を行った 藻体のメタノール抽出物から液液分配の後, アルミナ及びシリカゲルクロマトカラム, 中圧逆相クロマトカラムにより荒分けし, 最終的に HPLC 分取精製を行った NMR により単離物が OA と DTX1 である事を確認した また, マイナー化合物ではあるが OA 類縁体の 7-deoxy

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1 2. 中課題 2: 貝毒標準物質の抽出 精製技術の開発 (1) 成果の概要工程表進捗状況 成果 Dinophysis 培養物を対象に PTX2 や OA 等 Dinophysis の培養液から毒を固相抽出によの毒の精製条件について, 既存の精製条件をり抽出し, 市販のカートリッジカラムより効率化する ( 小課題 1 関連 ) ( 平成 23 SepPak C18 plus による前処理精製物を -24 年度 ) HPLC による自動連続精製システムを用いて精製することにより, 高純度毒を精製できることが明らかになった ( 図 1) ( 平成 23 年度 ) 1 Dinophysis 培養物を対象にカラムスイッチングバルブやオートインジェクタ等の機器を効率的に使用し, クロマトグラフィーによる毒の精製を可能な限り自動化する ( 小課題 1 関連 ) ( 平成 年度 ) カラムスイッチングバルブとオートインジェクタによる連続自動精製システムを市販装置の組み合わせにより考案した ( 図 2) ( 平成 23 年度 ) 2 P. lima と P. reticulatum が生産する毒を対象とした精製条件の検討 ( 小課題 1 関連 )( 平成 年度 ) 収穫藻体の一部を用いて既報メソッドにより抽出精製を行い,OA 及び DTX1 を単離した YTX に関しては, 試験的に溶媒抽出まで行った ( 平成 23 年度 ) 既報メソッドにより OA, DTX1 及び YTX を単離した ( 平成 24 年度 ) P. lima と P. reticulatum が生産する毒を対象とした機器による精製自動化条件の検討 ( 小課題 1 関連 ) ( 平成 年度 ) 精製自動化は, 市販汎用オートサンプラーと大量分取用フラクションコレクターを利用して終夜連続運転で自動分取が可能である事を確認した ( 平成 23 年度 ) 前年度に引き続き, 同上の手法で精製自動化を実行した ( 平成 24 年度 ) 平成 23~24 年度に大量培養後, 冷凍保存した P. lima 藻体から OA と DTX1 の単離精製 25

2 を行った 藻体のメタノール抽出物から液液分配の後, アルミナ及びシリカゲルクロマトカラム, 中圧逆相クロマトカラムにより荒分けし, 最終的に HPLC 分取精製を行った NMR により単離物が OA と DTX1 である事を確認した また, マイナー化合物ではあるが OA 類縁体の 7-deoxy OA も得られた 培養容量約 1000 L 分から OA 100 mg DTX1 10 mg を得た (HPLC 純度 85~90%) これは従来培養法による収量よりも 10 倍以上の収量で得られた ( 平成 25 年度 )( 図 3,4,5) 3 平成 23~24 年度に大量培養後, 冷凍保存した P. reticulatum 藻体から YTX の単離精製を行った P. reticulatum 培養液 (464L 相当量 ) を濾過し,HP20SS 樹脂, 液液分配, 中圧ガラスカラムクロマトグラフィー, HPLC 分取クロマトグラフィーにより YTX を精製した HPLC 分取クロマトグラフィーにおいては,C30HPLC カラムの利用により大量の YTX を精製することが可能であることが明らかになった 精製した YTX は NMR により高純度であることが確認された ( 平成 25 年度 )( 図 6,7) ラン藻や渦鞭毛藻が生産する主要毒を効率的に精製する方法を確立する ( 小課題 2 関連 ) ( 平成 年度 ) ラン藻が生産する主要毒である C1 と C2 の単離において, 特殊な樹脂を使用しない, 代替となる精製手順を検討したところ, 市販の膜ろ過装置を使用して既報と同等の純度が得られることを NMR にて確認した ( 平成 23 年度 ) ( 図 8,9,10) 4 26

3 渦鞭毛藻 Alexandrium tamarense の培養藻体 10L 相当を使って, 効果的な抽出法を検討した ラン藻で有効であった膜ろ過を適用したところ, 色素タンパク質などを効果的に除去できた また, グラファイトカーボンが充填された固相カートリッジを通液させることで, そのまま高圧カラムによる自動精製が可能であることを確認した 従来の中圧カラムを主体とする精製法から, 汎用性があり, 簡便な精製法へと大幅に改良できた ( 平成 24 年度 )( 図 11) 5 渦鞭毛藻 Gymnodinium catenatum の培養藻体 10 L 相当を使って, 効果的な抽出法を検討した ラン藻で有効であった膜ろ過を適用したところ, 色素タンパク質などを効果的に除去できた その後, ゲルろ過カラムクロマトグラフィー, 親水性クロマトグラフィー, 再度ゲルろ過クロマトグラフィーに供することで, 総収率 50% で GTX5,6 を単離することができた ( 平成 25 年度 )( 図 15,16) 7 自動分取装置を使用して, 単離した毒を最終精製し, それぞれの異性体を単離する方法を確立する ( 小課題 2 関連 ) ( 平成 年度 ) 自動分取装置 ( アジレント社製 ) にて貝毒を検出するための MS 条件を設定した 成分分離には親水性相互作用のあるカラムを使用した 二種類のカラムを使用することにより, それぞれの異性体を単離することが可能となった また, 抽出液を精製するための効率的な前処理として, グラファイトカーボンが充填された固相抽出カートリッジが有効であることを見出した 実際に, プランクトン抽出液にて, 効率よく検出できることを確認した ( 平成 24 年度 )( 図 12,13,14) 27

4 6 前年度に引き続き, 自動分手法の条件を検討した 新たに GTX5,6 の溶出位置を特定し, 実際の精製に適用可能であることを明らかとした また, 精製した GTX5,6 に対し NMR と HPLC にて純度を確認し,95% 以上であることを確認した ( 平成 25 年度 )( 図 15,16) 7 成果目標 : より汎用性の高い精製用担体等を用いることにより, 既存の精製法を汎用的な手法に改良する また, 精製手順についてもより簡便化や機器による自動化を図り, 効率的な精製技術を確立する < 成果の概要の補足 > 1:OA と PTX2 は夾雑物との重なりがないためこの条件で高純度精製物が得られる 図 1.D.forti の SepPak C18 60% メタノール溶出画分の HPLC-DAD クロマトグラム 夾雑物 OA PTX2 DTX1 D. fortii Sep pak C18 60% fraction DAD 分析 OA, PTX2は単一のピークで検出されているが 付近に夾雑物が多く存在しているため 夾雑物の混入していないフラクションを収集する DTX1は極大吸収の異なる化合物と保持時間が重なっているため再精製が必要である 28

5 2: カラムスイッチングバルブとオートインジェクタを用いた自動精製システムにより精製対象ピークやその再度フラクションを分画できる 図 2. カラムスイッチングバルブとオートインジェクタを用いた自動精製システムの概略図 Pump Auto injector Column Fraction collector Resurve Tube 自動精製システム概略図 B Resurve A A B Valve 1 Valve 2 Valve A ーB Resurve waste Fraction Collector (time base) Side fraction B ーB A ーB Resurve A ーA 3 収穫時に濾過操作で培地と藻体に分離 培地中に含まれる OA 及び DTX1 は HP20 樹脂で回収し, 藻体抽出物と併せて精製した 含水メタノール-ヘキサン分配によりクロロフィルや脂質などを除去し, 次いでクロロホルム- 水分配で目的成分とその他成分に分液した その後, アルミナとシリカゲルの純相カラム, 中圧逆相クロマトカラム,HPLC 逆相クロマトカラム精製により OA 及び DTX1 を得た 29

6 図 3.P. lima 藻体からのオカダ酸類抽出フローチャート 図 4.HPLC 精製によるオカダ酸類精製時の HPLC クロマトグラム (19.3 分 :OA, 26.6 分 :DTX1) 30

7 図 5.OA と DTX1 の 1 H-NMR スペクトル (600 MHz, CHCl3),( 上 )OA ( 下 )DTX1 図 6. 最終精製における P. reticulatum C30 A40:C60 画分 Mightysil RP18GP クロマトグラム 31

8 図 7. 精製した YTX の H-NMR スペクトル 1H, 800 MHz, CD3OD 表 1. 精製した YTX のマイクロ天秤による秤量結果と各定量分析結果の比較 QNMR Eretic LC-MS (EIC) m/z ±0.05 mmu HPLC-UV 230 nm 定量値 (µg) マイクロ天秤による秤量値 (µg) 秤量値との真度 (%) : 特殊な樹脂とは,Bio Gel P-2 ( mesh, Bio Rad) で現在市販されていない旧製品をさす 同製品は今も販売されているが, 毒を保持する能力がなく精製には不向きで 32

9 ある 本樹脂を使用した精製は必須の工程であるため, それと同等の効果が得られる代替手法の開発が不可欠であった 現時点でのラン藻からの精製方法を図 8に示す 特殊な樹脂の代替法として検討した膜ろ過法 ( 図 9) では, 毒の回収率は 90% 以上であることを確認した また, この方法により, 数日間で有毒画分を処理できるようになり, 精製期間を大幅に短縮することができた 得られた毒は高純度であることが NMR により確認された ( 図 10) 図 8. ラン藻細胞画分からの主要毒の精製スキーム ラン藻 Anabaena circinalis 培養液 ラン藻細胞画分 0.5 M 酢酸溶液 (200 ml) を加え 抽出液を酸性とした 200 ml ずつ プラスティックボトル (250 ml 容 ) に分注した 超音波破砕 (Output level;6, on ice, 30 sec x 5 ti mes, Iwaki ) 遠心分離 (9000 rpm, 4degC, 30 min, Kubota) ( 操作 1) 上清 残渣 ( 操作 1) を2 回繰り返した 上清 有毒画分 混ぜ合わせた 活性炭 200 ml ( 湿重量 200g 相当 ) をオープンガラスカラムに充填した 上清約 1 L を通液した カラムを蒸留水 400 ml で洗浄した 4% 酢酸 -50% エタノール溶液 (1.6 L) にて有毒成分を溶出した Vivaflow50 にて膜ろ過 ( 分画分子量 10000, 再生セルロース膜 ) をした 100ml の 0.05M 酢酸溶液にて 2 回ろ過セットを洗浄した ろ液 減圧濃縮した 陽イオン交換カラムクロマトグラフィー (DEAE 650M, 450 x 20 mm i.d., Tosoh) 溶離液 ;5% B (A; 蒸留水 B; 1 M 酢酸溶液 ) 流速 ;2 ml/min C1/2 粗画分 (105 ml ~240 ml) 回収率 :85% 以上 減圧濃縮した 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー (BioRex mesh, 450 x 10 mm i.d., Bio Rad) 溶離液 ;5% B (A; 蒸留水 B; 1 M 酢酸溶液 ) 流速 ;1 ml/min C1/2 粗画分 (16ml ~32 ml) 回収率 :85% 以上 33

10 図 9. 膜ろ過法の概略図 ペリスタポンプ Vivaflow 50 再生セルロース膜分画分子量 :10000 MWCO ろ過前 ろ過後 ラン藻抽出液 濾液 1 ml/min 抽出液 濾過膜分子量 以下 濾液 図 10.C1/C2 粗精製画分の NMR による純度確認 ( 上段 : 改良した精製法, 下段 : 既存の精製法 ) :GTX2/GTX3 由来のシグナル :1-butanol 由来のシグナル 1.2 ppm: tert-butanol, 2.05 ppm; CHD2COOD+CH3COOH 34

11 5: 渦鞭毛藻の細胞画分から, ろ過法を主体とする精製を経て, 高圧カラムを利用した最終精製へと導く汎用的かつ簡便な精製法を開発した 図 11. 渦鞭毛藻 Alexandrium tamarense からの効率的な抽出方法の確立 Alexandrium tamarense 細胞画分 (75 ml, 10 L 相当 ) 上清 0.5 M 酢酸遠心分離 残渣 2 固相抽出前 ZIC-HILIC, 60%B GTX min 1700cps C min 吸引ろ過 ( 膜孔 :0.45 m, 材質 :PES) ろ液 膜ろ過 ( 分画分子量 :10 kda, 材質 :PES) ろ液減圧濃縮固相抽出 (HyperSep PGC, 50mg) ろ液自動分取装置による精製 ZIC-HILIC, TSKgel Amide80 など 麻痺性貝毒 (C2, GTX4) 固相抽出後 5-7 倍感度上昇! 分離が良好 GTX min 2200cps C min 6: 自動分取 MS による麻痺性貝毒の精製条件図 12. 自動分取 MS 装置における分析条件 ( アイソクラティック溶出 ) ポンプ A; 蒸留水 ( 移動相 ) B; 95% アセトニトリル ( ともに 3.6 mm ギ酸 2.0 mm ギ酸アンモニウムを含む ) カラム 1) TSKgel Amide-80 (250 x 2 mm, Tosoh) 2) ZIC-HILIC(150 x 2 mm, Merck) 質量分析計 (MS) 毒 m/z-1 m/z-2 m/z-3 TSKgel Amide80 ZIC-HILIC C %B 60%B C GTX GTX GTX GTX GTX %B dcgtx dcgtx neostx %B 50%B dcstx MS パラメーター マルチモードソース (ESI) ドライガス : 5 L/min ネブライザー : 60 psi ドライガス : 250 バポライザー : 150 キャピラリー電圧 : 2000 V コロナ電流 : 0 A チャージ電圧 : 2000 V ポジティブ 35

12 図 13.GTX2/GTX3 標準品による異性体の分離例 ZIC-HILIC TSKgel Amide80 UV クロマトグラム UV クロマトグラム MS クロマトグラム GTX2 8.0 min MS クロマトグラム GTX min GTX min GTX min 図 14. 親水性相互作用カラムにおける各貝毒成分の溶出時間例 ZIC-HILIC Time (min) 8:00 9:00 10:00 11:00 60%B C1 GTX1 GTX2 dcgtx2 50%B GTX5 TSKgel Amide80 Time (min) 8:00 9:00 10:00 11:00 70%B C1 C2 60%B dcgtx2 dcgtx3 12:00 13:00 14:00 GTX4 C2 GTX3 dcgtx3 12:00 13:00 14:00 GTX5 15:00 15:00 GTX2 GTX1 16:00 neostx 16:00 17:00 18:00 GTX5 dcstx 17:00 18:00 GTX3 GTX4 50%B 18:00 neostx dcstx 7: 渦鞭毛藻の細胞画分から, ろ過法を主体とする精製を経て, 実際に GTX5 と GTX6 を単離した それらについて,NMR と HPLC で純度を確認した 36

13 図 15.GTX6 のクロマトグラムと NMR スペクトル 図 16.GTX5 のクロマトグラムと NMR スペクトル 37

14 3. 中課題 3: 二枚貝代謝物質の精製技術の開発 (1) 成果の概要工程表進捗状況 成果ホタテガイによる PTX2 から PTX6 への変換 in vitro 変換では, 主に外套膜で PTX2 からについて,in vitro および in vivo での条件 PTX1 への変換が確認された ( 図 1) ホタテ検討を行う ( 小課題 1 関連 ) ( 平成 23-2 ガイ由来のジスルフィド結合を持つ分子量 4 年度 ) の異なる少なくとも二種類の分子が関与し, 季節変動が示唆された 貝柱への強制投与による in vivo 変換では,PTX2 の酸化による変換に加えて, 別の物質に変換または分解されている可能性が示唆された ( 平成 23 年度 ) 1 北海道産ホタテガイでは 2 月からは PTX 変換能陽性の個体が現れ始めた その後割合が上昇し,4 月からは 100% となった 北海道産及び青森産 ( 昨年 ) の 7 月ホタテガイでは変換能が確認できたが, 宮城女川産ホタテガイでは 7 月下旬には変換能が確認できなかった 北海道産ホタテガイでも 8 月には変換活性が消失した ( 図 2) 季節変動の要因としては, 餌, 温度, 性周期が考えられる ( 平成 24 年度 ) 1 平成 24 年度 Dinophysis fortii 給餌実験試料の分析の続きと, 新規給餌実験を行った 分析の結果, 中腸腺への蓄積が大半でありホタテガイに含まれていた PTX 群は総給餌量の 70% 程度と妥当な数値であった ( 表 2) しかし,DTX 群については飼育海水中の DTX1 が多く, 総給餌量の 180% 程度にまで増加した 給餌に用いた D. fortii には検出できない DTX 誘導体が含まれると考えられ, 培養海水のアルカリ加水分解試料の測定を 38

15 行ったが,DTX 誘導体は検出できなかった 新規給餌実験では,Dinophysis caudata を,12 枚に対して給餌した ほとんどの貝は 2,3 日目から死亡し始め, 試験期間を通じて生存した貝は 1 枚のみであった 症状としては海水が白く濁り, 貝殻を閉じなくなり, エラがボロボロになった 中腸腺の蓄積量は昨年度の D. fortii 給餌個体に比べて多くなかった しかし, 殺貝成分を含むと考えられる D. caudata の給餌条件と, 何も症状を示さなかった D. fortii 給餌条件での比較は困難である ( 平成 25 年度 ) PTX の変換機構を明らかにし,PTX2 から PTX 代謝物を変換反応により生産するための基礎技術を開発する ( 小課題 1 関連 ) ( 平成 年度 ) ホタテガイの外套膜 PTX 変換能は 48 時間の氷蔵で失われた ( 平成 24 年度 ) ホタテガイへの,in vivo でのプランクトン投与による PTX 変換機構について解析を行った 各試験個体の中腸腺に含まれていた PTX 群は, 表 1の値となった PTX2 が最も少なく,PTX1,PTX3 は同程度含まれ,PTX6 が最も多い割合となった 給餌個体の PTX 群の蓄積率は, 給餌 Dinophysis fortii 細胞から計算された PTX2 換算で % であった 蓄積率が低かった個体 1 は飼育海水中の残存細胞が多い傾向にあり, 個体差と考えられた 蓄積率が低い個体を除くと PTX 群の蓄積率や変換率には性差はあまり無いことが示唆された ( 平成 24 年度 ) *2 前年度のホタテ外套膜抽出条件を見直し,PTX の変換にはシトクロム P450(CYP) の関与が推察されたために, 抽出条件を CYP に最適化し, 調製を簡略化した これにより,PTX2 から PTX6 までの効率的な変換を 39

16 可能にし, また, 調製外套膜の活性を損なわずに冷凍保存することも可能になった 昨年度までとは異なり, 変換活性は活性が見られなくなった夏季にも継続して見られた ( 表 3) 一方で,PTX2 から変換物の生成が常に一定の割合ではないことから, 変換に関わる CYP が単一ではないもしくは変動する可能性が示唆された また, 外套膜に局在する変換活性が, 他の部位に必ずしも見られないわけではなく, 貝柱は本実験の条件では乳化してしまい活性の確認が困難であった 本研究の成果により,PTX 群の変換物の多量調製が可能になった ホタテ外套膜による変換実験の結果から,CYP を主体とする酵素によって PTX 群の変換が行われていることが明らかになったため, 生物体内での酸化還元代謝への関与が明らかにされている CYP とフラビン含有モノオキシゲナーゼ (flavin-containing monooxygenase:fmo) を用いて PTX 群の変換を確認した 本研究ではヒト CYP1A1, 2A6, 3A4, 4F12 とラット CYP1A, 2A1, 3A1, ヒト FMO1,3,5 を試験に用いた 組換え酵素と PTX2 の反応の結果, ヒト CYP3A4 では PTX2 が大きく減少し,PTX1( 図 3) と PTX6 ( 図 4) のチャンネルにピークが現れたが, 溶出時間が異なるために, 正しい変換物ではなかった ラット CYP3A1 でも, ヒト CYP3A4 と同様に PTX1 と同じ分子量を示すが溶出時間が異なるピークが現れた 当所の目的である PTX 群の正しい変換は確認できなかったが, 複数の異性体が生成された 分子構造を解明することにより, 新規の誘導体の生成法として, また, ヒトや動物の体内での代謝産物を明らかにすることが可能になる ( 平成 25 年度 ) 40

17 二枚貝の代謝産物である dcgxt2/3 も含め, 効率よく多種類の麻痺性貝毒類縁体を調製するため, 化学変換反応の条件を最適化する ( 小課題 2 関連 ) ( 平成 年度 ) 麻痺性貝毒類縁体のうち,dcSTX, neostx, GTX5 を, それぞれの前駆物質からチオール試薬を用いて効率的に調製する化学反応条件を設定した ( 図 5) ( 平成 23 年度 ) 3 GTX5 から dcstx を効率よく調製する反応条件を検討した結果,6 N 塩酸溶液で 110,3 時間反応させると, ほぼ 100% の変換率で dcstx を得ることができた これまで,dcSTX は C1/2 から総収率 30% 程度で得られていたものが, ほぼ 90% 以上の収率で調製できるように改良できたうえ, 新規の変換ルートを確立することに成功した ( 平成 24 年度 )( 図 6) 4 前年度に確立した dcstx の調製法の再現性を確認するとともに, 調製スケールでの精製が可能であることを確認した ( 平成 25 年度 )( 図 8) 6 化学反応で得られた生成物について, 自動分自動分取装置 ( アジレント社製 ) にて貝毒を取装置などを使用して, 単離する技術を確立検出するための MS 条件を設定した 成分する ( 小課題 2 関連 ) ( 平成 年度 ) 分離には親水性相互作用のあるカラムを使用した 二種類のカラムを使うことで, それぞれの異性体を単離することが可能となった また, 抽出液を精製するための効率的な前処理として, グラファイトカーボンが充填された固相抽出カートリッジが有効であることを見出した dcstx の反応液を中和して自動分取装置に供したところ, 問題なく成分を単離できることを確認した ( 平成 24 年度 )( 図 7) 5 41

18 前年度に確立した dcstx を実際に調製スケールで自動分取し,NMR と HPLC にて純度を確認した その結果,95% 以上の純度を有していることが判明した ( 平成 25 年度 )( 図 8) 6 成果目標 : 培養株から精製した PTX2 を基質として, 代謝産物 PTX1 および PTX6 へと導くための反応条件 ( 化学的手法, 生化学的手法, 生物学的手法など ) を検討し,PTX1 や PTX6 を生成させる技術を確立する 有毒ラン藻や渦鞭毛藻が生産する毒成分を基質として, ほかの主要成分へと導くための反応条件 ( 化学的手法, 生化学的手法 ) を検討し, 主要毒を全て調製できる技術を確立する < 成果の概要の補足 > 1: 外套膜と貝柱で PTX2 から PTX1 への変換が確認された DTT( ジチオスレイトール ) を加えると外套膜での変換は約 1/4 に, 貝柱では消失した 中腸腺で見られた PTX6 は DTT による影響を受けなかった 図 1.in vitro 変換 : ホタテガイ部位による PTX2 の変換 (μg) PTX1 PTX6 PTX1 PTX6 PTX1 PTX6 PTX1 PTX6 PTX1 PTX6 PTX1 PTX6 PTX1 PTX6 PTX1 PTX6 PTX1 PTX6 PTX1 PTX6 エラ 外套膜 貝柱 中腸腺生殖腺 DTT 入 エラ DTT 入外套膜 DTT 入貝柱 DTT 入中腸腺 DTT 入生殖腺 42

19 図 2. ホタテガイ外套膜の PTX2 変換活性 図 3.PTX1 異性体 43

20 図 4.PTX6 異性体 2: ホタテガイに PTX2 を生産する Dinophysis を給餌することにより, ホタテガイ代謝毒である PTX1,PTX4,PTX6 を効率的に生産できる可能性が見出された ( 次頁へ ) 表 1.Dinophysis 給餌試験におけるホタテガイ中腸腺当たりの毒量 (µg) PTX2 PTX1 PTX3 PTX6 合計 蓄積率 % % % コントロール

21 表 2.D. fortii 給餌試験におけるホタテガイ当たりの毒量 (µg) 表 3. 調製外套膜による PTX 変換活性 3:dcSTX は dcgtx2/3 を前駆物質として化学誘導した neostx は GTX1/4 を前駆物質として化学誘導した GTX5 は C1/2 を前駆物質として化学誘導した 赤字 : 平成 23 年度に達成した化学反応条件とその収率 黒字 : 既報の反応条件とその収率 DTT: ジチオスレイトール, NH4HCO3: 重炭酸アンモニウム 45

22 図 5. 麻痺性貝毒類縁体の調製スキーム ラン藻 Anabaena circinalis C1 C2 0.1 M Phosphate buffer (ph 6.0) 75 o C, 1.0hr Yield: 30 40% dcgtx2 dcgtx3 1% DTT 1% NH 4 HCO 3 aq. r.t., 1.0hr Yield: 90% < dcstx 1% DTT 1% NH 4 HCO 3 aq. 50 o C., 1.0hr Yield: 90% < GTX5 0.1M HCl aq. Yield: 90% < GTX2 GTX3 渦鞭毛藻 GTX1 GTX4 GTX5, GTX6 1% DTT 1% NH 4 HCO 3 aq. 50 o C., 1.0hr Yield: 90% < neostx 4:GTX5 を前駆物質として,dcSTX を効率的に調製できる, 新規変換ルートを確立した これによって, 二枚貝代謝物の一つである dcstx を効率よく調製する反応経路を確立した ( 次頁へ ) 図 6.GTX5 から dcstx の効率的な変換ルート 0.1M KPB ph7.0, 75 C, 1h 30-40% dcgtx2 dcgtx3 1% DTT 1% NH 4 HCO 3 aq. r.t, 1h 94% 総収率 90%< dcstx ラン藻 Anabaena circinalis (CS-541/04) C1/C2 1% DTT 1% NH 4 HCO 3 aq. 50 C, 1h 100% GTX5 新規変換ルートを確立 6N HCl aq. 110 C, 3h 116% 0.1M HCl aq. 100 C, 5min 100% GTX2 GTX3 -ME 15 min 100% STX 渦鞭毛藻 Alexandrium tamarense GTX1 GTX4 1% DTT 1% NH 4 HCO 3 aq. 50 C, 1h 100% neostx 46

23 5:dcSTX の反応液を重炭酸アンモニウムで中和した溶液をそのまま, 自動分取装置に供したところ, 問題なく生成物を単離することが可能であることが分かった 図 7.GTX5 の精製とそのクロマトグラム GTX5 UV クロマトグラム (210nm) 6N HCl 110 C, 3 hrs 収率 :116% dcstx 反応液重炭酸アンモニウムを添加中和 自動分取装置による精製 TSKgel Amide 80 カラム移動相比率 : 50%B MS クロマトグラム dcstx 6:GTX5 から化学変換によって, 実際に dcstx を調製した それについて,NMR と HPLC で純度を確認した 47

24 図 8. 単離した dcstx の NMR スペクトルとクロマトグラム Ⅲ. 主要な成果 1. 成果の内容 1) 貝毒生成プランクトンの培養株の検索と大量培養条件等の検討下痢性貝毒 DTX1 及び脂溶性貝毒 PTX2 の原料として細胞当たりの毒含量が高い D. fortii を単離した (p.9) また,PTX2 を大量に生産する D. caudate を単離して大量培養条件を確立した (p.10) 下痢性貝毒 OA,DTX1 の精製のために既存株である P. lima 株 (PL197) の大量培養条件の再現性を確認するとともに, 安定的に OA と DTX1 を製造できることを確認した (p.11) 麻痺性貝毒生産プランクトンにおいては,A. tamarense から GTX1,GTX4 成分のための候補株, G. catenatum から GTX5,GTX6 のための候補株を選抜した (p.9-10 ) さらにこれらの株について大量培養技術を確立した(p.11-12) 2) 貝毒標準物質の抽出 精製技術の開発下痢性 脂溶性貝毒生産藻類から OA,DTX1 及び PTX2 を精製するための前処理条件やカラムスイッチングバルブとオートインジェクタによる連続自動精製システムを市販装置の組み合わせにより考案した (p.24-25) 麻痺性貝毒の精製においては, 現在, 製造中止により市販品の入手ができない特殊な樹脂を使用しない代替となる精製手順を考案するなど新たな効率的前処理手順を考案するとともに, 新たに膜ろ過による精製手順を考案するなど (p.26), 麻痺性貝毒の 48

25 精製手順を簡略化することに成功した また, 市販自動分取装置を利用した精製システムを構築した (p.26-27) 当初計画には含まれていない研究成果としては, 精製した貝毒標準品の高精度な値付け法に関する基礎的知見を得た (p.25) 3) 二枚貝代謝物質の精製技術の開発下痢性 脂溶性貝毒において国内ホタテガイの主要毒であり代謝毒である PTX6 を製造するために, 有毒プランクトンが生産した PTX2 をホタテガイ酵素により初めて PTX6 まで変換する条件を見出した (p.38-39) 麻痺性貝毒類縁体のうち,dcSTX, neostx, GTX5 を, それぞれの前駆物質から効率的に変換させる化学反応条件を確立することに成功した (p.40) 2. 成果の活用本事業で得られた技術は 今後貝毒標準品の製造等に活用することができる Ⅳ. 論文 特許等の実績等別紙のとおり 49

26 論文 特許等の実績等 別添 学術論文 タイトル 著者名 学会誌名 巻 ページ 発行年月 機関名 Nagai S, Suzuki T, Nishikawa T, Kamiyama T. Differences in the production and excretion kinetics of okadaic acid, dinophysistoxin-1, and pectenotoxin-2 between cultures of Dinophysis acuminata and D. fortii isolated from western Japan. Journal of Phycology 47: (2011). Suzuki T, Quilliam M.A. LC-MS/MS Analysis of Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP) Toxins, Okadaic Acid and Dinophysistoxin Analogues, and Other Lipophilic Toxins. Analytical Sciences 27: (2011) 鈴木敏之ほか国内外の貝毒監視体制の現状と今後の動向, 食品衛生学雑誌, 54(3): Nagai S, Suzuki T, Kamiyama T. Successful cultivation of the toxic dinoflagellate Dinophysis tripos (Dinophyceae). Plankton & Benthos Research 8: (2013). 口頭発表 タイトル 発表者名 学会等名 発表年月 機関名 非動物試験による貝毒検査に向けた貝毒標準品安定供給技術の開発. 渡邊龍一. 第 9 回 シーフードショー大阪 第 17 回技術交流セミナー.2012 年 2 月麻痺性貝毒プランクトンの毒成分組成と大培養に向けた培養法の検討. 及川寛 長井敏 神山孝史 渡邊龍一 鈴木敏之. 平成 24 年度日本水産学会春季大会.2012 年 3 月. 麻痺性貝毒原因プランクトンの培養による貝毒標準品製造. 及川寛 長井敏 神山孝史 渡邊龍一 鈴木敏之. 平成 24 年度東北ブロック水産業関係研究開発推進会議貝毒研究分科会.2012 年 11 月. 麻痺性貝毒標準品製造のための Alexandrium tamrense 大量培養. 及川寛 渡邊龍一 鈴木敏之. 平成 25 年度日本水産学春季大会 2013 年 3. 脂溶性貝毒ペクテノトキシン群の細胞毒性. 菊次沙織 松嶋良次 渡邊龍一 内田肇 内田直行 村田昌一 安元健 鈴木敏之. 平成 25 年度日本水産学会春季大会.2013 年 3 月. 1

27 ホタテガイにおける脂溶性貝毒 PTX2 の変換反応. 松嶋良次 菊次沙織 渡邊龍一 金森誠 馬場勝寿 高坂佑樹 鈴木敏之. 平成 24 年度東北ブロック水産業関係研究開発推進会議資源生産部会貝毒研究分科会 ( 赤潮 貝毒部会東日本ブロック ). 平成 24 年 11 月. 麻痺性貝毒標準品の安定供給に向けた精製法および化学変換反応の効率化,. 原田知子 渡邊龍一 及川寛 松嶋良次 鈴木敏之. 平成 25 年度日本水産学会春季大会, 2013 年 3 月. Preparation of saxitoxin analogues by chemical derivatization.harada T, Watanabe R, Oikawa H, Matsushima R and Suzuki T. The XV international conference on Harmful algae. Changwang, Korea, Oct Quantitative NMR analysis using an electronic signal in the preparation of reference materials of marine biotoxins. Watanabe R. Matsushima R, Harada T, Yasumoto T, Suzuki T. The XV international conference on Harmful algae. Changwang, Korea, Oct Accumulation and transformation of paralytic shellfish toxin by pen shell Atrina pectinata. Oikawa H, Matsuyama Y. The XV international conference on Harmful algae. Changwang, Korea, Oct 麻痺性貝毒成分の分析用標準品製造のための Gymnodinium catenatum 大量培養の検討. 及川寛 渡邊龍一 鈴木敏之. 平成 25 年度日本水産学秋季大会.2013 年 9 月. Dinophysis fortii 給餌ホタテガイにおける脂溶性貝毒の動態 松嶋良次 長井敏 内田肇 渡邊龍一 平野和夫 永井宏史 安元健 鈴木敏之平成 25 年度日本水産学会秋季大会.2013 年 11 月 Dinophysis fortii 給餌ホタテガイにおける脂溶性貝毒の動態解析 松嶋良次 長井敏 内田肇 渡邊龍一 金森誠 馬場勝寿 鈴木敏之平成 25 年度東北ブロック水産業関係研究開発推進会議資源生産部会貝毒研究分科会 ( 赤潮 貝毒部会東日本ブロック ) ホタテガイにおけるペクテノトキシン群の in vitro 変換 松嶋良次 内田肇 渡邊龍一 菊次沙織 永井宏史 鈴木敏之平成 26 年度日本水産学会春季大会.2014 年 3 月 沖縄本島沿岸域における渦鞭毛藻 Prorocentrum lima の分布観測とその培養法 吉野敦 第 15 回マリンバイオテクノロジー学会大会 ( 沖縄 ) 2013 年 6 月 下痢性貝毒標準品作製を目的とした渦鞭毛藻 Prorocentrum lima によるオカダ酸生産優良株の探索と大量培養条件の検討 吉野敦 鈴木敏之 安元健 平成 25 年度日本水産学会秋季大会 ( 三重 ) 2013 年 9 月 下痢性貝毒原因生物. 平成 25 年度日本水産学会秋季大会水産環境保全委員会研究会有害有毒プランクトンの分類 生理 生態 生活史 個体群動態. 長井敏 鈴木敏之 神山孝史, 講演要旨集, 東京海洋大学, 平成 25 年 9 月 22 日. 2

28 出版図書区分 ;1 出版著書 2 雑誌 3 年報 4 広報誌 5その他区分著書名 ( タイトル ) 著者名 出版社名 発行年月 機関名 1 1 Suzuki T. Chemistry and detection of okadaic acid/dinophysis toxins, pectenotoxins, and yessotoxins in Toxin and biologically active compounds from microalgae ed by G.P. Rossini,, April 5, 2014 (Science Publishers) Suzuki T. et al., Chemistry, metabolism and detection of pectenotoxins and yessotoxins in Seafood and freshwater toxins 3rd edition ed by L.M. Botana, March 18, 2014 (Taylor and Francis) 国内特許権等 特許権等の名称 発明者 権利者 ( 出願人等 ) 特許権等の種類番号出願年月日取得年月日機関名 国際特許権等 特許権等の名称 発明者 権利者 ( 出願人等 ) 特許権等の種類 番号 出願年月日 取得年月日 機関名 3