動脈硬化 linoleate-labeled LDLを 腹 腔 に 注 入 し, Vol. 17 No さ ら に24 III. 時 間 後 に, 1. 採 取 し た. Lipid inclusion lesterol bodyの 調 製 は, linoleate-labeled

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2 動脈硬化 linoleate-labeled LDLを 腹 腔 に 注 入 し, Vol. 17 No さ ら に24 III. 時 間 後 に, 1. 採 取 し た. Lipid inclusion lesterol bodyの 調 製 は, linoleate-labeled 浮 遊 さ せ, Tris-HCl を 採 取 し た. 15分 上 層 のfat 収 さ れ た. carboxyl esteraseに して 螢 光 色 素 が 認 め られ, layer 薄 層 ク ロマ こ の 層 α-naphtyl acetateを acetylated 注 入 し, 24時 キ ュ ベ ー シ ョ ン し, ン でliposomeに linoleate-labeled 1ヒ れ た(Fig. ジ ウム の 存 在 下 で イ ン phの ソ よ るcholesterol esterの esteraseと レシ チ し たcholesterol[14C]oleateと イ ま た酵 素 量 3). Cholesterol esterの 水 解 能 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 す る とpH45か らpH9.0ま 広 範 囲 に わ た っ て 水 解 活 性 が 認 め ら れ た(Fig. ト大 動 脈 ア テ ロー ム 巣 に お け る 抗carboxyl 螢 光 抗 体 法 の 顕 微 鏡 像. esteraseに に応 じて コ レス テ ロー ル エ ス テ ル の水 解 が認 め ら ト ー プ 活 性 を 測 定 し た. Fig. 性 の存 在 が認 ン キ ュ ベ ー シ ョ ン す る と, 経 時 的 に, 間 後 に摂 取 した コ メ ジ ウム 中 の ラ ジ オ ア イ Carboxyl 精 製 ヒ ト血 清 中 のcarboxyl レ ス テ ロ ー ル エ ス テ ル 負 荷 マ ク ロ フ ァ ー ジ を10% 牛 胎 児 血 清 含 有DMEメ 示 す ご と く, 内 膜 肥 厚 水解能 放 出能 ら の コ レ ス テ ロ ー ル の 放 出 能 は, LDLを 性 の め られ た. 2. ラ ッ ト 腹 腔 に[14C]cholesterol 1). 部 の 下 層 に 褐 色 に 染 ま るesterase活 トグ ラ フ ィ ー ら の[14C]cholesterolの Macrophageか 体 と イ ン キ ュ 基 質 に し てesterase活 存 在 を 調 べ る と, Fig. 2に よ る水 法 に て 分 離 し 測 定 し た. Macrophageか ノ ク ロー ナ ル抗 中膜 お よび 健 常 内膜 部 で は 認 め られ な か っ た(Fig. 先 に述 べ た反 応 液 に て イ ン キ ュ ベ ー シ ョ [14C]cholesterolを 存在 ベ ー シ ョンす る と大 動 脈 内 膜 の 動 脈硬 化 巣 に一 致 こ の 画 分 中 の[14C]cholesterol 基 質 と し, esteraseモ し螢 光 色 素 ラ ベ ル 抗 マ ウ スIgG抗 低 張 液 に 後 比 重1.006で, 間 行 い, esteraseの 体 と ヒ ト大 動 脈 凍 結 切 片 と を イ ン キ ュベ ー シ ョン 荷 マ ク ラ ジ オ ア イ ソ ト ー プ 活 性 は, linoleateを ン 後, LDL負 ph7.4の disruptionし, 超 遠 心10,500 gで18時 解 能 は, 績 動 脈 硬 化 病 巣 のcarboxyl 抗 ヒ ト血 清carboxyl 上 述 の[14C]cho- acetylated ロ フ ァ ー ジ を4mM に60%回 成 腹 腔 よ り先 と 同 様 に マ ク ロ フ ァ ー ジ を (上 方 は 内 膜, esterase 下 方 は 中 膜) monoclonal抗 体 を用 い た で 4).

3 Carboxyl 3. 動 脈 硬 化 巣 に み ら れ るlipid esteraseの Acetylated 動 脈 硬 化 巣 で の存 在 とそ の意 義 droplet中 の 質 に し てcarboxyl 水 解 に 及 ぼ す LDL[14C]cholesterol [14C]cholesterol linoleateの carboxyl Esteraseの linoleateに linoleateを 4. ラ Acetylated ッ ト腹 腔 マ ク ロ フ ァ ー ジ と イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し 負 荷 さ れ たmacrophageか 放 出 に 及 ぼ すcarboxyl 10,500 gで ら れ た. Tris-HCl, ph7.4で 細 胞 を処 理 し Acetylated 超 遠心 を行 う と上 清 に 脂 肪 層 が認 め こ の 画 分 中 の[14C]cholesterol 対 す る 水 解 能 と esterを 基 5). LDL[14C]cholesterol linoleateを た の ち, 4mM 添 加 す る とacetylated ほ ぼ 同 等 の 水 解 活 性 を 示 し た(Fig. 作 用 LDL[14C]cholesterol esteraseを ら の[14C]cholesterol esterase添 加 の影 響 LDL[14C]cholesterol linoleateが 荷 さ れ た ラ ッ ト腹 腔 マ ク ロ フ ァ ー ジ を 培 養 し た メ ジ ウ ム 中 にcarboxyl esteraseを 添 加 し6時 メ ジ ウ ム へ のfree[14C]cholesterolの し た. Fig. 6に 示 す ご と く, の 放 出 能 の 低 下 が み ら れ た. Fig. 4 ト大 動 脈 ア テ ロ ー ム 巣 の エ ス テ ラ ー ゼ 染 色 [14C]cholesterolの Fig. 3 Cholesterol ester hydrolysis esterase. by carboxyl esterase. 在 下 で は, Carboxyl Effect of ph on cholesterol carboxyl 間 後, 放 出 量 を測 定 出 が み ら れ た が ク ロ ロ キ ン50μM存 Fig. 2ヒ 負 放 そ esterase添 ester hydrolysis by

4 Fig. 5 Hydrolysis of lipid droplet [14C] cholesterol ester by carboxyl esterase. Fig. 6 Effect of carboxyl esterase on the release of [14C] cholesterol from macrophage.

5 1) Kutty, K. M.:Review, Biological function of cholinesterase. Clin. Biochem., 13: (1980). 2) Tsujita, T., Nagai, K. and Okuda, H.:Purification and properties of human serum esterase. Biochim. Biophys. Acta, 570:88-95(1979). 3) Lockridge, O. and LaDu, B. N.:Comparison of atypical and usual human serum cholinesterase. J. Biol. Chem., 2532: (1978). 5) Shirai, K., Ohsawa, J., Ichikawa, Y., Saito, Y. and Yoshida, S.:Human plasma carboxylesterasecatalyzed triolein hydrolysis. J. Biol. Chem., 260: (1985). 6) Harris, P. H., Hopkinson, D. A. and Robson, E. B.: Two-dimensional electrophoresis of pseudocholine esterase components in normal human serum. Nature, 196: (1962). 7) Shinomiya, M., Matsuoka, N., Shirai, K. and Saito, Y.:Studies on cholesterol esterase in rat arterial wall. Atherosclerosis, 33: (1979). 8) Brown, M. S., Dona, S. E. and Goldstein, J. L.: Receptor-dependent hydolysis of cholesterol esters contained in plasma low density lipoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72: (1975). 9) Basu, S. K., Brown, M. S. and Goldstein, J. L.: Degradation of cationized low density lipoprotein and regulation of cholesterol metabolizum in homozygous favilral hypercholesterolemia fibroblast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 13: (1976). 10) Hata, Y., Homer, J. and Ingull, W.:Cholesterol ester-rich inclusion's from human articfatty streak and fibrous plaques of atherosclerosis. Am. J. Path., 75: (1974). 11) Brown, M. S., Ho, Y. K. and Goldstein, J. L.: The cholesterol ester cycle in macrophage foam cells. J. Biol. Chem., 10: (1980). 12) Sand, G. N. and Henke, V. L.:Recognition and receptor-mediated endocytosis of lysosomal acid lipase secreted by cultured human fibroblasts. J. Lipid Res., 23: (1982)

6 Summary Cholesterol Ester Hydrolysis by Carboxyl Esterase in Atheromatous Lesion Kohji SHIRAI*, Hiromi KUROSAWA*, Yasushi SAITO*, Shiro UEDA**, Masahumi WAKASHIN**, Hideyuki HASHIMOTO***, Isamu FUKAMACHI*** and Sho YOSHIDA* *The Second Department of Internal Medicine, School of Medicine, Chiba University **The First Department of Internal Medicine, School of Medicine, Chiba University ***Japan Immunologic Research The role of serum carboxyl esterase in cholesterol ester hydrolysis in atheromatous lesions was investigated. Purified serum carboxyl esterase hydrolyzed cholesterol oleate emulsified with lecithine from ph 4.5 to ph 8.0. In human atheromatous lesion, carboxyl esterase activity was observed, and an immuno-reactive substance with carboxyl esterase was also found in thick intima portion by immunofluolescent study using monoclonal antibodies. [3H]Cholesterol oleate in lipid droplet formed in rat peritoneal macrophages was also hydrolyzed with carboxyl esterase. Addition of carboxyl esterase to macrophages loaded with acetylated LDL-[3H]cholesterol linoleate, increased the release of [3H]cholesterol. These results suggests that carboxyl esterase might promote the hydrolysis of cholesterol ester in atheromatous lesion. Key words:atheroma, carboxyl esterase, cholesterol esterase

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