NGSハンズオン講習会

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1 版 配 布 するUSBメモリ 中 のhogeフォルダを デスクトップにコピーしておいてください NGSハンズオン 講 習 会 Bioconductorの 利 用 法 東 京 大 学 大 学 院 農 学 生 命 科 学 研 究 科 アグリバイオインフォマティクス 教 育 研 究 プログラム 門 田 幸 二 (かどた こうじ) Rが 導 く 未 来 は 明 るいのだ ろうか

2 Contents( 全 体 ) 7 月 22 日 ( 水 ):84 83 名 Bio-Linux 8とRのインストール 状 況 確 認 基 本 自 習 ( 門 田 寺 田 先 生 ) 7 月 23 日 ( 木 ):92 90 名 Linux 基 礎 LinuxコマンドなどUNIXの 基 礎 の 理 解 ( 門 田 ) 7 月 24 日 ( 金 ):85 83 名 スクリプト 言 語 シェルスクリプト(アメリエフ 株 式 会 社 服 部 恵 美 先 生 ) 7 月 27 日 ( 月 ):93 9 名 スクリプト 言 語 Perl(アメリエフ 服 部 先 生 ) 7 月 28 日 ( 火 ):9 90 名 スクリプト 言 語 Python(アメリエフ 服 部 先 生 ) 7 月 29 日 ( 水 ):94 88 名 データ 解 析 環 境 R( 門 田 ) R 基 礎 ( 初 級 ):R 言 語 の 基 礎 (インストールから 利 用 まで) R 基 礎 2( 初 級 ):ファイルの 読 み 込 み 行 列 演 算 の 基 本 R 各 種 パッケージ( 中 級 ):パッケージのインストール 法 と 代 表 的 なパッケージの 利 用 法 7 月 30 日 ( 木 ):96 9 名 データ 解 析 環 境 R( 門 田 ) Bioconductorの 利 用 法 ( 中 級 ):データの 型 やバージョンの 違 い Bioconductorの 利 用 法 2( 中 級 ):FASTA/FASTQファイルの 各 種 解 析 8 月 3 日 ( 月 ):89 84 名 NGS 解 析 基 礎 (アメリエフ 山 口 昌 雄 先 生 ) 8 月 4 日 ( 火 ):85 80 名 NGS 解 析 ゲノムReseq 変 異 解 析 (アメリエフ 山 口 先 生 ) 8 月 5 日 ( 水 ):86 8 名 NGS 解 析 RNA-seq 統 計 解 析 ( 前 半 : 山 口 先 生 後 半 : 門 田 ) 8 月 6 日 ( 木 ):04 98 名 NGS 解 析 ChIP-seq( 理 研 森 岡 勝 樹 先 生 ) 2

3 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 3

4 パッケージ R 起 動 直 後 に? 関 数 名 と 打 ち 込 んで も 使 用 法 を 記 したウェブページが 開 かずにエラーが 出 ることがあります 4

5 パッケージ 参 考??alphabetFrequency と 打 ち 込 むよう に 勧 められているので 打 ってみる 検 索 結 果 のウェブページが 表 示 されるので 2それっぽい 関 数 名 のところをクリック 2 5

6 パッケージ 参 考 alphabetfrequency 関 数 はBiostringsというパッケー ジから 提 供 されているものだと 読 み 解 く?? 関 数 名 は 関 数 名 は 既 知 だがどのパッケージから 提 供 されているものかを 知 りたい 場 合 などに 利 用 する 6

7 パッケージ multi-fastaファイルを 読 み 込 んで 様 々な 解 析 ができるのは Biostringsや2seqinrなど の 塩 基 配 列 解 析 用 パッケージのおかげです 2 2 7

8 パッケージ Biostringsというパッケージをlibrary 関 数 を 用 いて 読 み 込 むことによって alphabetfrequencyのような Biostringsが 提 供 する 関 数 群 を 利 用 できるのです ここ では 意 図 的 に library(biostrings) を2 回 実 行 して 2 回 目 は 何 も 表 示 されないということを 思 い 出 させていま す 実 際 には 回 のみで 大 丈 夫 です?alp まで 打 って からTabキーを 押 すなどして タブ 補 完 テクを 有 効 利 用 8

9 R 本 体 とパッケージの 関 係 R 本 体 と パッケージ の 関 係 は パソコン と ソフト Microsoft EXCEL と アドイン Cytoscape と プラグイン のようなものという 理 解 でよい パソコンを 購 入 しただけの 状 態 では できることが 限 られています 通 常 は Officeやウイルス 撃 退 ソフトなどをインストールして 利 用 します Linuxをインストールしただけの 状 態 では できることが 限 られています 通 常 は マッピングなど 各 種 プログラムをインストールして 利 用 します R 本 体 をインストールしただけの 状 態 では できることが 限 られています NGS 解 析 を 行 う 各 種 パッケージ(またはライブラリ)をインストールして 利 用 します 9

10 CRANとBioconductor R 上 で 利 用 可 能 なパッケージの2 大 リポジトリ( 貯 蔵 庫 ) CRAN (The Comprehensive R Archive Network):6,878パッケージ Bioconductor:,024パッケージ 205 年 7 月 22 日 現 在 CRAN 提 供 パッケージは 生 命 科 学 を 含 む 様 々な 分 野 で 利 用 される NGS 解 析 は 主 にBioconductor 提 供 パッケージを 利 用 0

11 定 期 的 にバージョンアップ 近 年 のリリース 頻 度 R 本 体 ( にver. 3.2.をリリース にver をリリース にver. 3..3をリリース にver. 3..2をリリース にver をリリース Bioconductor ( 半 年 ごとにリリース にver. 3.をリリース (R ver. 3.2.で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 :, にver. 3.0をリリース (R ver. 3..で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.4をリリース (R ver. 3..0で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.3をリリース (R ver. 3.0で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.2をリリース (R ver. 3.0で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.をリリース (R ver. 2.5.で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.0をリリース (R ver で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 :553 バグの 修 正 や 新 たな 機 能 がどんど ん 追 加 されている 最 新 版 の 利 用 を お 勧 め 毎 年 5 月 と 月 ごろにバー ジョンアップするとよいだろう

12 Bioconductor Bioconductorに 関 する 総 説 (Review) ゲノム 配 列 やアノテーションパッケージもBioconductorか ら 提 供 されており それらに 関 する 言 及 もあり 2

13 パッケージのインストール 必 要 最 小 限 プラスアルファ の 推 奨 インストール 手 順 を 行 えば (Rで) 塩 基 配 列 解 析 で 利 用 する 多 くのパッ ケージがインストールされます 3

14 パッケージのインストール これらはCRANから 提 供 されているものたち 4

15 パッケージのインストール ゲノム 情 報 のパッケージ 群 (BSgenome )はBioconductorから 提 供 さ れています ここでは 計 6パッケージをイン ストールしています 2 例 えば 赤 線 部 分 は マウスのmm0というバージョンのゲノム 配 列 情 報 を 含 むパッケージの 名 前 (BSgenome.Mmusculus.UCSC.mm0) に 相 当 します biocliteという 関 数 を 用 いて 該 当 パッケージをインストールしています 2 5

16 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 6

17 Bioconductor 概 観 PubMed 上 で R Bioconductor で キーワード 検 索 し 原 著 論 文 があ るパッケージのみ 探 すのも 一 つ の 戦 略 ですが 原 著 論 文 公 開 前 のパッケージも 見 つかります 2 3 7

18 Bioconductor 概 観 ネットワーク 環 境 にもよりますが 数 秒 ~ 数 分 以 内 にこのような 画 面 になります 8

19 Bioconductor 概 観 基 本 的 には 左 側 のカテゴリ 分 けのところを 眺 めますが Biostringsなど 何 を 行 うパッ ケージかがある 程 度 分 かっているものから 逆 引 きして 感 覚 をつかんでおくとよいでしょう RNA-seq など フリーワード 検 索 をやってもいいとは 思 いますが 経 験 上 あまりうまく 引 っかかって こないので 私 はやりません 9

20 Bioconductor 概 観 biostrings と 打 つとす ぐにリストアップされる 20

21 Bioconductor 概 観 BioconductorのBiostringsパッ ケージのページに 飛 びます 2

22 Bioconductor 概 観 BioconductorのBiostringsパッケージのページで ちょっと 下 のほうに 移 動 biocviewsのところで 見 えるキーワードっぽいのがさきほどのカテゴリ 分 けに 相 当 例 えば DataRepresentationをクリッ クするとカテゴリ 分 けの 階 層 関 係 がわかる 22

23 Bioconductor 概 観 DataRepresentationのカテゴリに 含 まれるのは34 パッケージであることが 分 かる 赤 枠 部 分 がそのリ スト Biostringsは 大 分 類 はSoftware 2 中 分 類 はInfrastructureとなっており その 下 の 階 層 の3 DataRepresentationに 含 まれていることがわかる

24 Bioconductor 概 観 大 分 類 のSoftware 2 中 分 類 の Infrastructureも 存 在 する Biostringsは 塩 基 配 列 の 切 り 出 しや 文 字 列 検 索 系 関 数 も 提 供 してい るので 3SequenceMatchingがあるのも 妥 当

25 Bioconductor 概 観 SequenceMatchingに 含 まれる7パッケージ の 一 部 しか 表 示 されていないが (Rで) 塩 基 配 列 解 析 中 にはない2CRISPR 関 連 のパッケー ジなども 存 在 することに 気 づく また 3ゲノム 配 列 パッケージBSgenomeもあることがわかる

26 Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージBSgenomeは 内 部 的 に Biostringsパッケージを 利 用 していることがわかる 26

27 Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージBSgenomeのちょっと 下 のほうに 移 動 Depends( 依 存 )のところに Biostringsが 存 在 することがわかる BSgenome パッケージを 利 用 したい 場 合 には 予 めこれら の 依 存 関 係 のあるパッケージ 群 のインストール が 完 了 している 必 要 がある 推 奨 手 順 通 りに パッケージのインストールをしていれば BSgenomeを 問 題 なく 利 用 できるはずである 27

28 Bioconductor 概 観 BSgenomeを 問 題 なく 利 用 できるか は library(bsgenome)が 通 るかどう かで 判 断 R Guiの 新 規 画 面 を 起 動 28

29 Bioconductor 概 観 library(bsgenome)の 実 行 結 果 中 にエ ラーメッセージが 出 ていなければOK 29

30 Bioconductor 概 観 library(xxx)をやったときに XXXパッケージ 内 部 で 利 用 するDependsやImportsにリストアップされている パッケージも 同 時 にロードしている( 読 み 込 んでいる) 30

31 Bioconductor 概 観 もう 一 度 library(bsgenome)をやってもメッ セージは 出 ません エラーメッセージが 出 て いなければ 特 に 気 にする 必 要 はありません 3

32 Bioconductor 概 観 先 にBSgenomeが 内 部 的 に 利 用 している Biostringsパッケージのロードを 行 っておくと 若 干 見 栄 えが 異 なるが エラーメッセージが 出 ていないことさえ 確 認 できれば 問 題 ない 32

33 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 33

34 BSgenome 利 用 の 意 義 ゲノム 配 列 情 報 はUCSCやEnsemblなど のウェブサイトから 取 得 するのが 一 般 的 ではあるが Rの 生 物 種 ごとに 提 供 さ れているBSgenomeで 取 得 あるいは 取 り 扱 うことも 可 能 ChIP-seq 用 パッケー ジMEDIPSはBSgenomeを 利 用 34

35 BSgenome プロモーター 配 列 取 得 ではなく ゲノム 配 列 取 得 のほうです! 35

36 BSgenome 黒 枠 部 分 のコードをコピペ R ver (Bioconductor ver. 3.0)で 利 用 可 能 な 生 物 種 のパッケージ 名 をリストアップ 7 個 あ ることが 分 かる Rのバージョンが 古 いと パッケージ 数 は 少 なくなる 例 えばR ver (Bioconductor ver. 3.)では77 個 36

37 BSgenome 赤 枠 のヒトゲノムは4バージョン(hg7, 8, 9, GRCh38)を 利 用 可 能 203 年 2 月 にリリースされ た 最 新 版 (GRCh38)のRパッケージも 利 用 可 能 37

38 BSgenome 黒 枠 部 分 のコードをコピペ 0 秒 程 度 かかる 実 際 にインストール 済 みのものは(このPC 環 境 では)7 パッケージであることがわかる 講 習 会 ではヒトゲ ノムの 最 新 版 (BSgenome.Hsapiens.NCBI.GRCh38) を 使 いますが これが 入 ってない 場 合 は 2 各 自 installed.genomes()で 見 られる 他 のパッケージに 置 き 換 えて 実 行 してください 2 38

39 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 39

40 BSgenome 例 題 年 2 月 にリリースされたヒトゲノム 最 新 版 (GRCh38)のRパッケージを 入 力 multi- FASTAファイルを 出 力 として 得 る 作 業 ディレクト リはどこでもよいが 基 本 はデスクトップ 上 のhoge 数 分 かかるが 約 3.3GBのファイルが 生 成 される 決 してテキストエディタで 開 かないで! 40

41 BSgenome 出 力 ファイルの 内 容 は fastaオブジェクトに 格 納 されている 慣 れれば2fastaオブジェクト の 中 身 を 眺 めるほうが 全 体 像 をつかみやすい 2 4

42 BSgenome ~22 番 染 色 体 のみ 取 扱 いたい 場 合 染 色 体 番 号 の 数 が 大 きくなるほど 配 列 長 が 短 くなっている 傾 向 が 一 目 瞭 然 ですね 42

43 BSgenome X, Y, およびミトコンドリア 配 列 も 含 めたい 場 合 2 配 列 の 並 びの 確 認 は 試 行 錯 誤 最 初 からわかっていたわけではあ りません R 画 面 上 で 眺 めるほうが 全 体 像 を 把 握 しやすい 2 43

44 BSgenome X, Y, およびミトコンドリア 配 列 までのサブセットを hoge0.fastaで 保 存 したい 場 合 上 矢 印 キーを 何 回 か 押 して ファイルに 保 存 するためのコマンド を 出 し 2と3の 水 色 下 線 部 分 を 変 更 すればよい

45 BSgenome 2と3をこんな 感 じで 変 更 実 行 後 にhoge9.fastaよりも 若 干 ファイルサイズの 小 さいhoge0.fastaが 生 成 されていること が 確 認 できるはず 決 してテキストエディタで 開 かないで!

46 BSgenome 参 考 例 題 0 2 様 々な 記 述 形 式 があります やらなく ていいです 決 してテキストエディタで 開 かないで! 2 46

47 BSgenome 例 題 9 26 番 目 以 降 の 配 列 は ヒトゲノムの 一 部 ではある ものの まだ 割 り 当 てられる 染 色 体 が 定 まっていないもの たちです メタゲノム 解 析 などでヒトゲノムにマップされない リードのみ 取 扱 いたい 場 合 には 利 用 可 能 な 全 配 列 をマッ ピング 時 のリファレンスとして 用 いるのが 自 然 だと 思 います 47

48 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 48

49 プロモーター 配 列 取 得 ゲノム 配 列 と2アノテーション 情 報 があれば 任 意 の 領 域 の 配 列 を 取 り 出 すことができます 2 49

50 プロモーター 配 列 取 得 例 題 作 業 ディレクトリはどこでもよいが 基 本 はデスクトップ 上 のhoge 転 写 開 始 点 上 流 000 塩 基 を 取 得 したい 場 合 width 列 は 配 列 長 に 相 当 出 力 ファイルを 見 なくてもうまくいっているだろうと 思 える 50

51 プロモーター 配 列 取 得 例 題 3 線 虫 はBSgenomeとTxDbの 両 方 が 提 供 されています 予 め2つのパッケージを 個 別 にインストールしておけば 上 流 500~ 下 流 20 塩 基 の 範 囲 の 配 列 を 取 得 できる 5

52 Tips: sessioninfo 2 自 分 の 解 析 環 境 を 知 る エラーが 出 てどうにも ならない 場 合 は sessioninfo() 実 行 結 果 をメー ル 添 付 か 本 文 中 に 記 載 して 助 けを 求 める 見 る 側 は 2R 本 体 のバージョン(この 場 合 3.2.0) や パッケージが 読 み 込 まれているか あるい はパッケージのバージョンをチェックする 52

53 Tips: sessioninfo これは うまくプロモーター 配 列 を 取 得 できたとき のR 環 境 例 題 のヒト(H. sapiens)プロモーター 配 列 を 取 得 したときと 2 例 題 3の 線 虫 (C. elegans)プロモーター 配 列 を 取 得 したときに 読 み 込 んだパッケージが 表 示 されているのがわかる 2 53

54 パッケージのインストール 必 要 最 小 限 プラスアルファ の 推 奨 インストール 手 順 通 りにインストール したヒトの 多 くはうまくいっている

55 全 体 像 空 白 部 分 は 後 に 埋 まっていきます リポジトリ(パッ R 本 体 パッケージ 名 ケージ 提 供 元 ) R ver R ver Bioconductor TxDb.Celegans.UCSC.ce6.ensGene 3..2 Bioconductor BSgenome.Celegans.UCSC.ce6.4.0 CRAN XML CRAN RCurl CRAN checkmate - 55

56 R ver. 3..3でこけた 例 題 3を 門 田 のR ver. 3..3でやった 結 果 2XMLおよび3RCurlパッケージ がないためにエラー 祭 りとなった( 爆 )

57 XMLのインストール XMLパッケージのインストール XML 自 体 は CRANから 提 供 されているが CRANパッケージ 用 のinstall.packages 関 数 ではなく Bioconductor 用 のbiocLite 関 数 でもCRANパッケージのXMLを インストール 可 能 であるというTipsを 兼 ねて 紹 介 57

58 RCurlのインストール RCurlパッケージのインストール RCurlもCRANから 提 供 されているが bioclite 関 数 でインストール 可 能 58

59 RCurlのインストール RCurlパッケージのインストール RCurlもCRANから 提 供 されているが bioclite 関 数 でインストール 可 能 59

60 R ver. 3..3で 再 挑 戦 意 気 揚 々と 再 度 例 題 3をコピペ しかし 今 度 はcheckmateというパッケージがな いからダメだと 言 われていることがわかる 60

61 checkmateのインストール checkmateパッケージのインストール checkmateもcranから 提 供 されている が bioclite 関 数 でインストール 可 能 6

62 R ver. 3..3で 再 々 挑 戦 意 気 揚 々と 再 度 例 題 3をコピペ 無 事 パッケージのロードに 成 功!! 62

63 この 程 度 は ただの 復 習 ですw 63

64 sessioninfo (R 3..3) 2 R ver. 3..3での ロードされているパッ ケージ 群 のバージョン 情 報 に 注 目! 64

65 sessioninfo (R 3..3) 特 に~3のパッケージは 4205 年 7 月 24 日 にインストールしたばかり であり 前 述 のR ver 実 行 結 果 よ りも 後 にインストールしたものである

66 全 体 像 ほぼ 埋 まった リポジトリ(パッ R 本 体 パッケージ 名 ケージ 提 供 元 ) R ver R ver Bioconductor TxDb.Celegans.UCSC.ce6.ensGene Bioconductor BSgenome.Celegans.UCSC.ce CRAN XML CRAN RCurl CRAN checkmate

67 sessioninfo (R 3.2.0) 2 BSgenomeパッケージはver..4.0で 同 じ しかし TxDbパッケージは ver (R ver )とver (R ver. 3..3)で 異 なっていることがわかる 67

68 sessioninfo (R 3.2.0) XML および2RCurlのバージョン checkmateパッケージは 存 在 の 有 無 は 不 明 であるが 少 なくともロードされておらず R ver では 必 要 とされていないようだ 2 68

69 全 体 像 を 把 握 赤 枠 がごく 最 近 (205 年 7 月 24 日 )インストールした CRAN 提 供 パッケージたち バージョン 番 号 がR ver のものに 比 べて 大 きいので 確 かに 最 新 版 なのだろう リポジトリ(パッ R 本 体 パッケージ 名 ケージ 提 供 元 ) R ver R ver Bioconductor TxDb.Celegans.UCSC.ce6.ensGene Bioconductor BSgenome.Celegans.UCSC.ce CRAN XML CRAN RCurl CRAN checkmate

70 全 体 像 を 把 握 これらの 結 果 から 2つの 結 論 が 導 き 出 される CRAN 提 供 パッケージは R 本 体 のバージョンに 関 係 なく 常 に 最 新 版 がインストールされる 2R 本 体 の バージョンが 上 がると 必 要 とされないパッケージが 出 ることもある(checkmate) リポジトリ(パッ R 本 体 パッケージ 名 ケージ 提 供 元 ) R ver R ver Bioconductor TxDb.Celegans.UCSC.ce6.ensGene Bioconductor BSgenome.Celegans.UCSC.ce CRAN XML CRAN RCurl CRAN checkmate

71 R ver. 3..3で 再 挑 戦 ここで もう 一 度 R ver. 3..3で 再 挑 戦 し たときのエラーメッセージを 読 み 返 す 黒 枠 は BSgenome.Celegans.UCSC.ce6 パッケージのロード 部 分 7

72 R ver. 3..3で 再 挑 戦 文 脈 から 以 下 のように 理 解 する BSgenome.Celegans.UCSC.ce6は 内 部 的 にrtracklayerを 利 用 しているため rtracklayerもロードしようとしている しかし 2rtracklayerは 内 部 的 にcheckmateを 利 用 している このためcheckmateもロードし ようとしたが ckeckmateが 未 インストール のためこけた というのが 事 の 顛 末 2 72

73 依 存 関 係 を 含 めると 複 雑 rtracklayer ver..28.3ではcheckmate パッケージを 内 部 的 に 使 わなくなったのだろう と 理 解 する たとえBsgenomeとTxDbのバージョ ンがR 本 体 の 間 で 不 変 であったとしても 内 部 的 に 用 いるパッケージのバージョンや それに 起 因 する 実 行 結 果 の 違 いもありうる リポジトリ(パッ R 本 体 パッケージ 名 ケージ 提 供 元 ) R ver R ver Bioconductor TxDb.Celegans.UCSC.ce6.ensGene CRAN RCurl Bioconductor BSgenome.Celegans.UCSC.ce Bioconductor rtracklayer CRAN XML CRAN checkmate

74 現 実 的 な 対 策 私 は 少 しの 結 果 の 違 いは( 突 き 詰 めていっても 不 毛 な ので) 気 にしない 論 文 中 に 記 載 するのはR 本 体 と 主 要 なパッケージ(この 場 合 BSgenomeとTxDb)のみが 基 本 リポジトリ(パッ R 本 体 パッケージ 名 ケージ 提 供 元 ) R ver R ver Bioconductor TxDb.Celegans.UCSC.ce6.ensGene CRAN RCurl Bioconductor BSgenome.Celegans.UCSC.ce Bioconductor rtracklayer CRAN XML CRAN checkmate

75 R 本 体 のバージョンは 重 要 近 年 のリリース 頻 度 R 本 体 ( にver. 3.2.をリリース にver をリリース にver. 3..3をリリース にver. 3..2をリリース にver をリリース Bioconductor ( 半 年 ごとにリリース にver. 3.をリリース (R ver. 3.2.で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 :, にver. 3.0をリリース (R ver. 3..で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.4をリリース (R ver. 3..0で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.3をリリース (R ver. 3.0で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.2をリリース (R ver. 3.0で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.をリリース (R ver. 2.5.で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.0をリリース (R ver で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 :553 R 本 体 のバージョンがわかれば Bioconductor 提 供 パッケージのバ ージョンも 概 ね 定 まる 例 えば R ver. 3..2では どのタイミングで( 例 えば205 年 8 月 に)パッケージのイン ストールを 行 おうが Bioconductor ver. 3.0で 提 供 されているパッケージ のバージョンとなる 決 して205 年 4 月 に 公 開 されたBioconductor ver. 3.で 提 供 されているパッケージがイ ンストールされることはない 75

76 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 76

77 プロモーター 配 列 取 得 multi-fasta 形 式 のゲノム 配 列 ファイ ルとGFF3 形 式 などの 一 般 的 なアノテー ションファイルがあれば それを 利 用 す ることもできる 2 例 題 7の 乳 酸 菌 のプ ロモーター 配 列 取 得 を 示 します 2 77

78 プロモーター 配 列 取 得 205 年 3 月 5-6 日 のHPCIハンズオン 講 習 会 時 のスライド( )です こ のときはR ver. 3..2でうまくいった 78

79 プロモーター 配 列 取 得 当 時 (205 年 3 月 ; R ver. 3..2)は GFF3 形 式 のアノテーションファイル 読 み 込 み 時 にmakeTranscriptDbFromGFF 関 数 および2useGenesAsTranscriptsオプ ション(デフォルトはF)を 利 用 していた 2 79

80 プロモーター 配 列 取 得 205 年 7 月 3 日 にR ver で 黒 枠 部 分 をコピペすると 警 告 メッセージが 出 た 2 80

81 プロモーター 配 列 取 得 警 告 メッセージの 中 身 maketranscriptdbfromgff 関 数 は 削 除 予 定 だ maketxdbfromgff 関 数 を 使 用 せよ 2useGenesAsTranscriptsオ プションを 与 えても 無 視 するし このオ プション 自 体 も 削 除 予 定 だよ といった 具 合 R ver では 今 のところ3で 示 すようにうまく 読 み 込 めてはいる 2 3 8

82 プロモーター 配 列 取 得 205 年 7 月 25 日 現 在 3R ver. 3..2で 正 常 動 作 したコードを(#の コメントアウトで) 残 しつつ 4R ver で 動 作 確 認 済 みのコード がデフォルトとなるようにしている

83 R ver で 実 行 maketranscriptdbfromgff 関 数 やuseGenesAsTranscriptsオプショ ンを 使 っていないので それ 系 の 警 告 は 出 ていないことがわかる 83

84 R ver. 3..2で 実 行 R ver. 3..2( 正 確 にはGenomicFeatures ver..8.7) 当 時 は まだmakeTxDbFromGFF 関 数 が 実 装 されていないので maketxdbfromgff 関 数 を 見 つけることができないのは 当 たり 前 84

85 R ver. 3..3で 実 行 R ver. 3..3( 正 確 にはGenomicFeatures ver..8.7) 当 時 は まだmakeTxDbFromGFF 関 数 が 実 装 されていないので maketxdbfromgff 関 数 を 見 つけることができないのは 当 たり 前 85

86 定 期 的 にバージョンアップ 近 年 のリリース 頻 度 R 本 体 ( にver. 3.2.をリリース にver をリリース にver. 3..3をリリース にver. 3..2をリリース にver をリリース Bioconductor ( 半 年 ごとにリリース にver. 3.をリリース (R ver. 3.2.で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 :, にver. 3.0をリリース (R ver. 3..で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.4をリリース (R ver. 3..0で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.3をリリース (R ver. 3.0で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.2をリリース (R ver. 3.0で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.をリリース (R ver. 2.5.で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 : にver. 2.0をリリース (R ver で 動 作 確 認 ) 提 供 パッケージ 数 :553 バグの 修 正 や 新 たな 機 能 がどんど ん 追 加 されている 最 新 版 の 利 用 を お 勧 め 推 奨 の 毎 年 5 月 と 月 ごろ にバージョンアップをちゃんとやった ヒトは R ver 以 上 なはず 86

87 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 87

88 データの 型 簡 単 にいうと 型 = 見 た 目 です 例 えば maketxdbfromgff 関 数 は (GFF3 形 式 の)アノテーション ファイルを 読 み 込 んだものを2TxDbという 形 式 のオブジェク トとして 格 納 しています 重 要 なのは 細 かい 中 身 の 理 解 で はなく ちゃんと 読 み 込 めているっぽいことを 確 認 すること 88

89 データの 型? 関 数 名 で 見 られるhtmlマニュ アル 中 に 型 に 関 する 記 載 あり 89

90 データの 型 これはGenomicFeaturesパッケージが 提 供 している 関 数 2GFF3 形 式 以 外 にGTF 形 式 も 読 み 込 めるようだ 3 GTF 形 式 ファイルの 場 合 はformat= gtf と 書 けばよさそう

91 データの 型 htmlマニュアルの 下 部 に 移 動 maketxdbfromgff 関 数 実 行 結 果 として 得 られるものはTxDbという 形 式 の オブジェクト 2もちろんR 上 でアノテーション 情 報 を 格 納 する 形 式 はTxDbだけではなく GRangesという 形 式 も 存 在 する GRanges TxDbへの 型 変 換 は maketxdbfromgranges 関 数 で 可 能 であることがわか る アノテーション 情 報 源 は 3UCSCや4BioMartが 有 名 だが そこからうまく 情 報 を 抽 出 してTxDbオブジェ クトを 得 るための 関 数 も 存 在 することが 分 かる こんな 感 じで 関 数 の 知 識 や 利 用 の 幅 を 広 げていく

92 参 考 library(help=パッケージ 名 ) 指 定 したパッケージ 中 で 利 用 可 能 な 関 数 を 概 観 できます 2 下 の ほうに 移 動 すると 3など(Rで) 塩 基 配 列 解 析 で 紹 介 していない 様 々な 関 数 があることがわかります

93 参 考 パッケージ 概 観 2Bioconductor (ver. 3.) 上 での GenomicFeaturesのトップページ 3ダウ ンロード 数 はトップ5%であることがわかる

94 パッケージ 概 観 参 考 少 し 下 のほうに 移 動 原 著 論 文 はきっちり 引 用 2パッケー ジのインストール 法 3パッケージのドキュメント(マニュアル ではない)をローカル 環 境 で 開 く 方 法 4 具 体 的 なやり 方 4 の 中 身 は5と 同 じだが ネットワークかローカルかの 違 いが ある 6 利 用 可 能 な 関 数 マニュアルはここでも 見 られる

95 目 的 をおさらい 乳 酸 菌 L. casei 2A 株 のゲノム 配 列 とアノテーション ファイルを 読 み 込 んで 全 遺 伝 子 の 上 流 500 塩 基 および 下 流 20 塩 基 分 の 塩 基 配 列 を 抽 出 してプロ モーター 解 析 (するための 入 力 データを 取 得 )したい! 黒 枠 までで 行 ったことは アノテーションファイルを 読 み 込 んでtxdbオブジェクトに 格 納 したところまで 95

96 残 りのコードを 概 説 TxDbオブジェクト(オブジェクト 名 txdb)を 出 発 点 として 欲 しい 領 域 ( 上 流 500 塩 基 下 流 20 塩 基 ) 情 報 を 取 得 2ゲノム 配 列 情 報 FaFile(in_f) と 欲 しい 領 域 情 報 hogeを 入 力 として 塩 基 配 列 を 取 得 3FASTA 形 式 ファイルで 保 存 このあた りは H26 年 度 受 講 生 追 跡 調 査 の 配 列 情 報 を 使 った 次 の 解 析 へのinput fileの 加 工 が 難 関 だ と 感 じでいる に 対 する 回 答 特 にプロモーター 解 析 などは で その 入 力 ファイルをどうやっ て 作 るの? かが 実 務 担 当 者 の 直 面 する 課 題

97 データの 型 2 黒 枠 部 分 は 感 覚 的 にpromotersという 関 数 を 用 いて 転 写 開 始 点 上 流 と 下 流 の 範 囲 を 取 得 した 結 果 をhogeに 格 納 してるんだろうな くらいは 分 かりますよね そしてなぜ2のところでtxdbを 使 っていな いのか?という 素 朴 な 疑 問 があるでしょう 理 由 はpromoters 関 数 が 入 力 としてTxDbオブジェクトを 想 定 していないからです(おそらく 204 年 0 月 リリースのBioconductor ver. 3.0までは 正 解 ) 205 年 4 月 リリースのBioconductor ver. 3.では GenomicFeaturesパッ ケージから 提 供 されているpromoters 関 数 はTxDbに 対 応 済 み 97

98 データの 型?promoters 門 田 のR ver 環 境 では promotersという 同 じ 名 前 の 関 数 が3つのパッケージ(IRanges, GenomicFeatures, and GenomicRanges)から 提 供 されていることがわかる 2 GenomicRangesパッケージから 提 供 されているpromoters 関 数 は 入 力 としてTxDbオブジェクトを 受 け 付 けないことがわかる しかし 3GenomicFeaturesパッケージから 提 供 されているpromoters 関 数 は TxDbを 入 力 としていることが205 年 7 月 26 日 に 判 明 ( 爆 )

99 データの 型 3GenomicFeaturesパッケージから 提 供 さ れているpromoters 関 数 は 4TxDbを 入 力 としていることが205 年 7 月 26 日 に 判 明 ( 爆 )

100 プロモーター 配 列 取 得 2 例 題 8に 3TxDbオブジェクトを 入 力 とし てpromoters 関 数 を 実 行 するコードを 追 加 つ 上 の 行 は 過 去 の 遺 物 (legacy)として 残 して いるだけ (Rで) 塩 基 配 列 解 析 自 体 がデカ すぎて もはや 全 体 の 動 作 確 認 もままならな いし 修 正 変 更 もしきれていないのが 現 状

101 遺 言 R 本 体 とパッケージのバージョンアップを 毎 年 5 月 と 月 に 行 うべし 依 存 関 係 など 様 々な 問 題 はあるものの 落 ち 着 いて 必 要 なパッケージを 個 別 にインストールしていけば 大 丈 夫 第 一 義 的 に 重 要 なのは Linuxでプログラムのインストールができることと 同 様 library(xxx)の 部 分 でこけないようにすること 2 0

102 遺 言 2 R 最 新 版 でうまくいったなら 過 去 版 のエラー 原 因 究 明 は 時 間 の 無 駄! R ver. 3..2のときはmakeTranscriptDbFromGFF 関 数 でうまくいくはずだが エラー が 出 る 現 象 に 遭 遇 した( のアグリバイオ 大 学 院 講 義 ) しかし 2R ver. 3.2.でmakeTxDbFromGFF 関 数 で 正 常 動 作 することがわかり その 時 点 で 思 考 停 止 2 02

103 遺 言 3 得 られた 結 果 を 無 条 件 に 受 け 入 れるな! 様 々な 角 度 で 検 証 せよ 実 はプログラムのバグで GFF3 形 式 ファイルの 読 み 込 みに 失 敗 していただけ みたいなオチもよくあるだろう フリーソフトの 利 用 は 自 己 責 任 である 03

104 Rを 用 いた 検 証 例 txdbオブジェクトの 元 データは の GFF3ファイル 2 乳 酸 菌 L. casei 2Aの 遺 伝 子 数 (= 転 写 物 数 )は 2,799 個 となっ ている これが 正 しいかを 検 証 する 2 04

105 Rを 用 いた 検 証 例 (9 列 目 の) ID=gene という 文 字 列 を 含 む 行 数 を 調 べてみるといいのでは とい う 思 想 のもので 検 証 する 05

106 Rを 用 いた 検 証 例 txdbオブジェクトの 元 データは のGFF3 ファイル 乳 酸 菌 L. casei 2Aの 遺 伝 子 数 (= 転 写 物 数 )は 2,799 個 となっている Rで 3 ID=gene を 含 む 行 数 も42,799 個 だった ので 大 丈 夫 だろうと 判 断 する

107 Linuxを 用 いた 検 証 例 Linuxをある 程 度 使 えるヒトは 普 通 grepコマ ンドを 使 います のmvコマンドは ファイ ル 名 が 長 いので hoge.gff3にrenameしてい るだけです 2の-cは 3で 指 定 した 文 字 列 と 一 致 した 行 数 を 表 示 させるオプション

108 Linuxを 用 いた 検 証 例 -vは 一 致 しないものを 表 示 するオプション -cvと 併 用 することで 一 致 しない 行 数 を 表 示 2Linuxだと 他 の 気 になるキーワードも 簡 単 に 調 査 可 能 3^をつけることで Chromosomeを 含 む 行 数 ではなく 行 頭 にChromosomeを 含 む 行 数 をカウントすることもできる

109 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 09

110 FASTQファイル 解 析 4 ファイル 形 式 の 変 換 (FASTQ FASTA)や FastQCのいくつかの 項 目 と 同 じ 解 析 をRでも 実 行 可 能 である:2Overrepresented sequences 3Per base sequence content(リードのposition ごとの 出 現 確 率 ) 4Kmer Content 3 2 0

111 FastQC 実 行 結 果 頻 出 する 配 列 をリストアップ 2トップは CCCCGGTATA という50 塩 基 の 配 列 で 4,383 回 出 現 Percentageは.4383% 全 部 で00 万 リードなので 妥 当 オリジナル07 bpのうち 最 初 の50 bpで 解 析 している 復 習 2 result_without_nogroup.html

112 ShortRead 実 行 結 果 subseqとtable 関 数 の 併 用 で 同 じ 結 果 が 得 られる 例 として 提 示 これもただの 復 習 2 2

113 FastQC 実 行 結 果 ポジションごとの 塩 基 の 出 現 確 率 FastQC (ver. 0..3)のデフォルトオプションでの 実 行 結 果 は 最 初 の0 塩 基 までは 塩 基 ごとに それ 以 降 は 適 当 に 数 塩 基 分 を 平 均 化 した 出 現 確 率 を 表 示 (していることにQuasR 実 行 結 果 と 比 較 することで 後 に 気 づいた) 2 赤 枠 部 分 に 注 目! 2 3

114 QuasR 実 行 結 果 QuasRというパッケージは Quality Control 部 分 だけで 比 較 すると FastQCの 簡 易 版 のような 位 置 づけ 2 例 題 4 実 行 結 果 のhoge4.pdfの 一 部 が 右 下 プロットで FastQCのPer base sequence contentと 同 じもの 3の 赤 枠 部 分 に 注 目! 2 3 4

115 FastQC vs. QuasR FastQCのほうの 横 軸 の 数 値 をよく 眺 める と こちらは2 塩 基 分 づつ 平 均 化 したものを プロットしているのではないかと 思 うに 至 る 5

116 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 6

117 FastQCマニュアル 2 fastqc2コマンドのマニュアルを 表 示 予 めマニュアル 全 体 を 眺 めて --nogroupオプションを 用 いれば 平 均 化 (grouping) せず 塩 基 ごとに 表 示 できることが 分 かったうえで 2 grep A 5 nogroup とパイプでつなげて 必 要 最 小 限 の 情 報 を 表 示 7

118 FastQC result_without_nogroup.html このFastQCレポートhtmlは 2FastQCをデフォ ルトオプションで 実 行 した 結 果 3 得 られたhtmlフ ァイル 名 をresult_without_nogroup.htmlに 変 更 2 3 8

119 FastQC result_without_nogroup.html 参 考 Kmer Contentの 項 目 はこんな 感 じでし た ( の 講 義 資 料 も 参 照 のこと) 9

120 FastQC FastQC (ver. 0..3)をデフォルトで 実 行 2- -nogroupオプションつきで 実 行 3 得 られたhtml ファイル 名 をresult_with_nogroup.htmlに 変 更

121 FastQC FastQCデフォルトの 結 果 2FastQC --nogroupオプシ ョンつきの 結 果 Groupingされないので 配 列 長 が 長 くな るほど どんどん 横 長 になる 3QuasRデフォルトの 結 果 result_without_nogroup.html result_with_nogroup.html 2 3 2

122 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 22

123 FastQC result_without_nogroup.html Kmer Contentの 項 目 を 比 較 違 いは--nogroup の 有 無 のみ 何 か 変 結 論 としては --nogroup をつけないときの 結 果 は( 門 田 の 感 覚 では)バグ result_with_nogroup.html 23

124 FastQC result_without_nogroup.html 開 発 者 側 の 論 理 としては デフォル ト(--nogroupオプションをつけない) だとKmer Content 解 析 結 果 も 塩 基 を groupingする という 思 想 なのかもし れない ただしこれは 実 質 的 に5 側 が 上 位 に 来 る 傾 向 となり 3 側 に 除 去 すべきアダプターやプライマー 配 列 が 存 在 していてもそれに 気 づけな い( 実 際 門 田 がこれにハマった) 24

125 様 々な 状 況 証 拠 を 収 集 リファレンス 配 列 がある 場 合 (マッピング). 診 断 :( 比 較 的 多 めのミスマッチ 数 で)マッピングを 行 い マップされたものの 中 でミ スマッチがあったポジションの 分 布 を 眺 める もし3 側 にミスマッチの 偏 りがあれ ば それはプライマー/アダプター 配 列 由 来 塩 基 という 判 断 を 下 せる 2. 対 策 : 該 当 部 分 の 塩 基 を 一 定 数 トリム 3. 検 証 :マップ 率 が 向 上 するかどうかを 調 べる リファレンス 配 列 がない 場 合 (アセンブル). 診 断 :paired-endデータの 場 合 は single-endデータとしてde novo assembleすると ある 程 度 アセンブルされる( 一 定 数 のコンティグが 得 られる) 一 方 paired-endデー タで 実 行 すると 途 端 にアセンブルされなくなる 2. 対 策 : 塩 基 づつトリムしてはアセンブル みたいなことを 繰 り 返 して 一 定 範 囲 の データを 得 る 3. 検 証 :アセンブルが 劇 的 に 改 善 されるところが 出 てくる(はず) 25

126 QuasR(トリム 前 ) 2 QuasRはマッピングもできる 乳 酸 菌 ゲノム 配 列 に マッピングした 結 果 のPDFファイルの 一 部 を 表 示 ほとんどマップされていない 00 万 リード 中 わずか0.4% ( 約 4,000リード)しかマップされていな いことがわかる この 結 果 から2の 部 分 を 疑 う 26

127 QuasR(トリム 後 ) これだけ 結 果 が 変 わります かなりイケてます 27

128 末 端 塩 基 のトリム 2 例 題 4 Rで 実 行 可 能 です 2 28

129 末 端 塩 基 のトリム トリム 前 のリード 情 報 27 塩 基 をトリムするので 3 赤 枠 部 分 をトリムした 結 果 が 返 される(はず)

130 末 端 塩 基 のトリム トリム 後 のリード 情 報 赤 枠 部 分 の 塩 基 がなくなっているのが 分 かる また 2 配 列 長 も00 bpになっていることがわかる 2 30

131 Tips: 例 外 処 理 実 用 上 は このあたりの 例 外 処 理 が 重 要 このプログラムはリードごとにトリム 後 の 配 列 長 情 報 をhogeに 予 め 格 納 している そしてトリ ム 後 の 配 列 長 がもし bp 未 満 になったら bpは 残 すような 処 理 をしている このあたりの 想 定 外 への 対 処 が いわゆる bug fix 3

132 Contents パッケージ CRANとBioconductor 推 奨 パッケージインストール 手 順 のおさらい Bioconductor 概 観 ゲノム 配 列 パッケージ(BSgenome) ヒトゲノム 情 報 パッケージの 解 析 プロモーター 配 列 取 得 (sessioninfo バージョンの 違 い) Rパッケージ(ゲノムとアノテーションパッケージの 併 用 ) FASTA 形 式 ファイルとGFF3 形 式 ファイル データの 型 FASTQファイルの 各 種 解 析 (LinuxとRを 相 補 的 に 活 用 ) Linux (FastQC)とR (ShortRead)で 同 じ:Overrepresented sequences 項 目 Linux (FastQC)とR (QuasR)で 異 なる 見 栄 え:Per base sequence content 項 目 FastQCに--nogroupというオプションがあることを 知 る FastQCのオプション (デフォルトと--nogroupあり)の 違 いによるKmer Content 項 目 の 結 果 の 違 い Rで 検 証 32

133 FastQC result_without_nogroup.html Kmer Contentの 項 目 で Obs/Exp Max やプロファイルの 図 を( 若 干 数 値 が 代 わり ますが)Rで 再 現 することができます result_with_nogroup.html 33

134 参 考 資 料 アグリバイオ 大 学 院 講 義 の 枠 組 みで FastQC マッピング アセンブル Kmer ContentのRでの 検 証 などについて 講 義 しています , , などでキーワード 検 索 2 34