 試 験 用 水 とは 通 常 試 験 機 関 で 用 いている 飼 育 水 または OECD( 経 済 協 力 開 発 機 構 )テストガイドライン などに 記 載 されている 試 験 標 準 水 を 指 し 試 験 の 対 照 区 としても 用 いられる 試 験 用 水 の 一 般 水 質 分 析 は 定 期 的 に 行 う 無 希 釈 の 試 料 を 0%と 定 義 する 試 験 に 用 いる 希 釈 濃 度 区 の 範 囲 は 0% 以 下 とする 理 由 : 特 に 藻 類 の 試 験 において 排 水 0%では 窒 素 りんが 不 足 している 場 合 に 生 長 阻 害 が 起 きる 0%の OECD 培 地 存 在 下 では 窒 素 りん 不 足 が 解 消 されるこ とが 確 かめられているため 最 低 でも 0%の OECD 培 地 を 含 有 させる また 魚 類 及 び 甲 殻 類 の 試 験 においても 0% 排 水 で 試 験 をする 場 合 水 質 の 急 激 な 変 化 によるストレス 反 応 を 起 こす 可 能 性 があるため 藻 類 の 試 験 に 合 わせて 試 料 の 最 高 濃 度 を 0%とする 試 験 濃 度 は 希 釈 倍 率 を 公 比 とし 濃 度 区 を 基 本 とする すなわち および %とする ただし 過 去 に 実 施 した 試 験 の 結 果 などから 濃 度 区 を 増 減 すること も 可 能 である 1. スケジュールの 策 定 採 取 計 画 を 熟 知 した 上 で 試 験 実 施 のスケジュールを 作 成 する 排 水 入 手 日 に 速 やかに 試 験 が 開 始 できるように 下 記 に 示 すような 各 試 験 の 準 備 を 十 分 に 整 える( 詳 細 は 各 試 験 法 を 参 照 のこと) 魚 類 試 験 の 場 合 : 試 験 開 始 時 刻 に 受 精 卵 を 必 要 数 だけ 用 意 しなければならないため 参 --

13 事 前 に 産 卵 周 期 を 調 節 するなどの 配 慮 が 必 要 となる 甲 殻 類 試 験 の 場 合 : 試 験 開 始 の 約 1 週 間 以 上 前 から 供 試 個 体 を 選 別 するための 個 別 飼 育 (シングルカルチャー)を 開 始 する 藻 類 試 験 の 場 合 : 試 験 開 始 の ~ 日 前 から 指 数 増 殖 期 の 藻 類 細 胞 を 得 るための 前 培 養 を 開 始 する 排 水 入 手 時 の 状 態 ( 入 手 時 の 様 態 水 温 phなどの 一 般 水 質 )に 関 する 記 録 用 紙 を 用 意 する 試 験 期 間 中 の 試 料 保 存 ( 保 存 容 器 保 存 場 所 保 存 期 間 中 の 試 料 の 性 状 の 観 察 温 度 など)に 関 する 記 録 用 紙 を 用 意 する 1. 留 意 事 項 各 試 験 における 観 察 項 目 だけではなく 試 験 結 果 に 影 響 を 与 えると 考 えられる 試 験 中 の 事 項 についても 記 載 する 客 観 的 に 試 験 が 遂 行 されていることを 証 明 できるように 結 果 の 記 載 方 法 などについ て 工 夫 する 試 験 の 有 効 性 条 件 を 満 たさなかった 場 合 の 対 応 ( 再 試 験 や 試 料 の 再 採 取 の 実 施 など) については 試 験 依 頼 者 と 相 談 の 上 決 定 する 参 --

14 胚 仔 魚 期 の 魚 類 を 用 いる 短 期 毒 性 試 験 法.1 試 験 の 概 要 本 試 験 は 魚 類 の 胚 を 排 水 ( 以 下 試 料 )に 受 精 直 後 からふ 化 後 の 卵 黄 吸 収 完 了 の 直 前 ま でばく 露 し ふ 化 率 や 生 存 率 発 生 異 常 などを 調 べ 対 照 区 と 比 較 することにより 胚 仔 魚 期 の 魚 類 に 対 する 試 料 の 致 死 影 響 ( 急 性 毒 性 )および 亜 致 死 的 影 響 ( 亜 慢 性 毒 性 )を 明 ら かにすることを 目 的 とする 器 官 形 成 や 体 成 長 など 生 物 にとって 重 要 かつ 外 的 影 響 を 受 け やすい 時 期 ( 発 生 成 長 段 階 )である 胚 期 の 魚 類 をばく 露 に 用 いることから 試 料 の 魚 類 に 対 する( 亜 ) 慢 性 毒 性 に 相 当 する 影 響 が 推 定 できると 考 えられる 本 試 験 法 は OECDテストガイドライン 1 Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-fry Stages (1) 国 際 標 準 化 機 構 (ISO) 規 格 Water quality Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio) () および 米 国 環 境 保 護 庁 (U.S. EPA)の 試 験 法 Fathead Minnow, Pimephales promelas, embryo-larval survival and teratogenicity test method () を 参 考 にして 策 定 したものである 本 試 験 の 実 施 には 本 試 験 法 のほかに 胚 期 を 含 む 時 期 の 魚 類 が 試 験 生 物 として 用 いられている 既 存 試 験 法 のガイドラインなど (1)-() も 参 考 となる. 試 験 生 物..1 生 物 種 ゼブラフィッシュ(Danio rerio)またはメダカ(oryzias latipes)が 推 奨 される ゼブラフィッシュとメダカは 既 存 の 排 水 (または 環 境 水 )を 対 象 とする 試 験 ガイドラインまたは 国 際 規 格 などで 用 いられている 魚 種 であり ()() 小 型 で 飼 育 や 繁 殖 ( 採 卵 ) 手 法 が 確 立 されている 本 種 は 現 在 世 界 各 国 の 大 学 や 研 究 機 関 ( 国 立 環 境 研 究 所 等 ) 等 から 入 手 できるが 適 切 な 方 法 で 維 持 継 代 されている 系 統 を 入 手 する 入 手 した 生 物 は 試 験 を 実 施 する 施 設 で 馴 化 し 再 現 性 のある 試 験 結 果 が 得 られることを 確 認 し ておく 試 験 生 物 の 繁 殖 飼 育 および 採 卵 方 法 などについては 本 検 討 案 のほかに 既 存 の 試 験 法 ガイドライン やガイダンスドキュメントなどの 方 法 (1)()()()-(1) を 参 考 にしてもよい.. 採 卵 に 用 いる 親 魚 (1) 系 統 試 験 には 化 学 物 質 の 毒 性 試 験 に 用 いられている 系 統 を 用 いることが 望 ましい 観 賞 用 特 殊 な 実 験 への 利 用 を 目 的 に 作 出 された 系 統 ( 近 交 系 など) 遺 伝 子 組 み 換 え 魚 などは 推 奨 しない () 履 歴 試 験 に 用 いる 受 精 卵 を 得 るための 親 魚 には 試 験 に 用 いるまでの 履 歴 が 明 確 な 個 体 を 用 いる そのため 試 験 施 設 で 継 代 的 に 繁 殖 飼 育 されている 個 体 を 用 いることが 推 奨 される 採 卵 には 繁 殖 が 可 能 な 大 きさ( 齢 )に 達 した 成 熟 した 雌 雄 を 用 いるが 初 回 産 卵 や 老 成 した 雌 から 得 た 卵 は 受 精 率 や 受 精 卵 のふ 化 率 が 低 い 場 合 があるため 注 意 する 参 --

15 () 飼 育 および 選 抜 成 熟 期 までの 期 間 は 魚 種 または 発 育 段 階 や 大 きさに 応 じて 適 切 な 条 件 下 で 飼 育 する この 飼 育 群 から 外 見 的 に 異 常 がなく 成 熟 した 雌 雄 を 親 魚 として 選 抜 する 性 別 ( 雌 雄 ) および 成 熟 状 態 は 魚 種 に 応 じて 二 次 性 徴 体 型 体 色 などから 判 別 する 採 卵 用 の 親 魚 は 受 精 卵 の 採 取 を 実 施 するまでの 間 ばく 露 試 験 に 用 いる 試 験 用 水 と 同 質 の 水 で 飼 育 する 飼 育 水 槽 は 個 体 数 に 合 わせて 適 切 な 大 きさのものを 用 いる 飼 育 は 流 水 式 または 半 止 水 式 で 行 う 適 切 な 餌 を 十 分 に 与 えるが 餌 の 食 べ 残 しや 糞 などによる 水 質 悪 化 を 招 かないようにする 試 験 開 始 に 合 わせて 確 実 に 良 好 な 受 精 卵 を 得 るためには 飼 育 中 に 雌 が 産 卵 した 卵 の 受 精 率 やふ 化 率 を 定 期 的 に 調 べ 良 い 個 体 を 選 別 しておくとよい.. 受 精 卵 の 採 取 (1) 採 卵 および 受 精 卵 の 選 別 良 質 な 受 精 卵 を 得 るためには 選 抜 した 親 魚 を 適 切 な 密 度 および 性 比 で 水 槽 ( 産 卵 用 水 槽 )に 収 容 して 産 卵 させることが 重 要 である 採 卵 に 用 いる 親 魚 の 個 体 数 は 試 験 に 必 要 な 受 精 卵 数 と 雌 1 個 体 あたりの 産 卵 数 を 考 慮 して 決 める 試 験 には 胞 胚 期 までの 卵 ( 胚 ) を 用 いるため 試 験 の 開 始 予 定 時 刻 に 合 わせて 採 卵 ができるように 親 魚 を 準 備 しておく(た とえば 照 明 の 点 灯 時 刻 を 調 節 するなどの 方 法 により 産 卵 時 刻 の 人 為 的 な 調 整 を 行 う) 参 考 として ゼブラフィッシュおよびメダカでの 親 魚 の 飼 育 および 採 卵 方 法 を 別 添 1および に 示 す 産 卵 用 水 槽 に 産 出 された 卵 は ピペットやサイフォンなどを 用 いて 飼 育 水 と 一 緒 に 速 や かに 回 収 する このとき 卵 は 可 能 な 限 り 空 気 に 晒 さないように 注 意 して 取 り 扱 う 回 収 した 卵 を 適 量 の 飼 育 水 と 一 緒 にシャーレなどに 移 し 入 れ 実 体 顕 微 鏡 下 で 観 察 し 未 受 精 卵 や 形 態 などに 異 常 が 認 められる 卵 を 除 去 し 試 験 に 必 要 な 数 の 受 精 卵 ( 供 試 用 受 精 卵 ) を 得 る このとき 容 器 内 の 糞 などの 異 物 をできる 限 り 除 去 する 供 試 用 受 精 卵 を 入 れた 容 器 は ばく 露 開 始 時 まで 試 験 温 度 に 調 整 した 恒 温 装 置 内 に 静 置 しておく.. 試 験 に 用 いる 受 精 卵 試 験 には 受 精 後 から 胞 胚 期 までの 発 生 段 階 にある 胚 ( 受 精 卵 )を 供 することが 望 まし い ゼブラフィッシュでは 受 精 後 時 間 以 内 メダカでは 受 精 後 時 間 以 内 の 胚 であるこ とが 望 ましい. 試 験 用 水 試 験 用 水 には 有 害 物 質 が 含 まれていない 良 質 の 淡 水 (たとえば 活 性 炭 で 脱 塩 素 処 理 した 水 道 水 など)を 用 いる phは.~. 溶 存 酸 素 は 飽 和 酸 素 濃 度 の 0% 以 上 とする 試 験 に は 必 ず 試 験 用 水 を 対 照 区 として 設 ける. 試 験 容 器 装 置 および 器 具 試 験 容 器 : 容 量 0 ml 程 度 のガラス 製 容 器 ( 直 径 cm 程 度 ) 参 --

16 ( 水 分 蒸 発 や 揮 発 成 分 の 周 囲 への 影 響 を 防 ぐために 透 光 性 のあるふたなどで 容 器 を 覆 うなどの 工 夫 をする ) 恒 温 装 置 : 温 度 照 明 条 件 ( 照 度 明 暗 周 期 )を 一 定 に 維 持 できる 装 置 (インキュベー ター ウォーターバスなど)または 部 屋 観 察 装 置 : 実 体 顕 微 鏡 水 質 測 定 装 置 : 水 温 計 溶 存 酸 素 計 ph 計 など 器 具 類 :メスシリンダー ガラスピペット( 先 端 の 口 径 を ~ mmに 広 げ バーナーな どで 焼 き 丸 めたもの) ガラス 容 器 (ビーカーまたは 試 薬 瓶 )など ( 器 具 類 の 材 質 は 適 切 なものを 選 択 する ). 試 験 方 法 および 条 件..1 試 料 の 前 処 理 試 料 は 第 部. 項 に 示 した 前 処 理 を 除 いて 前 処 理 せずに 試 験 に 供 することが 望 まし い.. 試 験 溶 液 の 調 製 試 験 溶 液 は 試 験 濃 度 ごとに 適 当 量 の 試 料 を 試 験 用 水 と 混 合 ( 試 料 を 試 験 用 水 で 希 釈 ) して 調 製 する なお 試 験 濃 度 ( 試 験 溶 液 中 の 試 料 の 濃 度 )は 無 希 釈 の 試 料 を 0%とす る 対 照 区 の 試 験 溶 液 には 試 験 用 水 を 用 いる 試 験 濃 度 は 希 釈 倍 率 を 公 比 とする 濃 度 区 を 基 本 とする および % の 濃 度 区 を 標 準 とするが 過 去 に 実 施 した 試 験 の 結 果 などから 最 大 無 影 響 濃 度 が 含 ま れるように 濃 度 区 を 増 減 することも 検 討 してよい 試 験 溶 液 の 調 製 では 試 料 濃 度 ごとに 清 浄 なガラス 容 器 (ビーカーまたは 試 薬 瓶 )を 用 意 し メスシリンダーなどを 用 いて 試 料 必 要 量 を 分 取 し 同 じく 必 要 量 の 試 験 用 水 と 混 合 して 所 定 濃 度 に 希 釈 する 沈 殿 物 がある 場 合 はよく 撹 拌 してから 希 釈 を 行 う 調 製 した 試 験 溶 液 の 水 温 は 恒 温 装 置 内 に 静 置 などして 試 験 温 度 に 調 温 する.. 試 験 条 件 ばく 露 方 式 : 半 止 水 式 ( 少 なくとも 週 回 日 または 日 ごとに 換 水 ) ばく 露 期 間 :ふ 化 日 から 日 後 まで ゼブラフィッシュ:ばく 露 開 始 から ~ 日 間 メダカ:ばく 露 開 始 から 1~1 日 間 繰 り 返 し 数 : 容 器 以 上 / 濃 度 区 供 試 卵 数 : 最 低 粒 / 容 器 (1 粒 / 容 器 が 推 奨 される) 試 験 溶 液 量 :0 ml/ 容 器 試 験 温 度 :ゼブラフィッシュ ±1 メダカ ±1 ( 容 器 間 変 動 および 日 間 変 動 は 1. 以 下 であることが 望 ましい) 照 明 : 室 内 光 で 明 期 1~1 時 間 暗 期 ~1 時 間 給 餌 :なし 参 --

17 通 気 :なし 対 照 区 において 0%を 超 える 胚 ( 受 精 卵 )がふ 化 した 日 をふ 化 日 (ふ 化 0 日 後 )とする.. 試 験 操 作 後 述 の 試 験 操 作 を 行 う 際 は 操 作 中 試 験 溶 液 の 水 温 ができるだけ 変 化 しないように 配 慮 する(たとえば ウォーターバスの 使 用 や 実 験 室 の 室 温 を 試 験 温 度 付 近 にしておくなど) (1)ばく 露 開 始 時 の 操 作 試 験 容 器 には 試 験 濃 度 や 容 器 番 号 などを 記 載 (またはラベルを 添 付 )しておく あらかじめ 調 製 した 各 試 験 溶 液 の 水 温 を 測 定 し 試 験 温 度 の 範 囲 を 外 れている 場 合 は 再 度 恒 温 装 置 内 に 静 置 などして 水 温 を 調 整 する 各 試 験 容 器 に 調 製 した 試 験 溶 液 を 分 注 する( 各 0 ml) 前 述.. で 用 意 した 供 試 用 受 精 卵 を 試 験 濃 度 ごとに 試 験 容 器 に 必 要 数 ( 試 験 濃 度 あたりの 供 試 数 )を 手 早 くガラスピペットを 用 いて 移 し 入 れる この 時 点 を ばく 露 開 始 とする 受 精 卵 を 入 れた 試 験 容 器 は ふたなど( 透 光 性 のあるもの)で 覆 い 速 やかに 恒 温 装 置 内 に 入 れる ()ばく 露 期 間 中 の 操 作 原 則 としてばく 露 開 始 から 時 間 ごとに すべての 試 験 容 器 について 試 験 生 物 の 観 察 を 行 う 死 亡 個 体 がみられた 場 合 は 速 やかに 除 去 する 観 察 の 終 了 後 試 験 溶 液 を 少 な くとも 週 回 日 または 日 ごとに 換 水 する 換 水 時 には 試 験 溶 液 の 水 質 測 定 を 行 う 試 験 溶 液 の 換 水 または 観 察 終 了 後 試 験 容 器 を 速 やかに 恒 温 装 置 内 に 戻 す 一 般 に 胚 期 および 仔 魚 期 の 魚 類 は 物 理 的 刺 激 に 対 して 脆 弱 で ガラスピペットで 試 験 溶 液 とともに 吸 引 された 際 などに 骨 折 による 奇 形 を 生 じることがある そのため 試 験 溶 液 の 換 水 は 試 験 容 器 内 の 試 験 溶 液 のみを 抜 き 取 って 新 しいものに 入 れ 替 える 方 法 で 行 うこ とを 基 本 とする( 換 水 手 順 1) ただし 試 験 容 器 内 に 顕 著 な 微 生 物 の 増 殖 ( 容 器 壁 面 の バイオフィルム 形 成 など)が 認 められるなど 試 験 結 果 に 影 響 を 及 ぼす 可 能 性 が 考 えられ る 場 合 には 換 水 時 に 試 験 容 器 も 清 浄 なものに 交 換 する 方 法 で 換 水 を 行 う( 換 水 手 順 ) いずれの 方 法 を 用 いる 場 合 でも 換 水 する 際 に 試 験 生 物 を 傷 つけたり 逸 失 したりしない ように 注 意 する 換 水 手 順 1: 試 験 容 器 を 交 換 しない 場 合 ガラスピペットを 用 いて 試 験 生 物 を 吸 わないように 注 意 して 試 験 容 器 内 の 試 験 溶 液 を 約 ml 残 して 除 去 する そこにできるだけ 試 験 生 物 をかく 乱 しないよう 緩 やかに 新 調 し た 試 験 溶 液 ( 水 温 調 整 したもの)を 0 ml 入 れる この 方 法 により 換 水 した 場 合 は 試 験 溶 液 の 約 0%が 新 鮮 な 試 験 溶 液 に 入 れ 替 わり 換 水 後 の 試 験 液 量 は 約 mlになる 換 水 手 順 : 試 験 容 器 を 交 換 する 場 合 新 しい 試 験 容 器 に 新 調 した 試 験 溶 液 0 ml を 入 れる ガラスピペットを 用 いて 換 水 参 --1

18 前 の 試 験 容 器 内 の 試 験 生 物 を 少 量 の 試 験 溶 液 とともに 新 しい 試 験 容 器 に 移 し 入 れる こ のとき 試 験 生 物 と 一 緒 に 新 しい 試 験 容 器 に 持 ち 越 す 試 験 溶 液 は ml 以 下 ( 試 験 液 量 の % 以 下 )にする ()ばく 露 終 了 時 の 操 作 すべての 試 験 容 器 について 試 験 生 物 の 観 察 および 試 験 溶 液 の 水 質 測 定 を 行 う すべて の 試 験 操 作 の 終 了 後 試 験 に 供 した 試 料 および 生 物 は 適 切 な 方 法 で 処 分 する.. 水 質 の 測 定 すべての 試 験 濃 度 について ばく 露 開 始 時 ばく 露 期 間 中 の 換 水 前 後 ばく 露 終 了 時 の 試 験 溶 液 の 水 温 ph 溶 存 酸 素 を 測 定 し 記 録 する なお 換 水 前 の 試 験 溶 液 とは 新 調 し た 試 験 溶 液 換 水 後 の 試 験 溶 液 とは 換 水 時 に 除 去 した 試 験 溶 液 を 指 す.. 試 験 生 物 の 観 察 試 験 容 器 中 の 試 験 生 物 を 肉 眼 または 実 体 顕 微 鏡 下 で 観 察 し 生 死 およびふ 化 した 胚 体 数 を 記 録 する 発 生 前 期 ( 器 官 形 成 前 )の 胚 では 全 体 の 透 明 性 が 消 失 して 白 濁 したものを 死 亡 とみなす 発 生 後 期 ( 器 官 形 成 後 )およびふ 化 後 の 仔 魚 では 白 濁 または 心 臓 の 拍 動 が 認 められないものを 死 亡 とみなす 卵 膜 から 胚 ( 体 躯 部 )が 完 全 に 出 ていない 状 態 のも のはふ 化 前 とみなす 観 察 後 死 亡 した 胚 仔 魚 およびふ 化 後 の 卵 膜 を 除 去 する ばく 露 開 始 から 時 間 後 以 降 の 観 察 では 各 試 験 濃 度 の 生 存 する 胚 または 仔 魚 のうち 対 照 区 と 比 較 して 体 躯 の 発 育 不 全 尾 部 の 卵 黄 からの 不 分 離 などの 形 態 異 常 心 拍 数 の 低 下 あるいは 行 動 などに 異 常 が 認 められる 個 体 数 を 記 録 しておくことも 供 試 試 料 の 毒 性 の 評 価 などにおいて 有 効 である ()().. 試 験 の 有 効 性 本 試 験 は 以 下 を 満 たさなければならない 対 照 区 におけるふ 化 率 (..1() 参 照 )が 0% 以 上 であること 対 照 区 におけるばく 露 終 了 時 の 生 存 率 が 0% 以 上 であること 対 照 区 における 溶 存 酸 素 がばく 露 期 間 を 通 して 飽 和 酸 素 濃 度 の 0% 以 上 であること. 結 果 の 算 出 方 法..1 影 響 指 標 の 算 出 試 験 から 得 られたデータをもとに 以 下 に 定 義 される 影 響 指 標 値 を 試 験 容 器 ごとに 算 出 する (1) 生 存 率 供 試 卵 数 に 対 する ばく 露 終 了 時 に 生 存 した 胚 体 または 仔 魚 数 の 割 合 (%) 生 存 率 =ばく 露 終 了 時 の( 生 存 胚 体 数 + 生 存 仔 魚 数 )/ 供 試 卵 数 0 発 生 は 進 んでいるがふ 化 前 の 胚 ( 卵 ) 参 --1

19 () ふ 化 率 供 試 卵 数 に 対 する 最 大 ふ 化 所 要 日 数 までにふ 化 した 卵 数 の 割 合 (%) ふ 化 率 = 最 大 ふ 化 所 要 日 数 での 総 ふ 化 仔 魚 数 / 供 試 卵 数 0 ゼブラフィッシュの 最 大 ふ 化 所 要 日 数 はばく 露 開 始 から 日 後 メダカの 最 大 ふ 化 所 要 日 数 はばく 露 開 始 から 1 日 後 () ふ 化 後 生 存 率 ばく 露 期 間 にふ 化 した 仔 魚 数 に 対 する ばく 露 終 了 時 に 生 存 した 仔 魚 数 の 割 合 (%) ふ 化 後 生 存 率 =ばく 露 終 了 時 の 生 存 仔 魚 数 /ばく 露 期 間 の 総 ふ 化 仔 魚 数 0 () 生 存 指 標 ふ 化 に 対 する 遅 延 の 影 響 も 加 味 した 胚 期 からふ 化 後 の 仔 魚 に 対 する 影 響 の 指 標 生 存 指 標 =ふ 化 率 ふ 化 後 生 存 率 /0 試 料 の 胚 に 対 する 影 響 (ふ 化 率 )とふ 化 後 の 仔 魚 に 対 する 影 響 (ふ 化 後 生 存 率 )を 総 合 する 指 標 なお 最 大 ふ 化 所 要 日 数 までにすべての 供 試 卵 がふ 化 または 死 亡 した 場 合 には 生 存 指 標 は(1)の 生 存 率 と 等 しくなる.. 最 大 無 影 響 濃 度 ふ 化 率 ふ 化 後 生 存 率 生 存 率 または 生 存 指 標 について 対 照 区 と 比 較 して 統 計 学 的 に 有 意 な 低 下 が 認 められた 最 も 低 い 試 験 濃 度 を 最 小 影 響 濃 度 (LOEC) その 一 つ 下 の 試 験 濃 度 を 最 大 無 影 響 濃 度 (NOEC)とする(ただし LOECより 高 濃 度 では LOECと 同 等 以 上 の 影 響 がみられること) すべての 試 験 濃 度 において いずれの 影 響 指 標 値 も 対 照 区 と 有 意 差 が 認 められなかった 場 合 は 最 も 高 い 試 験 濃 度 を NOECとする なお 統 計 学 的 手 法 では 対 照 区 と 各 試 験 濃 度 間 の 有 意 差 を 適 切 に 検 出 できない 場 合 は 非 線 形 回 帰 モデルなどを 用 いて 推 定 した ECx/ICx(x% 影 響 / 阻 害 濃 度 )を 算 出 してもよい (1) ( 詳 細 は 第 部 を 参 照 のこと) ECx/ICx 推 定 では 各 試 験 濃 度 における 影 響 指 標 値 は 全 試 験 容 器 の 平 均 値 を 用 い 以 下 の 式 (Abbott s formula)による 補 正 を 行 う P = 0 -{(C-P ) / C 0} ここで P: 補 正 された 各 試 験 濃 度 における 影 響 指 標 値 P : 各 試 験 濃 度 における 観 察 された 影 響 指 標 値 C: 対 照 区 における 観 察 された 影 響 指 標 値. 参 考 文 献 (1) OECD (1), OECD Guideline for testing of chemicals 1, Fish, Short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages. () ISO (00), International Standard, Water quality Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio). () U.S. EPA (00), WET Test Method 01.0, Fathead Minnow, Pimephales promelas, embryo-larval survival and teratogenicity test method, Short-term methods for estimating the 参 --1

20 chronic toxicity of effluents and receiving waters to freshwater organisms, Fourth edition, pp.-. () OECD (1), OECD Guideline for testing of chemicals, Fish, early-life stage toxicity test. () OECD (01), OECD Guideline for testing of chemicals, Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test. () U.S. EPA (1), Ecological effects test guidelines OPPTS 0.0, Fish early-life stage toxicity test. () ASTM (00), Standard guide for conducting early life-stage toxicity tests with fishes, E-0, Annual books ASTM standards, vol.0, 00, pp.0-. () ECETOC (00), Alternative testing approaches in environmental safety assessment, ECETOC Technical Report No.. () U.S. EPA (), Guidelines for conducting early life stage toxicity tests with Japanese Medaka (Oryzias latipes), EPA/00/-1-0. () Umweltbundesamt (00), Background paper on fish embryo toxicity assays, UBA Conduct Number 0 ) () Monte Westerfield (00), The zebrafish book, A guide for laboratory use of zebrafish (Danio rerio), edition, Institute of Neuroscience, University of Oregon. (1) Environment Canada (1), Biological Test Method: Test of larval growth and survival using Fathead minnows, Report EPS 1/RM/. (1) OECD (00), Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, OECD series on testing and assessment, Number. (1) European Commission (00), Technical guidance document on risk assessment. Part II, Institute for Health and Consumer Protection, European Chemicals Bureau., EUR 01 EN/. (1) 岩 松 鷹 司 (1), メダカ 学 全 書, 株 式 会 社 大 学 教 育 出 版. 参 --1

21 ( 別 添 1)ゼブラフィッシュでの 受 精 卵 の 採 取 法 ゼブラフィッシュでは 以 下 に 示 す 方 法 により 効 率 的 に 採 卵 予 定 日 (ばく 露 試 験 の 開 始 日 )に 受 精 卵 を 採 取 することができる なお 下 記 以 外 の 方 法 で 親 魚 を 飼 育 して 産 卵 させ 受 精 卵 を 得 ることも 可 能 である ()() (1) 採 卵 に 用 いる 親 魚 採 卵 に 用 いる 親 魚 は ~1カ 月 齢 の 個 体 が 適 している 試 験 施 設 で 繁 殖 飼 育 した 個 体 を 用 いることが 望 ましい () 親 魚 の 維 持 飼 育 および 選 抜 ふ 化 から 約 カ 月 齢 までは 発 育 段 階 や 大 きさに 応 じて 適 切 な 条 件 下 で 飼 育 する この 飼 育 個 体 群 から 外 見 的 に 異 常 が 認 められない 成 熟 した 個 体 を 試 験 に 供 する 受 精 卵 を 得 るた めの 親 魚 として 選 抜 する 性 別 ( 雌 雄 )および 成 熟 状 態 は 体 型 および 体 色 から 判 別 可 能 である 選 別 した 親 魚 は 後 述 の 受 精 卵 採 取 まで 以 下 の 条 件 下 で 維 持 ( 飼 育 )する 水 槽 は 飼 育 する 個 体 数 に 合 わせて 適 切 な 大 きさのものを 用 いる 飼 育 水 には ばく 露 試 験 に 用 いる 試 験 用 水 と 同 質 の 水 (たとえば 活 性 炭 で 脱 塩 素 処 理 した 水 道 水 など)を 用 いる 雌 の 産 卵 数 や 卵 質 は 餌 料 にも 依 存 するため 維 持 飼 育 中 はできるだけ 多 様 な 餌 を 十 分 に 与 える そのため 採 卵 に 用 いる 親 魚 は 飼 育 水 を 連 続 的 に 供 給 する 流 水 式 で 飼 育 することが 望 まし いが 半 止 水 式 で 飼 育 する 場 合 は 餌 の 食 べ 残 しや 糞 などによる 水 質 悪 化 を 招 かないよう に 適 切 な 頻 度 で 換 水 する 一 般 にゼブラフィッシュでは 初 回 の 産 卵 は 産 卵 数 が 少 なく 受 精 率 が 低 い また 低 い 受 精 率 やふ 化 率 は 雄 よりも 雌 ( 卵 質 )に 依 存 する 場 合 が 多 く 受 精 率 やふ 化 率 が 低 い 卵 を 産 んだ 雌 はその 後 も 受 精 率 やふ 化 率 の 低 い 卵 を 産 む 傾 向 にあるとされている そのため 可 能 であれば 維 持 飼 育 中 に 後 述 する 受 精 卵 採 取 の 方 法 などにより 雌 に 数 回 産 卵 させ 受 精 率 やふ 化 率 の 高 い 卵 を 産 む 個 体 を 選 別 しておくとよい 親 魚 の 飼 育 条 件 は 以 下 のとおり である () 親 魚 の 飼 育 条 件 水 温 :±1 照 明 :1~1 時 間 明 /1~ 時 間 暗 ( 照 度 は 通 常 の 室 内 程 度 ) 飼 育 密 度 : 飼 育 水 1 Lあたり 1 個 体 未 満 餌 料 : 市 販 の 観 賞 魚 用 飼 料 ふ 化 直 後 のアルテミアやミジンコ 類 など () 採 卵 用 親 魚 の 準 備 ( 雌 雄 の 分 離 飼 育 ) 採 卵 予 定 日 (ばく 露 試 験 の 開 始 日 ) 前 に 維 持 飼 育 している 親 魚 群 から 採 卵 に 用 いる 親 魚 ( 雌 : 雄 の 比 = 約 1:)を 選 抜 する 選 別 した 親 魚 は 採 卵 予 定 日 の 前 日 ~1 週 間 程 度 前 から 雌 雄 を 別 々の 水 槽 に 隔 離 して 飼 育 しておく( 適 切 な 雌 雄 分 離 の 日 数 は 個 体 によっ ても 異 なるため 事 前 に 使 用 する 採 卵 用 の 親 魚 で 調 べておくことが 望 ましい) 飼 育 条 件 な どは 維 持 飼 育 と 同 じでよい 参 --1

22 () 親 魚 のペアリング( 参 考 例 ) 採 卵 予 定 日 の 採 卵 時 刻 の 1 時 間 程 度 前 に 分 離 飼 育 しておいた 雄 と 雌 を 同 じ 産 卵 用 水 槽 に 収 容 する 産 卵 用 の 水 槽 として 雌 の 産 卵 後 に 沈 降 した 卵 を 同 居 する 親 魚 が 食 べるのを 防 ぐために 底 に 直 径 1~1. cmのガラスビーズを 敷 き 詰 めるか 水 槽 底 から ~ cmの 位 置 に 目 合 い mm 程 度 のメッシュを 設 置 しておく 卵 の 回 収 が 容 易 であり また 受 精 率 の 高 い 卵 のみを 選 択 して 試 験 に 用 いることができるように 親 魚 のペアリングは 複 数 の 小 型 水 槽 を 用 いるのが 望 ましい(たとえば L 程 度 のガラス 水 槽 を 用 いる) 産 卵 用 水 槽 には 約 1:の 比 率 で 雌 雄 を 入 れる 飼 育 密 度 は 飼 育 水 量 1Lあたり 1~ 個 体 とする(たとえば Lの 水 槽 に 雄 ~ 個 体 と 雌 ~ 個 体 ) 採 卵 に 用 いる 雌 の 個 体 数 は 試 験 に 必 要 な 受 精 卵 数 を 考 慮 して 決 める なお 採 卵 予 定 日 前 日 の 消 灯 直 前 に 雌 雄 をペアリングし 翌 日 の 照 明 点 灯 直 後 に 産 卵 さ せることもできる ただし 雌 の 産 卵 時 刻 は それまでの 照 明 周 期 ( 点 灯 時 刻 )の 影 響 を 受 ける 場 合 があるので 予 定 の 採 卵 時 刻 に 産 卵 が 行 われるように 事 前 に 照 明 周 期 に 馴 化 さ せておくことが 必 要 である また 雌 雄 の 親 魚 を 入 れた 水 槽 は 照 明 の 点 灯 まで 光 が 入 ら ないように 水 槽 全 体 を 箱 などで 覆 い 完 全 に 遮 光 ( 暗 条 件 )した 状 態 にしておく () 採 卵 採 卵 用 の 親 魚 ( 雌 )が 産 卵 可 能 な 状 態 であれば ペアリングしてからおよそ 0 分 ~1. 時 間 後 までに 産 卵 がみられる 雌 の 産 卵 を 確 認 できたら(または 明 条 件 にしてから 1. 時 間 後 に) 水 槽 底 に 沈 降 した 卵 を 回 収 する ガラスビーズを 敷 いた 産 卵 用 水 槽 を 用 いた 場 合 は ネットなどで 水 槽 内 の 親 魚 を 別 の 水 槽 に 移 してから ガラスビーズが 入 らないように 目 合 い mm 程 度 のネットを 通 して 別 の 容 器 に 飼 育 水 と 一 緒 に 回 収 する メッシュを 設 置 した 産 卵 用 水 槽 を 用 いた 場 合 は 親 魚 を 別 の 水 槽 に 移 してからメッシュを 外 して サイフォンなどを 用 いて 水 槽 底 に 沈 降 し ている 卵 を 飼 育 水 と 一 緒 に 別 の 容 器 に 回 収 する () 受 精 卵 の 選 別 容 器 に 回 収 した 卵 は ピペット( 先 端 の 内 径 は mm 程 度 )で 適 量 の 飼 育 水 と 一 緒 にシャ ーレに 移 し 入 れ 実 体 顕 微 鏡 下 で 観 察 して 未 受 精 卵 ( 外 見 的 に 透 明 感 がない または 細 胞 分 裂 がみられない 状 態 のもの)を 除 去 する また 受 精 卵 のうち 形 状 が 歪 んで いる 卵 膜 や 卵 黄 に 白 濁 部 がみられる 卵 割 のサイズが 不 均 一 である などの 異 常 が 認 められるものも 除 去 する このとき 混 入 している 糞 なども 除 去 する 選 別 後 受 精 卵 の 入 ったシャーレの 飼 育 水 を 試 験 に 用 いる 試 験 用 水 で 置 換 する 試 験 用 水 の 水 温 は 試 験 温 度 (±1 )に 調 整 しておく この 受 精 卵 の 選 別 作 業 は 各 産 卵 用 水 槽 から 回 収 した 卵 を 混 合 せずに 産 卵 用 水 槽 ごと に 別 のシャーレに 移 し 入 れて 行 う また 作 業 中 の 水 温 変 化 を 防 ぐために 室 温 ( 実 験 室 ) を 試 験 温 度 付 近 に 調 整 しておくことが 望 ましい 参 --1

23 ( 別 添 )メダカでの 受 精 卵 の 採 取 法 メダカでは 以 下 に 示 す 方 法 により 親 魚 の 飼 育 ( 繁 殖 )し 試 験 に 用 いるための 受 精 卵 を 採 取 することができる なお 親 魚 飼 育 および 受 精 卵 採 取 の 方 法 は 既 存 の 文 献 なども 参 考 にすることが 望 ましい ()(1) (1) 採 卵 に 用 いる 親 魚 カ 月 齢 以 上 の 成 熟 した 個 体 を 採 卵 用 の 親 魚 として 用 いる ただし 老 成 した 雌 では 受 精 率 が 低 い 場 合 があるので 注 意 する 採 卵 用 の 親 魚 は 試 験 施 設 で 繁 殖 飼 育 した 個 体 を 用 いることが 望 ましい ふ 化 から 成 熟 期 ( 約 カ 月 齢 )までは 発 育 段 階 や 大 きさに 応 じて 適 切 な 条 件 下 で 飼 育 する この 飼 育 個 体 群 から 外 見 的 に 異 常 が 認 められない 成 熟 した 個 体 を 試 験 に 供 する 受 精 卵 を 得 るため の 親 魚 として 選 抜 する 性 別 ( 雌 雄 )および 成 熟 状 態 は 体 型 および 体 色 から 判 別 可 能 で ある () 親 魚 の 飼 育 メダカの 親 魚 は 以 下 の 条 件 下 で 飼 育 ( 繁 殖 )する 水 槽 は 飼 育 する 個 体 数 に 合 わせ て 適 切 な 大 きさのものを 用 いる 飼 育 水 には ばく 露 試 験 に 用 いる 試 験 用 水 と 同 質 の 水 (た とえば 活 性 炭 で 脱 塩 素 処 理 した 水 道 水 など)を 用 いる 一 般 に メダカは 十 分 に 給 餌 し て 良 好 な 環 境 で 飼 育 すれば 毎 日 産 卵 させることも 可 能 である そのため 受 精 卵 を 得 るた めの 飼 育 は 飼 育 水 を 連 続 的 に 供 給 する 流 水 式 で 行 うことが 望 ましい 半 止 水 式 で 飼 育 す る 場 合 は 餌 の 食 べ 残 しや 糞 などによる 水 質 悪 化 を 招 かないように 適 切 な 頻 度 で 換 水 する 飼 育 する 個 体 数 は 試 験 に 必 要 な 受 精 卵 数 を 考 慮 して 決 める 一 般 にメダカの 産 卵 数 は 1 個 体 当 たり ~0 粒 / 日 であるが 採 卵 予 定 日 にすべての 雌 が 産 卵 するとは 限 らないため その 点 も 考 慮 して 必 要 な 受 精 卵 を 得 るのに 十 分 な 個 体 数 を 用 意 する 水 温 :±1 照 明 :1~1 時 間 明 /1~ 時 間 暗 ( 照 度 は 通 常 の 室 内 程 度 ) 飼 育 密 度 : 飼 育 水 1Lあたり 個 体 程 度 として 雄 : 雌 =1:とする (たとえば 0L 水 槽 に 雌 0 個 体 と 雄 0 個 体 ) 餌 料 : 市 販 の 観 賞 魚 用 飼 料 ふ 化 直 後 のアルテミアやミジンコ 類 など () 採 卵 メダカの 雌 は 照 明 の 点 灯 後 0 分 ~1. 時 間 に 産 卵 する 雌 の 産 卵 を 確 認 できたらネッ トなどで 雌 をすくい 腹 部 ( 総 排 泄 口 )に 付 着 している 卵 塊 を 採 取 する 水 槽 底 に 落 下 し ている 卵 塊 はサイフォンなどを 用 いて 飼 育 水 と 一 緒 に 別 の 容 器 に 回 収 する 採 取 した 卵 塊 は 適 量 の 飼 育 水 と 一 緒 にシャーレに 入 れる () 受 精 卵 の 選 別 採 取 した 卵 塊 は 付 着 糸 を 除 去 して 1 粒 ずつに 分 離 する たとえば シャーレに 適 量 の 飼 育 水 と 一 緒 にガーゼを 敷 き その 上 に 卵 塊 を 置 いて 指 先 で 転 がすようにすることで 付 着 参 --1

24 糸 を 除 去 することができる 付 着 糸 を 除 去 した 卵 について 実 体 顕 微 鏡 下 で 観 察 して 未 受 精 卵 ( 外 見 的 に 透 明 感 がない 囲 卵 腔 が 形 成 されていない または 細 胞 分 裂 がみ られない 状 態 のもの)を 除 去 する また 受 精 卵 のうち 形 状 が 歪 んでいる 卵 膜 や 卵 黄 に 白 濁 部 がみられる 卵 黄 が 小 さい 囲 卵 腔 が 狭 い などの 異 常 が 認 められるも のも 除 去 する このとき 混 入 している 糞 なども 除 去 する 選 別 後 受 精 卵 の 入 ったシャーレの 飼 育 水 を 試 験 に 用 いる 試 験 用 水 で 置 換 する 試 験 用 水 の 水 温 は 試 験 温 度 (±1 )に 調 整 しておく また 受 精 卵 の 選 別 作 業 中 の 水 温 変 化 を 防 ぐために 室 温 ( 実 験 室 )を 試 験 温 度 付 近 に 調 整 しておくことが 望 ましい 参 --1

25 ニセネコゼミジンコを 用 いるミジンコ 繁 殖 試 験 法.1 試 験 の 概 要 本 試 験 は ふ 化 後 時 間 以 内 のミジンコを 排 水 ( 以 下 試 料 )に 日 前 後 ( 最 大 日 間 ) ばく 露 し ばく 露 中 の 死 亡 および 産 まれた 仔 虫 の 数 ( 産 仔 数 )を 調 べ 対 照 区 と 比 較 するこ とにより ミジンコの 繁 殖 に 対 する 試 料 の 影 響 ( 慢 性 毒 性 )を 明 らかにすることを 目 的 とす る 本 試 験 法 は カナダ 環 境 省 (Environment Canada)の 試 験 法 Test of Reproduction and Survival Using the Cladoceran Ceriodaphnia dubia (1) 米 国 環 境 保 護 庁 (U.S. EPA)の 試 験 法 Ceriodaphnia -day survival and reproduction test () および 米 国 試 験 材 料 協 会 (ASTM)のガイドライン () を 参 考 に 策 定 したものであり 本 試 験 の 実 施 にあたっては 本 試 験 法 のほかに これらの 既 存 の 試 験 法 ガイドラインなども 参 考 になる. 試 験 生 物..1 生 物 種 ニセネコゼミジンコ(Ceriodaphnia dubia)を 用 いる ニセネコゼミジンコは 成 体 で 体 長 0.~1.0 mm 仔 虫 で 体 長 0.1 mm 程 度 の 小 型 のミジンコであり 寿 命 は 週 間 程 度 と OECD テストガイドラインなどで 推 奨 されるオオミジンコ(Daphnia magna)より 短 い(オ オミジンコの 寿 命 は 0 日 以 上 ) 本 種 は 現 在 世 界 各 国 の 大 学 や 研 究 機 関 ( 国 立 環 境 研 究 所 等 ) 等 から 入 手 できるが 適 切 な 方 法 で 維 持 継 代 されている 系 統 を 入 手 する 入 手 した 生 物 は 試 験 を 実 施 する 施 設 で 馴 化 し 再 現 性 のある 試 験 結 果 が 得 られることを 確 認 しておく.. 飼 育 方 法 試 験 に 用 いる 少 なくとも 週 間 前 から 試 験 用 水 (. に 後 述 ) 中 で 試 験 条 件 と 同 じ 環 境 下 において 飼 育 する 飼 育 方 法 には マスカルチャー( 集 団 飼 育 )とシングルカルチャー( 個 別 飼 育 )がある マスカルチャーでは 適 当 数 のミジンコを 1 個 体 /1 ml 程 度 の 密 度 となるように 飼 育 する 試 験 用 水 を 適 度 に 換 水 し 仔 虫 を 除 去 する 生 後 1 週 間 以 上 飼 育 し 成 熟 した 個 体 から 産 まれた 雌 仔 虫 を 毎 週 継 代 し 一 定 数 のマスカルチャーを 維 持 する 多 くの 死 亡 個 体 や 体 色 などの 異 常 がみられる 個 体 休 眠 卵 やオスが 観 察 された または 1 回 目 の 産 仔 までの 期 間 遅 延 など 異 常 が 生 じたマスカルチャーは 継 代 やシングルカルチャーの 作 製 には 使 用 しな い シングルカルチャーは マスカルチャーで 生 後 1 週 間 以 上 飼 育 した 個 体 から 産 まれたメ ス 仔 虫 を 用 いて 開 始 する シングルカルチャーでは 1 mlの 試 験 用 水 を 満 たした 容 器 で 1 個 体 ずつ 飼 育 を 行 い 飼 育 開 始 から 約 日 間 の 産 仔 数 を 記 録 する マスカルチャーと 同 様 に 異 常 が 観 察 されない 個 体 から 産 まれた 仔 虫 を 用 いて 継 代 するが.. に 後 述 する 条 件 を 満 たした 成 熟 個 体 の 仔 虫 を 継 代 に 用 いることが 望 ましい 一 連 のシングルカルチャー(た とえば 同 じマスカルチャーから 作 製 した 0~0 個 体 )に 識 別 番 号 を 付 ける 飼 育 中 は 供 試 個 体 の 条 件 (.. 参 照 )を 満 たすよう 適 当 量 の YCT および 単 細 胞 緑 藻 類 を 毎 日 与 える YCT(Yeast Cerophyll Trout Chow)は Environment Canadaまたは U.S. EPAの 試 験 法 (1)() の 手 順 に 準 拠 して 作 製 されたものを 用 いる また 単 細 胞 緑 藻 類 は クロ 参 --0

26 レラ(Chlorella vulgari)を 用 いるが 感 受 性 や 産 仔 数 に 影 響 がなければムレミカヅキモ (Pseudokirchneriella subcapitata)を 用 いてもよい 1 日 当 たりの 給 餌 量 は たとえばシング ルカルチャーにおいては ミジンコ 1 個 体 当 たり YCT を 0 µl 藻 類 濃 縮 液 を 有 機 炭 素 換 算 量 で mgc を 目 安 とする.. 供 試 個 体 の 準 備 試 験 を 開 始 するために 以 下 の 条 件 を 満 たした 個 体 を 十 分 数 含 む 一 連 のシングルカルチ ャーを 準 備 しておくことが 望 ましい 試 験 前 日 間 の 平 均 死 亡 率 が 0%を 超 えないこと 試 験 に 用 いる 腹 目 以 降 の 産 仔 数 が 1 親 個 体 あたり 個 体 以 上 であること 試 験 前 日 間 の 腹 分 の 合 計 産 仔 数 の 平 均 値 が 1 個 体 以 上 であること 休 眠 卵 が 観 察 されないこと 試 験 開 始 日 に 容 器 内 に 産 出 された 仔 虫 を 肉 眼 または 実 体 顕 微 鏡 下 で 観 察 する 試 験 に は 外 見 的 に 異 常 が 認 められない 生 後 時 間 以 内 のメス 仔 虫 を 供 する なお 供 試 する 仔 虫 の 生 後 の 経 過 時 間 のばらつきは 1 時 間 以 内 にすることが 望 ましいが ニセネコゼミジン コでは 産 仔 のタイミングをコントロールすることは 困 難 であるため 仔 虫 の 大 きさを 目 視 で 確 認 し 大 きさをそろえることで 対 応 する なお 試 験 に 用 いた 親 個 体 の 由 来 がわか るように 識 別 番 号 作 製 日 を 記 録 しておく. 試 験 用 水 試 験 用 水 は 水 道 水 または 地 下 水 を 活 性 炭 ろ 過 した 水 M 培 地 ( 硬 度 は 約 0 mg CaCO /L) を 希 釈 した 水 U.S. EPA の 試 験 法 () などに 準 じて 調 製 した 人 工 調 製 水 や 市 販 のミネラルウォ ーターなどが 適 当 である 硬 度 は 0~0 mg CaCO /Lが 望 ましい たとえば U.S. EPA 推 奨 の 人 工 調 製 水 (Moderately hard water)の 硬 度 は 0~0 mg CaCO /L 国 立 環 境 研 究 所 で 使 用 している 試 験 用 水 の 硬 度 は 0~0 mg CaCO /L 程 度 である 試 験 用 水 は 水 温 を ±1 に 調 整 し 溶 存 酸 素 量 が 飽 和 濃 度 の 0~0%になるようにする エアレーションしてから 試 験 に 用 いる なお エアレーション 後 に 過 飽 和 にならないよう 注 意 する 試 験 用 水 の phは.~.が 望 ましいが この 範 囲 を 外 れる 場 合 には 水 酸 化 ナトリ ウム(NaOH) 水 溶 液 または 塩 酸 (HCl)で 調 整 する. 試 験 容 器 装 置 および 器 具 試 験 容 器 : 容 量 0 ml 程 度 のガラス 製 容 器 ( 水 分 蒸 発 や 揮 発 成 分 の 周 囲 への 影 響 を 防 ぐために 透 光 性 のあるふたなどで 容 器 を 覆 うなどの 工 夫 をする ) 恒 温 装 置 : 温 度 照 明 条 件 ( 照 明 の 種 類 明 暗 周 期 )を 一 定 に 維 持 できる 装 置 (インキ ュベーター ウォーターバスなど)または 部 屋 観 察 装 置 : 実 体 顕 微 鏡 水 質 測 定 装 置 : 水 温 計 溶 存 酸 素 計 ph 計 など 器 具 類 :メスシリンダー ガラスパスツール ガラスピペット( 先 端 の 口 径 を ~ mm 参 --1

27 に 広 げ バーナーなどで 焼 き 丸 めたもの) ガラス 容 器 (ビーカーまたは 試 薬 瓶 ) 分 注 器 など( 器 具 類 の 材 質 は 適 切 なものを 選 択 する ). 試 験 方 法 および 条 件..1 試 料 の 前 処 理 試 料 は 第 部. 項 に 示 した 前 処 理 を 除 いて できるだけ 前 処 理 せずに 試 験 に 供 するこ とが 望 ましい.. 試 験 溶 液 の 調 製 試 験 溶 液 は 試 験 濃 度 ごとに 適 当 量 の 試 料 を 試 験 用 水 と 混 合 ( 試 料 を 試 験 用 水 で 希 釈 ) して 調 製 する なお 試 験 濃 度 ( 試 験 溶 液 中 の 試 料 の 濃 度 )は 無 希 釈 の 試 料 を 0%とす る 対 照 区 の 試 験 溶 液 には 試 験 用 水 を 用 いる 試 験 濃 度 は 希 釈 倍 率 を 公 比 とする 濃 度 区 を 基 本 とする および % の 濃 度 区 を 標 準 とするが 過 去 に 実 施 した 試 験 の 結 果 などから 最 大 無 影 響 濃 度 が 含 ま れるように 濃 度 区 を 増 減 することも 検 討 してよい 試 験 溶 液 の 調 製 では 試 料 濃 度 ごとに 清 浄 なガラス 容 器 (ビーカーまたは 試 薬 瓶 )を 用 意 し メスシリンダーなどを 用 いて 試 料 必 要 量 を 分 取 し 同 じく 必 要 量 の 試 験 用 水 と 混 合 して 所 定 濃 度 に 希 釈 する 調 製 した 試 験 溶 液 の 水 温 は 恒 温 装 置 内 に 静 置 またはウォーターバスに 水 浴 させるなど して 試 験 温 度 に 調 整 する.. 試 験 条 件 ばく 露 方 式 : 半 止 水 式 ( 少 なくとも 週 回 または 日 ごとに 換 水 ) ばく 露 期 間 : 最 長 日 間 ( 対 照 区 で 0% 以 上 の 個 体 が 腹 以 上 産 仔 するまで) 繰 り 返 し 数 : 容 器 / 濃 度 区 供 試 生 物 数 : 個 体 / 濃 度 区 (1 個 体 / 容 器 ) 試 験 溶 液 量 :1 ml/ 容 器 試 験 温 度 :±1 硬 度 :0~0 mg CaCO /Lが 望 ましい 照 明 : 室 内 光 で 明 期 1 時 間 暗 期 時 間 餌 : 適 量 の YCTおよび 単 細 胞 緑 藻 類 を 毎 日 与 える 給 餌 量 は 1 日 1 個 体 当 たり YCT を 0 µl 藻 類 濃 縮 液 を 有 機 炭 素 換 算 量 で mgcを 目 安 とする.. 試 験 操 作 (1) ばく 露 開 始 時 の 操 作 あらかじめ 調 製 した 各 試 験 溶 液 の 水 温 を 測 定 し 試 験 温 度 の 範 囲 を 外 れている 場 合 は 再 度 恒 温 装 置 内 に 静 置 などして 水 温 を 調 整 する 各 試 験 容 器 に 調 製 した 試 験 溶 液 を 分 注 する( 各 1 ml).. の 条 件 を 満 たした 一 連 のシングルカルチャーから 仔 虫 数 が 試 験 区 数 ( 濃 度 区 の 場 合 対 照 区 を 含 めて 試 験 区 数 は となる ) 以 上 いる 容 器 を 繰 り 返 し 数 ( 通 常 ) 分 用 参 --

28 意 する ガラスピペットなどを 用 いて 同 じ 親 個 体 から 産 まれた 同 一 腹 仔 の 仔 虫 を 1 個 体 ずつ 対 照 区 と 各 濃 度 区 の 試 験 容 器 に 移 し 入 れる 同 様 に 各 容 器 から 繰 り 返 し 分 の 試 験 容 器 ( 通 常 残 り )に 仔 虫 を 投 入 する この 時 点 をばく 露 開 始 とする () ばく 露 期 間 中 の 操 作 毎 日 試 験 容 器 ごとに 供 試 個 体 ( 親 個 体 )の 生 死 の 観 察 および 産 まれた 仔 虫 の 計 数 を 行 う 産 まれた 仔 虫 のうち 計 数 時 に 死 亡 していた 個 体 は 産 仔 数 に 含 めない 容 器 内 の 仔 虫 は 計 数 時 にガラスピペットなどを 用 いて 除 去 する このとき 何 腹 目 の 産 仔 かを 記 録 す ることが 望 ましい 同 一 記 録 日 において 腹 分 の 仔 虫 が 混 在 している 場 合 仔 虫 の 大 きさ を 観 察 することにより 腹 目 の 区 別 をするとよい 換 水 は 供 試 個 体 の 生 死 の 観 察 後 供 試 個 体 を 新 しく 用 意 した 試 験 容 器 に 移 すことで 行 う 仔 虫 の 計 数 は 換 水 前 後 のどちらで 行 ってもよい () ばく 露 終 了 時 の 操 作 毎 日 の 上 記 操 作 の 終 了 後 対 照 区 における 産 仔 数 を 集 計 し(..1 参 照 ) 0% 以 上 の 供 試 個 体 ( 対 照 区 を 繰 り 返 し 数 で 実 施 した 場 合 は 個 体 以 上 )で 腹 以 上 の 産 仔 が 確 認 さ れた 日 をもって 試 験 を 終 了 する ただし ばく 露 期 間 は 最 長 日 間 とする.. 水 質 の 測 定 すべての 試 験 濃 度 区 および 対 照 区 について ばく 露 開 始 時 ばく 露 期 間 中 の 換 水 前 後 ばく 露 終 了 時 の 試 験 溶 液 の 水 温 phおよび 溶 存 酸 素 を 測 定 し 記 録 する 換 水 後 の 試 験 溶 液 の 測 定 は 各 繰 り 返 し 容 器 ( 通 常 )より 分 取 し 混 合 したものを 用 いてよい なお 換 水 前 の 試 験 溶 液 とは 新 調 した 試 験 溶 液 換 水 後 の 試 験 溶 液 とは 換 水 時 に 除 去 した 試 験 溶 液 を 指 す 塩 分 の 測 定 は 換 水 前 の 試 験 溶 液 について 1 回 以 上 行 うことが 望 ましい.. 試 験 の 有 効 性 本 試 験 は 以 下 の 条 件 を 満 たさなければならない 対 照 区 における 親 個 体 の 死 亡 率 が 0% 以 下 であること 対 照 区 における 供 試 個 体 の 0% 以 上 が 最 大 日 間 で 腹 分 の 産 仔 をすること 対 照 区 における 腹 分 の 合 計 産 仔 数 が 平 均 して 1 個 体 以 上 であること 対 照 区 において 休 眠 卵 の 生 産 が 確 認 されないこと. 結 果 の 算 出 方 法..1 産 仔 数 の 集 計 対 照 区 における 供 試 個 体 の 0% 以 上 が 仔 虫 を 腹 産 んだ 時 点 において 濃 度 区 において も 腹 分 の 産 仔 数 を 容 器 ごとに 集 計 し 各 濃 度 区 で 平 均 値 を 算 出 する 集 計 に 当 たっては 以 下 の 点 に 留 意 する 原 則 1 日 の 産 仔 数 が 個 体 以 上 の 場 合 に 1 腹 とみなす ただし 初 産 の 場 合 や ば く 露 の 影 響 が 認 められる 場 合 は 1 個 体 でも 1 腹 とみなす 産 仔 途 中 の 換 水 操 作 などにより 1 腹 分 の 産 仔 が 日 間 に 分 かれて 観 察 された 場 合 は 1 日 の 産 仔 数 が 個 体 以 上 でも 日 分 をまとめて 1 腹 とみなす(たとえば 時 間 齢 以 上 とみられるサイズの 仔 虫 が 数 個 体 観 察 され 前 日 にも 産 仔 があった 場 合 前 日 の 参 --

29 産 仔 と 同 一 腹 仔 とみなす) 供 試 個 体 が 死 亡 した 場 合 それまでの 産 仔 数 ( 産 仔 開 始 前 の 場 合 は 0とする)を 集 計 に 含 める ただし 死 亡 原 因 が 試 験 操 作 上 の 問 題 など 試 料 に 起 因 しないことが 明 確 な 場 合 は 集 計 から 除 外 する.. 供 試 個 体 の 半 数 致 死 濃 度 (LC0) 供 試 個 体 の 死 亡 率 について 試 験 最 高 濃 度 区 での 死 亡 率 が 0% 以 上 であった 場 合 には 可 能 であれば 供 試 個 体 の 半 数 致 死 濃 度 (LC 0 )を 推 定 する( 詳 細 は 第 部 を 参 照 のこと).. 最 大 無 影 響 濃 度 (NOEC) 産 仔 数 について 対 照 区 と 比 較 して 統 計 学 的 に 有 意 な 低 下 が 認 められた 最 も 低 い 試 験 濃 度 を 最 小 影 響 濃 度 (LOEC) その 一 つ 下 の 試 験 濃 度 を 最 大 無 影 響 濃 度 (NOEC)とする(た だし LOECより 高 濃 度 では LOECと 同 等 以 上 の 影 響 がみられること) すべての 試 験 濃 度 において 対 照 区 と 有 意 差 が 認 められなかった 場 合 は 最 も 高 い 試 験 濃 度 を NOECとする なお 統 計 学 的 手 法 では 対 照 区 と 各 試 験 濃 度 間 の 有 意 差 を 適 切 に 検 出 できない 場 合 は 非 線 形 回 帰 モデルなどを 用 いて 推 定 した ECx/ICx(x% 影 響 / 阻 害 濃 度 )を 算 出 してもよい (1)()() ( 詳 細 は 第 部 を 参 照 のこと). 参 考 文 献 (1) Environment Canada (00), Biological Test Method: Test of Reproduction and Survival Using the Cladoceran Ceriodaphnia dubia, EPS1/RM/1, Second Edition () U.S. EPA (00), WET Test Method 0.0, Daphnid, Ceriodaphnia dubia,survival and reproduction test, Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and receiving waters to freshwater organisms, Fourth edition, pp.-1. () ASTM (1), Proposed new standard guide for conducting three brood, renewal toxicity tests with Ceriodaphnia dubia, American Society for Testing and Materials, Committee E-, Draft no., p. Philadelphia PA () European Commission (00), Technical guidance document on risk assessment. Part II, Institute for Health and Consumer Protection, European Chemicals Bureau., EUR 01 EN/. 参 --

30 淡 水 藻 類 を 用 いる 生 長 阻 害 試 験 法.1 試 験 の 概 要 本 試 験 は 指 数 増 殖 期 の 藻 類 を 排 水 ( 以 下 試 料 )に 添 加 して 時 間 ばく 露 し ばく 露 中 およびばく 露 終 了 時 に 生 物 量 ( 細 胞 濃 度 )を 調 べ 対 照 区 と 比 較 することにより 藻 類 の 生 長 に 対 する 試 料 の 影 響 を 明 らかにすることを 目 的 とする なお 本 試 験 において 生 長 とは ばく 露 期 間 中 の 生 物 量 の 増 加 を 言 う 本 試 験 法 は 00 年 に 改 訂 された OECD テストガイドライン 01 Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test (1) および 化 学 物 質 審 査 規 制 法 の 藻 類 試 験 法 () を 基 本 に 国 際 標 準 化 機 構 (ISO) 規 格 Water quality Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae () および 米 国 環 境 保 護 庁 (U.S. EPA)の 試 験 法 Green alga, Selenastrum capricornutum, growth test () ならびに Algal Toxicity, Tier I and II () も 参 考 に 策 定 したものであ る 本 試 験 の 実 施 にあたっては 本 試 験 法 のほかに これらの 既 存 の 試 験 法 ガイドラインな ども 参 考 になる. 試 験 生 物 ムレミカヅキモ(Pseudokirchneriella subcapitata( 旧 Selenastrum capricornutum Printz))が 推 奨 される ムレミカヅキモ 以 外 の 藻 類 (Desmodesmus subspicatusなど)を 用 いる 場 合 は ば く 露 期 間 中 指 数 増 殖 期 が 維 持 されることが 確 認 されていなければならない 継 代 方 法 など について 既 存 の 試 験 法 ガイドラインやガイダンスドキュメントなど (1), ()-() を 参 考 にすること 適 切 な 方 法 で 維 持 継 代 されている 系 統 を 入 手 する 入 手 した 生 物 は 試 験 を 実 施 する 施 設 で 馴 化 し 再 現 性 のある 試 験 結 果 が 得 られることを 確 認 しておく ムレミカヅキモは OECDテストガイドラインなどの 既 存 試 験 法 で 最 も 広 く 用 いられている 単 細 胞 緑 藻 類 であり 系 統 保 存 されている 本 種 は 国 内 の 研 究 機 関 では 国 立 環 境 研 究 所 で 入 手 できる. 培 養 方 法..1 培 地 OECDテストガイドライン 01に 示 された OECD 培 地 (1) が 推 奨 されるが U.S. EPAのAAP 培 地 や C 培 地 など ()() と 同 程 度 の 培 地 を 使 用 することもできる なお OECD 培 地 の 組 成 な らびに 調 製 時 の 留 意 点 などは 以 下 のとおりである 塩 化 アンモニウム (NH Cl) 1 mg/l 塩 化 マグネシウム 六 水 和 物 (MgCl H O) 1 mg/l 塩 化 カルシウム 二 水 和 物 (CaCl H O) 1 mg/l 硫 酸 マグネシウム 七 水 和 物 (MgSO H O) 1 mg/l リン 酸 二 水 素 カリウム (KH PO ) 1. mg/l 塩 化 鉄 (Ⅲ) 六 水 和 物 (FeCl H O) 0.0 mg/l エチレンジアミン 四 酢 酸 二 ナトリウム 二 水 和 物 (Na EDTA H O) 0.1 mg/l ホウ 酸 (H BO ) 0.1 mg/l 塩 化 マンガン 四 水 和 物 (MnCl H O) 0.1 mg/l 塩 化 亜 鉛 (ZnCl ) 0.00 mg/l 塩 化 コバルト 六 水 和 物 (CoCl H O) mg/l 参 --

31 塩 化 銅 二 水 和 物 (CuCl H O) mg/l モリブデン 酸 二 ナトリウム 二 水 和 物 (Na MoO H O) 0.00 mg/l 炭 酸 水 素 ナトリウム (NaHCO ) 0 mg/l これらをイオン 交 換 水 などに 直 接 もしくは 濃 厚 保 存 液 として 必 要 量 添 加 する 大 気 と 平 衡 状 態 であれば phは.1となる phが.1 にならない 場 合 は 通 気 や 撹 拌 などを 行 う(pH の 調 整 は 行 わない) 調 製 した 培 地 の 滅 菌 は 孔 径 0.μm 程 度 のフィルターによるろ 過 滅 菌 もしくはオートクレーブにより 行 う.. 前 培 養 供 試 に 適 した 指 数 増 殖 期 の 藻 類 細 胞 を 得 るため 試 験 を 開 始 する 前 に 生 物 を 試 験 と 同 じ 条 件 で ~ 日 間 前 培 養 する 前 培 養 液 に 接 種 する 藻 類 の 生 物 量 を 調 整 し ばく 露 開 始 時 に 指 数 増 殖 期 になるようにする 前 培 養 において 形 態 の 異 常 な 細 胞 が 出 現 した 場 合 は それらを 試 験 に 使 用 しない なお 指 数 増 殖 に 達 するまでの 前 培 養 の 期 間 や 添 加 する 生 物 量 などは 前 培 養 中 の 温 度 や 光 強 度 培 地 の 容 量 などにも 依 存 するため あらかじめ 前 培 養 に 使 用 する 培 養 装 置 や 条 件 で 生 長 曲 線 を 描 き 初 期 添 加 生 物 量 と 指 数 増 殖 期 間 の 関 係 最 終 増 殖 量 などを 調 べておくとよい 以 下 に 前 培 養 の 例 と 指 数 増 殖 期 の 目 安 を 示 す 0 mlの 三 角 フラスコに 0 mlの 試 験 培 地 を 入 れる 滅 菌 したピペットを 用 いて 生 物 量 が 約,000 cells/ml となるように 供 試 藻 類 を 無 菌 的 に 接 種 する この 際 加 える 藻 類 懸 濁 液 は ml 以 内 とする 温 度 ± 照 度 約 0~ μmol/m /s に 調 整 した 培 養 器 内 などで 連 続 光 下 で 振 とう 培 養 する 毎 日 培 養 液 を 分 取 して 生 物 量 を 計 数 し 生 物 量 が 0.~1 cells/ml に 達 した 時 点 で 本 試 験 に 供 する. 試 験 容 器 装 置 および 器 具 試 験 容 器 : 原 則 として 容 量 0~00 mlのガラス 製 三 角 フラスコ( 通 気 性 のあるシリコ ン 栓 などを 装 着 ) 培 養 装 置 : 温 度 照 明 条 件 を 一 定 に 維 持 できる 装 置 または 部 屋 振 とう 器 生 物 量 計 測 装 置 : 粒 子 計 数 装 置 粒 子 分 布 解 析 装 置 顕 微 鏡 ( 血 球 計 算 盤 を 使 用 ) 蛍 光 光 度 計 分 光 光 度 計 比 色 計 など 観 察 装 置 : 光 学 顕 微 鏡 (0~00 倍 での 観 察 が 可 能 なもの) 水 質 測 定 装 置 : 温 度 計 ph 計 光 量 子 計 など 器 具 類 :メスシリンダー メスピペット メンブレンフィルターユニットなど( 器 具 類 の 材 質 は 適 切 なものを 選 択 する ) なお 試 験 容 器 は 使 用 前 に 滅 菌 しておく また その 他 の 器 具 類 についても 必 要 に 応 じて 適 切 な 方 法 で 滅 菌 しておく 参 --

32 試 験 方 法 および 条 件..1 試 料 の 前 処 理 試 料 は 第 部. 項 に 示 した 前 処 理 を 除 いて できる 限 り 前 処 理 せずに 試 験 に 供 するこ とが 望 ましいが 藻 類 生 長 阻 害 試 験 では 試 料 中 の 浮 遊 物 質 や 他 の 藻 類 等 による 試 験 結 果 へ の 影 響 を 除 外 するため フィルター(0.~0.µm)を 用 いたろ 過 滅 菌 が 認 められる (なお 試 料 中 の 懸 濁 物 が 多 い 場 合 には ろ 過 滅 菌 前 に 孔 径 0. μmのガラス 繊 維 ろ 紙 を 用 いてろ 過 してもよい)( 第 部. 参 照 ).. 試 験 溶 液 の 調 製 1. に 従 い 試 験 溶 液 は 試 験 濃 度 ごとに 適 当 量 の 試 料 を..1 に 示 す 培 地 と 混 合 ( 試 料 を 培 地 で 希 釈 )して 調 製 する なお 試 験 濃 度 ( 試 験 溶 液 中 の 試 料 の 濃 度 )は 無 希 釈 の 試 料 を 0%とする 対 照 区 の 試 験 溶 液 には 培 地 を 用 いる 試 験 濃 度 は 希 釈 倍 率 を 公 比 とする 濃 度 区 を 基 本 とする および % の 濃 度 区 を 標 準 とするが 過 去 に 実 施 した 試 験 の 結 果 などから 最 大 無 影 響 濃 度 が 含 ま れるように 濃 度 区 を 増 減 することも 検 討 してよい また 対 照 区 を 含 む 各 試 験 区 の 培 地 濃 度 を 統 一 して 試 験 しても 良 い その 場 合 は 試 料 をイオン 交 換 水 など( 培 地 の 調 製 に 用 いた 水 )で 所 定 濃 度 になるように 希 釈 し そこに 培 地 の 0% 濃 度 相 当 になるように 培 地 中 の 栄 養 塩 を 添 加 する 試 験 溶 液 の 調 製 では 試 料 濃 度 ごとに 清 浄 なガラス 容 器 (ビーカーまたは 試 薬 瓶 )を 用 意 し メスシリンダーなどを 用 いて 試 料 必 要 量 を 分 取 し 同 じく 必 要 量 の 試 験 用 水 と 混 合 して 所 定 濃 度 に 希 釈 する 調 製 した 試 験 溶 液 は 孔 径 0. μmのメンブレンフィルターで ろ 過 滅 菌 してから 滅 菌 された 試 験 容 器 に 分 注 する あるいは 試 料 を 孔 径 0.μmのメン ブレンフィルターでろ 過 滅 菌 してから 同 様 にろ 過 滅 菌 した 培 地 で 希 釈 して 各 試 験 濃 度 区 の 試 験 溶 液 を 調 製 してもよい 試 験 容 器 に 分 注 後 培 養 装 置 内 (または 恒 温 器 や 恒 温 室 内 )で 静 置 して 液 温 を 試 験 温 度 ±1 に 調 整 する.. 試 験 条 件 ばく 露 方 式 : 止 水 式 原 則 として 振 とう 培 養 (0rpm) ばく 露 期 間 : 時 間 繰 り 返 し 数 : 容 器 / 濃 度 区 容 器 / 対 照 区 初 期 生 物 量 : cells/mlが 推 奨 される 試 験 溶 液 量 : 原 則 として 0 ml/ 容 器 試 験 温 度 :1~ の 範 囲 内 で 設 定 し 培 養 装 置 内 および 試 験 期 間 中 の 変 動 は± 以 内 とする 照 明 : 白 色 または 昼 光 色 の 蛍 光 灯 光 時 間 明 期 試 験 容 器 内 の 液 面 付 近 の 光 強 度 と して 0~l0μmol/m /s.. 試 験 操 作 前 培 養 した 供 試 藻 類 の 生 物 量 を 測 定 し 試 験 溶 液 中 の 初 期 生 物 量 が cells/mlとなる 参 --

33 ように 前 培 養 液 ( 藻 類 懸 濁 液 )の 所 定 量 を 温 度 が 試 験 温 度 ±1 に 調 整 された 各 試 験 容 器 の 試 験 溶 液 に 添 加 する 各 試 験 容 器 を 培 養 装 置 内 に 置 き ばく 露 を 開 始 する なお 藻 類 の 接 種 は 無 菌 室 やクリーンベンチ 内 などの 無 菌 的 条 件 下 で 行 うことが 望 ましい ばく 露 開 始 から および 時 間 後 (ばく 露 終 了 時 )に 各 試 験 容 器 より 試 験 溶 液 を 適 量 採 取 し 粒 子 計 数 装 置 などを 用 いて 生 物 量 を 測 定 する 試 験 終 了 時 には 光 学 顕 微 鏡 下 で 細 胞 の 形 態 などを 観 察 し 異 常 の 有 無 を 記 録 する また ばく 露 開 始 時 および 終 了 時 に 各 試 験 区 の 試 験 溶 液 の phを 測 定 する なお 培 養 装 置 内 の 温 度 および 光 強 度 を 少 なく ともばく 露 開 始 時 および 終 了 時 に 測 定 することが 望 ましい.. 水 質 の 測 定 すべての 試 験 濃 度 区 および 対 照 区 について ばく 露 開 始 時 およびばく 露 終 了 時 に 試 験 液 の ph を 測 定 し 記 録 する 対 照 区 の ph は 1. 以 上 変 動 してはならない 各 濃 度 区 の 測 定 は 各 繰 り 返 し 容 器 ( 通 常 )より 分 取 し 混 合 したものを 用 いてよい.. 試 験 の 有 効 性 本 試 験 は 以 下 の 条 件 を 満 たさなければならない 対 照 区 の 生 物 量 がばく 露 期 間 中 に 少 なくとも 1 倍 増 加 すること 対 照 区 の 毎 日 の 生 長 速 度 の 変 動 係 数 ( 平 均 値 )がばく 露 期 間 を 通 じて %を 超 えない こと 対 照 区 の 繰 り 返 し 間 の 生 長 速 度 の 変 動 係 数 が %を 超 えないこと. 結 果 の 算 出 方 法..1 生 長 速 度 の 算 出 対 照 区 および 各 濃 度 区 について ばく 露 開 始 時 およびばく 露 中 に 測 定 した 細 胞 濃 度 に 基 づいて 次 式 より 生 長 速 度 (μ)を 算 出 する..~.. では 通 常 ばく 露 開 始 時 からばく 露 終 了 時 ( 時 間 後 )までのばく 露 期 間 を 通 じた 生 長 速 度 を 用 いる μ i-j =(lnn j ln N i )/ (t j - t i ) ここで μ i-j : t i 時 から t j 時 までの 期 間 の 生 長 速 度 通 常 日 当 たり(d -1 )で 示 す N i : t i 時 の 生 物 量 (cells/ml) ばく 露 開 始 時 (t 0 )の 生 物 量 については 設 定 値 ( cells/ml)を 用 いる N j : t j 時 の 生 物 量 (cells/ml) t i : ばく 露 開 始 後 i 回 目 に 細 胞 濃 度 を 測 定 した 時 間 (d) t j : ばく 露 開 始 後 j 回 目 に 細 胞 濃 度 を 測 定 した 時 間 (d) 対 照 区 については 1 日 毎 の 生 長 速 度 を 容 器 ごとに 算 出 し その 変 動 係 数 がばく 露 期 間 を 通 じて %を 超 えないことを 確 認 する.. 生 長 阻 害 率 の 算 出 各 濃 度 区 各 容 器 について 対 照 区 の 生 長 速 度 の 平 均 値 (μ c )と 各 濃 度 区 の 生 長 速 度 (μ t )に 基 参 --