HAV-RNAの検出法

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1 病原体検査マニュアル平成 18 年 8 月 A 型肝炎 - 1 -

2 目次 Ⅰ. 概説. 検査に関する一般的注意 1. 操作上の一般的注意 2. 検査材料の採取 3. 検査材料の輸送 4. 検査の判定. 検査方法 1. 血清学的診断 1)IgM 抗体の検出 2) 疫学調査 2. ウイルス分離と抗原診断 3. 遺伝子診断 3 1 RT-PCR 法 3 2 ハイブリダイゼーション法 A. マイクロプレート ハイブリダイゼーション法 B. ドット ハイブリダイゼーション法 3 3 リアルタイム PCR 法 Ⅳ. 参考文献 Ⅴ. 試料の分与依頼先 - 2 -

3 . 概説 A 型肝炎は A 型肝炎ウイルス (HAV) 感染によって引き起こされる予後良好の急性肝炎で 慢性化することはなく 治癒後に強い免疫が残される HAV は感染者の糞便中に多量に排泄され それが感染源になる 人体へは感染者との接触感染やウイルスに汚染された飲料水や食物を介して経口的に侵入し 肝へ達する 糞口感染で伝播するので 患者の発生は衛生環境に影響されやすい A 型肝炎は発展途上国では蔓延しているが 先進国では上下水道等の整備により感染者は激減している 日本の A 型肝炎の発生は食品の汚染 貝類の生食に関連し 飲食店を介した集団感染がみられる 発展途上国で感染し帰国後発症する海外感染例は 1 割を占める ますます盛んになる国際交流 発展途上国からの輸入食料品の増加等 A 型肝炎の感染予防対策は社会的に重要な問題として認識されるようになってきた 抗体保有率が非常に低下したために 施設内の集団発生や家族内感染への注意も必要である 国産の不活化ワクチンが製造認可され 1995 年から医療現場で使われている HAV はピコルナウイルス科のへパトウイルス属に所属する ウイルスの形態は被膜を持たない直径 27nm の球形粒子である ゲノムは 5' 端末に VPg 蛋白 3' 端にポリ A 鎖が結合した約 7.5kb のプラス鎖 RNA である HAV 粒子の構造と性状 ゲノムの構造と機能 粒子形成等は基本的には他のピコルナウイルスと共通であるが 成熟粒子に VP4 が検出されないこと VP1/2A 接合部が切断されないまま粒子形成が進行するなどの特性がある A 型肝炎ウイルスは発見当初 ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属に分類されていたが 塩基配列相同性が極めて低いために ヘパトウイルス属として独立した HAV の遺伝子型は 7 種類に分けられているが 血清型は 1 種類しかない HAV は培養細胞において増殖性であるが 培養細胞を用いた患者糞便検体からのウイルス分離には長期間かかる また 継代培養により培養細胞に馴化した株でも 増殖速度は他のピコルナウイルスに比較して遅く 一般的に細胞変性効果 (CPE) は示さない 生物学的に野生株は肝臓に強い親和性を持っているが ほかの肝炎ウイルス同様 ウイルスの増殖により細胞を殺すことはない 肝炎は宿主免疫反応を介して起きる HAV は酸耐性であり 熱 乾燥などにも強い エーテルなどの脂溶性物質 界面活性剤 蛋白分解酵素などに耐性であるが 高圧滅菌 UV 照射 ホルマリン処理 塩素剤処理などで失活する また 高度精製 HAV は微量の水銀イオンなどにより失活し 抗原活性も失われる 潜伏期間は 2 6 週であり 発熱 倦怠感等に続いて血清トランスアミナーゼ (ALT または GPT AST または GOT) が上昇する 食思不振 嘔吐等の消化器症状を伴うが 典型的な症例では黄疸 肝腫脹 黒色尿 灰白色便等を認める まれに劇症化し死亡する例を除き 1 2 カ月の経過の後に回復する 小児の感染は不顕性であることが多いが 感染年齢が上がるにつれ 臨床症状も肝障害の程度も強くなる 成人の感染は半数以上が黄疸になる - 3 -

4 . 検査に関する一般的注意 1. 操作上の一般的注意 A 型肝炎には不活化ワクチンが 1995 年より実用化されているので 実験従事者は事前に予防接種を済ませておくこと 患者の材料を取り扱う時にはクラス II の安全キャビネット内で行い 感染防止や病原体の拡散に注意を払うこと 2. 検査材料の採取 A 型肝炎の遺伝子検査は HAV が多量に排出される発症の 2 週前から発症後 1 週間の時期の糞便の採取が望ましい 糞便に比べ 血液中のウイルス量は少ない 換言すれば ウイルスの遺伝子検査には発症後出来るだけ早い時期に採取された検体が適している 血漿を遺伝子診断に用いる時は抗凝固剤に PCR 反応の妨げとなるヘパリンは使用してはならない EDTA かクエン酸を使用する 血清学的診断のためなら 発症後数ヶ月の患者血清から IgM 抗体の検出ができる 原因と推定される食材からウイルス遺伝子の情報が得られれば感染源や感染経路の解明に非常に貴重なものとなるが A 型肝炎は潜伏期が平均 1 ヶ月と長いので 一般的に原因食材は調査時には存在しないことが多い 3. 検査材料の輸送 HAV は比較的外界の環境に抵抗性であるが 保管 輸送中の凍結融解は繰り返さないように留意する 輸送にあたっては冷却を保たれる状態で包装し 被験者の氏名 年齢 発病日 検体採取日 最近の海外渡航歴 ワクチン歴 被験者の周囲の発生状況など必要事項を記入のうえ送付する 送付先には予め検体数 搬入日を連絡しておくこと 4. 検査の判定以下のいずれかの方法によって血清学的診断や病原体診断がなされたもの 血清抗体の検出例 HAV 特異的 IgM 抗体が陽性のもの 病原体の遺伝子の検出例 RT-PCR 法による HAV 遺伝子の検出 - 4 -

5 . 検査方法 1. 血清学的診断 1) IgM 抗体の検出一般の検査では A 型肝炎の診断は血中の IgM 型 HAV 抗体を検出する方法がとられている IgM 型抗体は発症から約 1 カ月後にピークに達し 3 6 カ月後には陰性となる 重症例ほど IgM 型抗体価は高く 発症 6 カ月以降にも検出される例がある また 治癒が遷延化する例では IgM 型抗体持続期間も長い 検査診断目的には体外診断薬用の市販キットが普及している 操作および判定は各キットの取り扱い説明書にしたがって行う 2) 疫学調査 IgG 型と IgA 型抗体の測定は 特殊な血清疫学調査以外使われていない IgA 型抗体は感染後 1 2 年間 IgG 型抗体はさらに長期間持続するので 一般的な血清疫学調査 γ- グロブリン (ISG ) やワクチン接種対象者の選択などには 全クラスの HAV 抗体を測定する競合抑制 ELISA 等が用いられる なお 検出される HAV 抗体はウイルス粒子と結合する防御抗体であり 過去の感染またはワクチン免疫を意味する 2. ウイルス分離と抗原診断培養細胞によるウイルス分離には長期間が必要なため 診断目的には適さない 興味のある研究者は文献 ( 戸塚敦子 ウイルス実験プロトコール 1995) を参照されたい 発症ごく初期の患者糞便中には ELISA で測定可能な量 (1ml 当たり 10 8 粒子以上 ) の HAV が含まれることもあるが 感度が低いので抗原診断法も一般的な検査法ではない 3. 遺伝子診断微量の HAVRNA の検出が可能である RT-PCR 法が 多くの研究室に普及している PCR 産物の確認はハイブリダイゼーション法か塩基配列を解析する VP1-2A 領域を標的にした RT-PCR 法で増幅した産物の遺伝子解析を行えば 感染経路の推定などに役立つ 5 非翻訳領域を標的にしたリアルタイム PCR 法も検査に使われている - 5 -

6 -3 1 RT-PCR 法 < 操作上の一般的注意 > PCR を行う際には手袋をし チューブの蓋を開ける時にはその前に軽く遠心した後 オープナーを用いること また RT-PCR 反応液の調製をする部屋と PCR 産物の電気泳動の部屋を分ける それができない時にはそれぞれのクリーンベンチで行う クリーンベンチで行う際にファンは止めて行う コンタミ防止と RNase の混入の防止に細心の注意を払うこと 1) 器具サーマルサイクラー 超遠心器 ホモジナイザーあるいはストマッカー ヘラ メス ハサミ ピンセット マイクロ冷却遠心器 (12,000rpm) Vortex 電気泳動装置 UV 照射写真撮影装置 マイクロピペット ( μ l) チューブ (0.5ml 0.2ml 1.5ml) 15ml および 50ml 遠心管 濾紙 2) 試薬核酸フリー精製水 EDTA 2NA( エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム ) 電気泳動用アガロース ME( 岩井科学 250g 入り Cat. No R) エチジュウムブロマイド Random primer hexamer (Amersham Pharmacia,Cat ) Super Script Ⅱ(GibcoBRL, Cat. No ) 100mM DTT ( Super Script Ⅱ に添付 ) QIA Viral RNA Mini Kit (Qiagen Cat.No.52904) DNaseⅠ(Takara,Cat. No.2 215A) Ribonuclease Inhibitor (Takara, Cat. 2310A) Takara EX Taq (Takara Cat. No. No.RR001A) 50 倍濃度 TAE buffer [Tris 242g 氷酢酸 57.1ml 0.5M EDTA 2NA (ph8.0) 100ml を蒸留水で 1,000 ml とする ] Ethanol ショ糖 ポリエチレングリコール 6000 NaCl KCl リン酸水素二ナトリウム リン酸二水素カリウム 3) 材料の前処理血清 血漿はそのまま RNA の抽出に使用できる 糞便は 10% 乳剤をつくり RNA 抽出材料とする 貝類等の食材も 10% 乳剤が RNA 抽出の出発材料である 糞便抽出液の作成 115 ml または 50 ml の遠心チューブに糞便の 9 倍量の PBS と 1 倍量のクロロフォルムをいれておく 2 糞便を遠心チューブにいれ 10% 糞便懸濁液を作る 3 20 分激しく攪拌する rpm で 20 分遠心する 5 上静を新しいチューブに移し 10% 糞便乳剤とする - 6 -

7 食品の処理本項では食品として最も重要視されている貝類の方法について記す 他の食品においても基本的にはこの方法に準じて行える 超遠心器のローターとの関係もあるが 貝の中腸腺が 1g あるいはそれ以上の時は 1 個または 2 個を 1 件として行い 1 ロットに付き 3 検体から 10 検体 ( 中腸腺として合計 12g から 24g 程度を目途とする ) を行う シジミ アサリ等の中腸腺が 1g 以下の貝では中腸線 1g から 1.5g を 1 件検体として 3 検体から 5 検体の検査を行う 3 通りの方法を述べる (1) 超遠心法 1 殻付き貝類はヘラ メス等で貝柱を切り 殻を開く 2 貝の外套膜を取り 次いで中腸腺の周りに付いている脂質部分をメス ハサミ等で可能な限り取り除き 中腸腺を取り出す 中腸腺を摘出する際にはできる限り周りの白い組織 ( 脂肪 ) を取り除くこと 特にリアルタイム PCR を行うときには完全に取り除くこと 3 ホモジナイザーまたはサンプリングバッグに中腸腺をいれ 次いで 10 倍量 PBS(-) を加え粉砕する 貝類の乳剤は 20% 以上の濃度にしないこと 20% 以上にすると回収率が悪くなる 4 粉砕した試料を遠心管に移す 10,000 rpm 20 分間冷却遠心し 上清を新しい試験管に取る 5 超遠心用遠心管に 30% ショ糖溶液を遠心管の 10% 程度入れ それに 4 の遠心上清を静かに重層させる ( ショ糖層を壊さないように初めは特に注意して少量ずつ入れる ) 35,000 rpm 180 分間あるいは 40,000 rpm 120 分間冷却遠心する 6 アスピレーター 注射器等で液層を吸引し 沈渣のみとする 7 遠心管の管壁を PBS(-) で軽く 1 回洗い 管壁の周りの水分を滅菌した濾紙で吸い取る 8 沈渣に 200μl の DDW( 滅菌後 0.22μm フィルターで濾過したもの ) を加え 浮遊させる これをウイルス RNA の抽出に用いる ( 浮遊液に不純物が多いときには 10,000 rpm 20 分間の遠心を行い その上清を RNA 抽出に用いる ) (2) ポリエチレングリコールによる濃縮法 ( 遠心器を使えない時 ) 1 超遠心法 4 の遠心上清にポリエチレングリコール 6,000 を 8% NaCl を 2.1g/100ml になるように加え 軽く撹拌し 4 の冷蔵庫に一晩置く または室温で 2 時間撹拌する 5,000~12,000 rpm. 20 分間 冷却遠心する 2 上清をアスピレーター 注射器等で吸引し 沈渣のみとし 管壁の周りの水分を濾紙 ( 滅菌したもの ) で吸い取る さらに PBS(-) で管壁を軽く 2 回洗い その後濾紙で水分を完全に取る 3 沈渣を 200μl の DDW に浮遊させる これをウイルス RNA の抽出に用いる 浮 - 7 -

8 遊液に不純物が多い場合には 10,000 rpm 20 分間の冷却遠心を行い その上清を RNA 抽出に用いる (3) 凍結法 1 超遠心法 2 の中腸腺を内容液が漏れないように取り出し それを大きめの遠心管に入れ ガラス棒等で中腸腺を潰した後 1 度凍結融解する (-40 以下で凍結させ 融解するときには 40 程度のお湯ですばやく融解する ) 2 10,000 rpm で 20 分間冷却遠心し 上層の液層を新しいチューブに取る 3 得られた液を RNA 抽出に用いる 但し 後述する QIAamp Viral RNA Mini キットによる RNA の抽出では 560μl まで それ以上の量の時には 2 つに分けて行うか PBS で 6 倍希釈した後 前項のポリエチレングリコールあるいは超遠心器による濃縮を行い 200μl の DDW に再浮遊させ それを RNA 抽出に用いる 4)RNA 抽出 QIAamp Viral RNA Mini キット (QIAGEN, Cat.No ) を使用する RNA 抽出法を述べる これはスピンカラムを使用する方法で 糞便 血清, 食材からの HAVRNA 抽出法として 簡便に利用できる このキットは RNA 抽出に Carrier RNA が含まれており RNA 抽出効率は SV Total RNA isolation system より 10 倍程度良い (1) 使用前に行う試薬の調整サンプルを室温 (15~20 ) に戻す Buffer AW1 は 96~100% エタノールを 25ml 加える Buffer AW2 は 96~100% エタノール 30ml を加える Carrier RNA( 凍結乾燥品 ) のチューブに Buffer AVL 1ml 添加し Carrier RNA を溶解させ Buffer AVL に全量を添加する 添加した Buffer AVL/Carrier RNA は室温で 2 週間 2~8 で 6 ヶ月間安定 Buffer AVL/Carrier RNA 中に沈殿物がある場合には 5 分間以内の加熱 (80 ) により溶解し 6 回以上の加熱は行わない 使用前に室温に戻す (2) 操作法以下の操作は室温で行う 1 1.5ml チューブに Buffer AVL/Carrier RNA 560μl を入れる 2 サンプル 140μl を 1 のチューブに加える (560μl まで増量することも可能である 詳細はキットの添付マニュアル参照 ) サンプルと Buffer を充分混合するため 15 秒間 Vortex にかけ 室温 (15~25 ) に 10 分間置く チューブをスピンダウンする 3 エタノール (96~100%)560μl をチューブに加え 15 秒間 Vortex をかけた後 チューブをスピンダウンする 液が混濁した時には 9,000Xg(10,000rpm)5 分間遠心する ( リアルタイム PCR を行うときにはこの遠心を行ったほうが良い ) 4 3 の液 630μl を QIAamp スピンカラム (2ml コレクションチューブの中にスピンカラムが装着されている ) に注入し 蓋を閉め 6,000Xg(8,100 rpm) 1-8 -

9 分間遠心する QIAamp スピンカラムを新しい 2ml のチューブに移し 残りの 3の液 630μl を入れ 同様に遠心し 全ての液が無くなるまで行う (RNA 抽出液が 140μl の時には 2 回で終わる ) 5 QIAamp スピンカラムを開け Buffer AW1 500μl を入れる 6 蓋を閉め 6,000Xg(8,100 rpm) 1 分間遠心する QIAamp スピンカラムを新しいコレクション 2ml のチューブに移し 濾液の入っているコレクションチューブは捨てる 7 QIAamp スピンカラムに Buffer AW2 500μl を加え 20,000Xg(14,000 rpm) で 3 分間遠心する Buffer AW2 の濾液等が接触した時には8を行う ( このような事は通常起きない ) 8 QIAamp スピンカラムを新しい 2ml のコレクションチューブに移し 濾液の入っているコレクションチューブは捨てる フルスピードで 1 分間遠心する ( 必ずしも必要でない ) 9 QIAamp スピンカラムを新しい蓋つき 1.5ml のチューブに移し 濾液の入っているコレクションチューブは捨てる QIAamp スピンカラムの蓋を開け 室温に戻した Buffer AVE 30μl を加え 蓋を閉めて 1 分間置いた後 6,000Xg(8,100 rpm) で 1 分間遠心する 10 この濾液が抽出 RNA であり RNA は-20 以下で 1 年間は安定 5) DNase 処理貝の中腸腺には様々な DNA が含まれており しばしば PCR で非特異バンドが出現するので それらを抑制するため DNase 処理を行う この時点までに DNA の混入が起きた時でも それらを消化することができる 従って キットに DNase 処理が含まれていない時にはこの操作を行うことが望ましい 注意として DNase Ⅰ を使用するマイクロピペットは専用のものを用い 可能であればオートクレイブができるものが良い 検査終了後使用した DNase の含まれている液 チューブ等は全てオートクレイブにかける 1 表 1に示したように DNase 処理混合液の調製を行う 表 1. Super Script RT Ⅱ buffer を用いる時 反応液量 15μl 系 30μl 系 Sample RNA 12.0μl 24μl 注 5X First-Strand buffer 1.5μl 3.0μl DDW 0.5μl 1.0μl DNase Ⅰ(1U/μl) 1.0μl 2.0μl 注 ) 使用する Reverse Transcriptase の buffer を用いる 2 混合液調製後 37 に 30 分間置く 3 次いで 75 に 5 分間置く 4 直ちに on ice( または 4 ) する これが DNase 処理済み抽出 RNA である - 9 -

10 6) RT 反応 { Super Script RT Ⅱ(GibcoBRL) を用いる時 } 1 表 2 の RT 反応調製液を作製する 表 2. RT 反応液調製液 ( Super Script RT Ⅱを用いる時 ) 反応液量 15μl 系 20μl 系 30μl 50μl 系 DNase 処理 RNA 7.5μl 10.0μl 15.0μl 30.0μl 5X First-Strand Buffer 2.25μl 3.0μl 4.5μl 7.0μl 10mM dntps 0.75μl 1.0μl 1.5μl 2.5μl Random Primer(1.0μg) 0.375μl 0.5μl 0.75μl 1.25μl RNAasin(33unit/μl) 0.5μl 0.67μl 1.0μl 1.67μl 100m M DTT# 0.75μl 1.0μl 1.5μl 2.5μl Super Script RTⅡ(200u/μl) 0.75μl 1.0μl 1.5μl 2.5μl DDW 2.125μl 2.83μl 4.25μl 2.58μl 注 )Random Primer の代わりに HAV では HAV-3273 プライマーを用いても良い 2 反応は 42 で 30 分から 2 時間行う ( 通常 1 時間 ) 3 次いで 99 で 5 分間加熱し on ice( または 4 ) する 7)1st PCR 11st PCR の混合液を作製する ( 表 3) 表 3. 1st PCR 混合液 1.DDW 33.75μl 2.10X Ex Taq TM buffer 5.0μl 3. dntp(2.5mm) 4.0μl 注 ) 4. HAV+2799 primer(25μm) 1.0μl 5. HAV-3273 primer(25μm) 1.0μl 6. cdna(templete) 5.0μl 7. EX Taq(5unit/μl) 0.25μl Total 50.0μl 注 ) プライマーの塩基配列は図 2 を参照 2 PCR 反応増幅は 94 3 分を 1 サイクル 94 1 分 50 1 分 72 2 分を 40 サイクル 分を 1 サイクルで行う 増幅条件はプライマー サーマルサイクラーによって異なるので それぞれ最適な条件で行うと良い 3 電気泳動 PCR 産物 8μl と 5 倍 Loading buffer 2μl を混合し 1.5% アガロースゲルを用いて泳動する 泳動 buffer は TAE を使用する 4 アガロースゲル染色泳動後ゲルをエチジュウムブロマイド染色液 (TAE 溶液 100ml にエチジュウ

11 ムブロマイド 10mg/ml のものを 10μl 加えた溶液 ) に 20 分間入れておく この時に緩やかに揺すると良い 5 写真撮影 バンドの確認染色したゲルは UV 照射で写真撮影し バンドの確認を行う 8) Nested PCR 法食品の時にはウイルス量が少ないので 1st PCR で陰性の時には Nested PCR を行う 但し Nested PCR を行う時にはコンタミが起こる危険性が有るので注意して実施する 1 Nested PCR の調製 Nested PCR の混合液 ( 表 4) を作製する Nested PCR では HAV+2907/-3162 プライマーを用いる 表 4 Nested PCRの混合液 1.DDW 36.75μl 2.10X Ex Taq TM buffer 5.0 μl 3.dNTP(2.5mM) 4.0 μl 4. HAV+2907 Primer (25μM) 1.0 μl 5. HAV-3162 Primer (25μM) 1.0 μl 6. 1st PCR 産物 2.0 μl 7. EX Taq 0.25μl Total 50.0 μl 2 PCR 反応 電気泳動増幅は 1st PCR と同様に行うが サイクル数は 35 とする Nested PCR 産物の電気泳動 UV 照射で写真撮影 バンドの確認は 1st PCR と同様に行う 9) PCR 結果の判定 1 PCR 法では RNA 抽出のコントロールとして入れた HAV の PCR で目的とするバンドが認められること 2 検査材料の代わりに DDW を入れた陰性コントロールでバンドが見られないこと ( 遺伝子の混入が無い ) 3 目的とする大きさの PCR 増幅産物であれば PCR 陽性とする HAV+2799/-3273 は 498bp HAV は 280bp である 4 PCR 陽性と判定された時には確認試験としてドットあるいはマイクロプレート ハイブリダイゼーションで確認する または遺伝子配列を決定し 既知の HAV と比較して同一のクラスターのものが存在すれば HAV として良い

12 Ⅲ-3 2 ハイブリダイゼーション法 A. マイクロプレート ハイブリダイゼーション法ここでは PCR 産物の確認試験としてのマイクロプレート ハイブリダイゼーション法について記す この方法はマイクロプレート上でハイブリダイゼーションを行うもので 洗いが簡単であり 反応は通常の酵素抗体法と同一である 42 でハイブリブリダイゼーションを行うと 80% 以上の相同性のときに陽性となる ハイブリダイゼーションの温度を上げるとさらにその感度は高まる 1) 器具恒温器 ヒートブロック 電気泳動装置 UV 照射写真撮影装置 マイクロプレートリーダー UV 防御メガネ サーマルサイクラー マイクロ冷却遠心器 (15,000rpm) ウォーターバス ヘラ ハサミ メス マイクロピペット ( μl) マイクロプレート (NUNC-IMMUNO PLATE Cat.No ) 2) 試薬 MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN Cat.No.28604) フナゲルチィップ ホルムアミド Tween20 サケ精子 DNA マクロプレートシール ペーパータオル ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ (BIOSOURCE,Cat. #SNN1004) リン酸水素二ナトリウム クエン酸 30% 過酸化水素 硫酸 T3,3,5,5 -Tetramethylbenzidine(TMB) ジメチルスルホキシド (DMSO) ウシ血清アルブミン (SIGMA,Cat No.A-2153) 3M 酢酸ナトリウム (ph5.0) 100% イソプロパノール PBST(PBS(-)+0.5%Tween20) 3) ゲルからの DNA 抽出法 (MinElute Gel Extraction Kit による PCR 産物の精製 ) マイクロ遠心機を利用する方法を示す このプロトコールは TAE buffer または TBE buffer の標準的なアガロースゲル あるいは低温融解アガロースゲルから 70bp から 4kb の DNA フラグメントを高い最終濃度で抽出 精製することができる 1 個のスピンカラムにつき 最大 400mg のアガロース処理が可能である Buffer QG は ph7.5 以下の時 黄色になる すべての遠心操作は 一般的な卓上遠心機で 10,000Xg(~13,000rpm) で行う (1) 使用前に行う試薬の調整 1 使用前に Buffer PE にエタノール (96~100%) を添加する ( 添加容量は試薬ボトルのラベルを参照 ) 2 3M 酢酸ナトリウム溶液 (ph5.0) が必要な場合がある (2) 操作法 1 清潔で刃の鋭いメスあるいはフナコシのフナゲルチィップでアガロースゲルから DNA フラグメントを切り取る 余分なゲルを取り除いて ゲルスライ

13 スのサイズを最小とする 2 1.5ml のチューブにゲルスライスを測り入れる サンプルゲル (100mg=100 μl とする ) に対して 3 倍容量の Buffer QG を添加する 3 50 で 10 分間 ( ゲルが完全に溶解するまで ) インキュベートする ゲルの溶解を助けるため インキュベーション中 2~3 分に 1 度チューブを Vortex にかけて溶液を混合する 注 : アガロースゲルを完全に溶解する 2% 以上のゲルを用いる場合は (2) でゲルに対して 6 倍量の Buffer GG を添加し インキュベーション時間を長くする 4 ゲルスライスが完全に溶解後 溶液の色が黄色であることを確認する ( アガロース溶解前の Buffer QG の色とほぼ同じ ) 注 : 溶液の色がオレンジ色あるいは紫色の場合は 3M の酢酸ナトリウム (ph5.0) を 10μl ずつ添加混合し 溶液の色が黄色になるようにする DNA のメンブレンへの吸着は ph7.5 以下においてのみ効率的に行われるので ph 指示薬により ph7.5 以下で黄色 それより高い ph ではオレンジまたは紫色を呈する Buffer QG は DNA 結合に最適な ph を決定するのに便利である 5 ゲルと同容量のイソプロパノールをサンプル溶液に添加し チューブを 10 回上下混合する 例えば 100mg のアガロースゲルスライスには 100μl のイソプロパノールを添加する この時点でサンプルを遠心しない 6 ラックにセットした 2ml コレクションチューブに MinElute カラムを乗せる 7 サンプルを MinElute カラムにアプライし DNA をカラムに結合して 1 分間遠心する 最大の回収率を得るために サンプル液は残さず全てカラムに添加する カラムへ 1 度に添加可能な最大容量は 800μl である 800μl よりサンプル量が多い場合には 数回に分けて添加 遠心操作を行う 8 フロースルー液は捨て MinElute カラムを同じコレクションチューブに再度乗せる 9 500μl の Buffer QG をスピンカラムに添加し 1 分間遠心する 10 フロースルー液は捨て Min Elute カラムを同じコレクションチューブに再度乗せる 11 洗浄のため 750μl の Buffer PE を MinElute カラムに添加し 1 分間遠心する 12 フロースルー液を捨てた後 MinElute カラムをさらに 1 分間 10,000Xg(~ 13,000rpm) で遠心する 13 新しい 1.5ml のマイクロ遠心チューブに MinElute カラムを乗せる 14 DNA の溶出を行うために 10 30μl の Buffer EB(10mM Tris-Cl ph8.5) あるいは DDW をメンブレン表面の中央に添加し 1 分間カラムを放置後 1 分間遠心する これが抽出 DNA である 4) ハイブリダイゼーション 1 抽出 DNAを 0.5mlのチューブに取り 1.5M NaCl buffer #1 でバンドの濃度を見て適宜希釈する (DNA 量は 200ng/ml 程度の濃度とする ) なお通常のPCRでバ

14 ンドがしっかりとみられた増幅 DNA (PCR 産物 8μlを泳動 ) は 5 倍から 20 倍希釈して用いる 98 5 分間加熱処理 直ちにon iceする 2 マイクロトレイに固定化液 #2 を 90μl 入れ それに加熱処理したDNAを 10μl ずつ1 検体当たり1ウエルに入れる #1:3 倍濃度 1.5M NaCl buffer:4.5m NaCl 30mM リン酸 2 ナトリウム 30mM EDTA ph7.0 #2: 固定化液 :3 倍濃度 1.5M NaCl buffer 3.0ml DDW 6.0ml Control HAV-prob N P 検 検 検 検 C C 体 体 体 体 A B C 図 1. トレイのレイアウト プレートにシールし 37 恒温漕に重しをして沈めて 2 時間以上置く 3 PBS-T でプレートを 3 回洗浄する 4 表 5 に示したようにプローブの調製を行い 98 5 分間加熱処理 直ちに on ice する 表 5. プローブの調製 (1 検体当たり ) プローブコントロープローブル 100pmol/μl probe TE 1μl 1μl 注 100μg/mlサケ精子 DNA 1 5μl 5μl 3 倍 1.5M NaCl buffer 3.3μl 3.3μl DDW 0.7μl 0.7μl 注 1 サケDNA:DNA 量 10mg/mlのものをTEで 100μg/mlに希釈したもの 5 表 6. に示したようにハイブリ液を調整し 4 のプローブ サケ精子 DNA 混合液と合わせる

15 注表 6. ハイブリ液 (1 検体当たり ) 3 倍 1.5M NaCl buffer 30μl ホルムアミド 50μl 10% Tween20 1μl DW 9μl 注 : ハイブリ液は使用前に氷冷しておく 6 表 6 で作製した混合液 10μl に表 7 で作成したハイブリ液 90μl を加え,100 μl とし それを各ウエルに 100μl ずつ入れる マイクロプレートにシールをし 45 恒温漕に重しをして沈め 6 時間以上 あるいは 1 夜置く 7 シールのプレート側を内側にして巻き込むように剥がす ( マイクロプレート内の DNA を撒き散らさないように包み込む ) 45 に温めておいた PBS-T で 3 回洗浄する プレート洗浄時にはプレートをペーパータオル等で包み その後叩き水分を完全に除くと同時に DNA を周りに撒き散らさないように細心の注意を払う 使用したペーパータオル 洗浄液等は 1000ppm 濃度の次亜塩素酸ソーダに直ちに漬ける ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ (1%BSA+PBS-T で適宜希釈したものを全てのウェルに 100μl 入れる ( ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ入れた容器は使用後廃棄するか高圧滅菌し酵素を不活化する ) 室温 1 時間置く ( 弱く振動させるとよい ) 8 プレートを PBS-T で 5 回洗浄する 9 全てのウエルに発色液 #3 を 100μl 入れる #3:TMB 1mg DMSO 1ml phosphate-citrate buffer 9ml (0.2M dibasic sodium phosphate 25.7ml 0.1M citric acid 24.3ml 精製水 50ml ph5.0) を作製し 30% H 2 O 2 2μl を使用直前に入れる 室温 15 分間 ( プレートは遮光しておく ) 10 停止液 (4N H 2 SO 4 ) を 50μl 入れる nm で吸光度を測定する 12 判定 : コントロールに比べ OD 値が 2 倍以上 かつ 0.2 以上の差が認められた時に陽性とする B. ドット ハイブリダイゼーションインによる A 型肝炎ウイルス (HAV) 遺伝子確認検査この方法はメンブレンに DNA を吸着させて行う方法である ウイルスでは一般的にこの方法で行われている 1) 器具恒温水槽 ハイブリダイゼーションインキュベータ トランスイルミネータ ヒートシーラ ポジティブチャージナイロンメンブレン :Nylon menbranes,

16 positively charged ベーリンガー Cat.No ハイブリダイゼーションバッグ : ニッポンジーン,Cat.No タッパー : 井内 Code.No ) 2) 試薬 NaCl 濃塩酸 DW SDS マレイン酸 MgCl 2 20 SSC:NaCl 100g を 900ml の蒸留水に溶解 (68 ) し 濃塩酸で ph7.2 に調整後 蒸留水で,1000ml とする 10% SDS:SDS 100g を 900ml の蒸留水に溶解 (68 ) し 濃塩酸で ph7.2 に調整後 蒸留水を加え全量を 1000ml とする N-Lauroylsarcosine:SIGMA, Cat.No.L-5777 ホルムアミド :Wako, Cat.No Blocking reagent: ロシュ ダイアグノスティックス Cat.No NBT/BCIP: ロシュ ダイアグノスティックス Cat.No Buffer 1:0.1M マレイン酸 ;0.15MNaCl(pH7.5,20 )ph の調整は ph6.5 くらいまで固形 NaOH(8.5g) で それ以降は 1N NaOH を加えて調整する 洗浄 Buffer:Buffer 1 に 0.3% となるように Tween 20 を加える ブロッキング溶液 :Buffer 1 で Blocking reagent を 1% とする 検出溶液 :100mM Tris-HCl;100mM NaCl(pH9.5,20 )10ml に 2.5M MgCl 2 を 200 μl 加える ( 最終濃度 50mM MgCl 2 ) Streptavidin Alkaline Phosphatase:Promega, Cat.No.V5591 ビオチン標識プローブ :HAV-probe ) 操作法 1 アガロースゲル電気泳動で HAV 陽性バンドが認められた部分から DNA を抽出後 100 で 5 分間熱変成し その 1μl をナイロンメンブレンにスポットし風乾後する ( 上記ゲルから DNA 抽出を参照 ) 2 トランスイルミネータ上でスポットした面を下にして 3 分間 UV 照射する それをハイブリダイゼーションする 3 溶液量は 約 20cm 2 のメンブレンで計算してあるので メンブレンの面積によって以後適宜調整する 4 ハイブリ液 ( 表 7)5ml にビオチン標識プローブを 50μl (200ng/ml) 加えプローブ溶液を調整し 沸騰水中で 5 分間 (98 5 分間 ) 加熱しプローブ溶液を調整する 適量のプローブ溶液 (2~5ml) をメンブレンの入っているバックに加え バッグ中から気泡を追い出した後ヒートシーラでシールする 5 42 の恒温水槽中で 6 時間 ~ 一夜ハイブリダイゼーションする

17 表 7. ハイブリダイゼーション溶液 Stock solution Final Required volume for 50ml concentration 20 SSC ml 10% Blocking reagent 2% 10ml 10%-Lauroylsarcosine 0.1% 0.5ml 10% SDS 0.02% 0.1ml Formamide 50% 25ml DW 0 2ml 6 バッグからメンブレンを取り出し タッパーに移し 0.1% SDS を含む 2 SSC ( 表 8 参照 )20ml で 5 分間 室温で 2 回洗浄する その後 0.1% SDS を含む 0.1 SSC( 表 8 参照 )20ml で 15 分間 42 で 2 回洗浄する 注 : 使用したプローブ溶液は 数回使用できるので 捨てずに取っておく 使用前には 沸騰水中で 5~10 分間熱変成する 0.1% SDS を含む 0.1 SSC は あらかじめハイブリダイゼーション温度と同じ温度に温めておく 表 8. 洗浄液の組成 Stock 2 SSC,0.1% SDS 0.1 SSC,0.1% SDS solution 20 SSC 50ml 2.5ml 10% SDS 5ml 5ml DW 445ml 492.5ml Total 500ml 500ml 7 メンブレンを洗浄 Buffer 1 の 20ml に 10% Tween 20 を 600μl 加えた Buffer で 1 分間洗浄する 8 ブロッキング溶液 20ml で 30 分間 室温でインキュベートする 9 ブロッキング溶液 200ml で Streptavidin Alkaline Phosphatase を 5000 倍希釈した溶液 20ml にメンブレンを浸漬し 30 分間室温でインキュベートする 10 洗浄 Buffer 25ml で 15 分間室温 2 回洗浄する 11 検出溶液 20ml で 2 分間 平衡化のためインキュベートする 12 検出溶液 5ml に NBT/BCIP stock 溶液 100μl を加え 発色基質溶液を調整する 加える stock 溶液は 50μl でも行える 13 検出溶液で平衡化したメンブレンをハイブリバッグに移し 発色気質溶液を 3~5ml 加え 気泡を追い出した後ヒートシーラでシールする 発色するまで 静置する 発色中は 振とうしたり攪拌したりしない 14 発色が確認できたら メンブレンを TE Buffer 30~50ml で 5 分間洗浄して

18 反応を停止させる 4) 判定紫色にスポットが染色されたものを陽性とする この際には必ずゲルの陰性コントロールと比較して行う

19 Ⅲ 3 3 A 型肝炎ウイルスのリアルタイム PCR 法 cdna の調整は前出の RT-PCR 法による ここでは Random primer で cdna を作製したものを用いる 1) 反応液の調整反応液の調製は表 9 に示した 但しこの方法は ABI PRISM7700 あるいは 7000 でのものである 機種が異なる時にはそれぞれの機種での最適な条件に合わせる ウイルス陽性コントロール (10 7 から 10 0 ) および検体は各 2 ウエルを用いる 表 9. 反応液の調製 DDW 16.6μl TaqMan Universal Master MIX(ABI) 25.0μl 100pmol/μl プライマー HAV+449* 0.2μl 100pmol/μl プライマー HAV μl 4pmol/μl プローブ HAV+482-P-FAM 3.00μl cdna 5.00μl 計 50 μl *: プライマー プローブの配列は図 2 参照 2)PCR 反応 PCR 反応は以下に示した条件で行う 50 2 分間 分間 秒間 56 2 分間 50 回 3) ABIPRISM7700(ABI) で蛍光強度測定蛍光強度測定し 標的領域をプラスミドに組み込んだ DNA を 10 7 から 10 0 コピーに希釈した標準サンプルによる検量線を作成し サンプルの初期濃度 ( コピー数 ) を算出しする 4) 判定サンプルのコピー数が 2 ウエル共に 10 コピー以上の時に陽性とする また 1 ウエルのみ行ったときには再度行い,2 回共に 10 コピー以上の時に陽性とする 判断に困難を来したときには再度行い判定する

20 - 20 -

21 Ⅳ. 参考文献 1. Fiore AE: Hepatitis A transmitted by food: Clinical Infectious Disease 38: , 米山徹夫 :A 型肝炎 我が国の最新の発生動向を中心に. 臨床とウイルス 32: 西尾治 : 糞便及び食品中の A 型肝炎ウイルスの検査法について. 食監発第 号 平成 14 年 8 月 16 日. 4. 戸塚敦子 :A 型肝炎ウイルス RNA の RT-PCR 法による検出法. 肝炎ウイルス検査法マニュアル 平成 14 年 7 月. 5. Feinstone S. Gust ID.: Hepatitis A virus. In Textbook of Clinical Virology, 2nd edition.eds. Richman DD. Whitley RJ. Hayden FG. ASM press, Washington, DC, 2002, pp Purcell RH. Emerson SU.: Hepatitis A virus pathogenesis and Attenuation in Textbook of Molecular Biology of Picornaviruses, eds. Semler BL. Wimmer E. ASM press, Washington, DC, 2002, pp Probst C. et al. : Intrinsic signals for the assembly of hepatitis A virus particles. J Biol. Chem. 274: , Kiyohara T, Satoh T, Yamamoto H, Totsuka A, Moritsugu Y: The latest seroepidemiological pattern of hepatitis A in Japan. Jpn J Med Sci Biol 50: , 戸塚敦子 :Hepatitis A virus (HAV). ウイルス実験プロトコール 監修 : 永井美之 石浜明 編集 : 小林信之 長田恭介 メジカルビュー社 1995 pp Robertson. H. et al: Genetic relatedness of hepatitis A virus strains recovered from different geographic regions: J Gen Virol. 73: ,

22 . 試料の分与依頼先 陽性コントロールの分与標的領域をクローニングしたプラスミド ( プライマー +2799/-3273 の領域 ) の必要な機関は宮城県環境保健センター 神奈川県衛生研究所 愛知県衛生研究所 大阪府公衆衛生研究所 愛媛県衛生環境研究所 福岡県保健環境研究所のウイルス担当官に分与を依頼する リアルタイム PCR のコントロール ( の部分を組み込んだもの ) は神奈川県衛生研究所 愛媛県衛生環境研究所に分与を依頼する 但しリアルタイム PCR のコントロールは半年程度しか持たないので使用時に連絡すること 感染性 HAV が必要な機関は国立感染症研究所ウイルス第二部第五室に分与を依頼する

23 おわりに本マニュアルは A 型肝炎が E 型肝炎とともに 2003 年 11 月の感染症改正で 4 類に分離されたことを受けて 2002 年 7 月に印刷された急性ウイルス性肝炎診断マニュアルと同年 8 月に印刷された食中毒調査における A 型肝炎検査法を再編集したものである 問合せ先国立感染症研究所ウイルス第二部第五室 ( 米山徹夫 ) 執筆者米山徹夫西尾治 国立感染症研究所ウイルス第二部国立感染症研究所感染症情報センター