3 SCN1A ips 2. SCN1A ips SCN1A GABA ips

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1 1 ips 1% 3 SCN1A 2 ips 3 ips ips ips Molecular Brain 5 2 ips 1. 1% 8

2 3 SCN1A ips 2. SCN1A ips SCN1A GABA ips

3 ips 3. GABA ips ips 4. A human Dravet syndrome model from patient induced pluripotent stem cells ips Norimichi Higurashi, Taku Uchida, Lossin Christoph, Yoshio Misumi, Yohei Okada, Wado Akamatsu, Yoichi Imaizumi, Bo Zhang, Kazuki Nabeshima, Masayuki X. Mori, Shutaro Katsurabayashi, Yukiyoshi Shirasaka, Hideyuki Okano, Shinichi Hirose higijh.n@gmail.com

4 SCN1A 3 ips Induced pluripotent stem cell ips cell 2006 (1) ES : pluripotency Oct4, Sox2, Klf4, c-myc 4 ips ( ) 1 Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K. and Yamanaka, S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 131,

5 世界に先駆先駆けててんかんの ips 細胞を作成 今後の難治難治てんかんのてんかんの病態解明病態解明 治療薬開発治療薬開発に期待 日暮憲道 1,2,3, 内田琢 2, LossinChristoph 4, 三角佳生 5, 岡田洋平 6,7, 赤松和土 6, 今泉陽一 6, 瀬川波子 8, 鍋島一樹 9, 森誠之 10, 桂林秀太郎 11, 白坂幸義 12, 岡野栄之 6, 廣瀬伸一 1,2 1 福岡大学医学部小児科, 2 福岡大学てんかん分子病態研究所, 3 東京慈恵会医科大学小児科, 4 カリフォルニア大学神経科, 5 福岡大学医学部細胞生物学, 6 慶應義塾大学医学部生理学, 7 慶應義塾大学咸臨丸プロジェクト, 8 福岡大学医学部生化学, 9 福岡大学医学部病理学, 10 福岡大学医学部生理学, 11 福岡大学薬学部神経薬理学, 12 しらさかクリニック

6 てんかんてんかん とは 繰り返す てんかん発作 を特徴とする脳の状態で 様々な疾患を含みます 8 割の患者様は 小児期に発症しています てんかん発作は全身をガクガクさせるだけではなく ぼーっと反応しなくなるだけのものや 瞬間的に全身をビクッとさせるものなど 症状は非常に多彩です 多くは1 剤 あるいは少数の薬剤の組み合わせにより発作を抑えることが出来ますが 3 割の患者様患者様は内服薬内服薬で発作発作を抑えられない 難治難治てんかんてんかん を患っていますっています そのようなてんかんでは 外科治療 栄養療法 その他いくつかの特殊な治療法も試みられていますが 未だ多くの患者様を救うことは出来ていません

7 てんかんのてんかんのてんかんのてんかんの原因原因原因原因 脳の神経細胞は その電気活動によって情報をやりとりしていますが 電気活動の興奮と抑制のバランスが正常な脳機能を維持するのに重要です てんかんではこのバランスが崩れ 興奮しやすい状態になることで発症すると考えられています 遺伝子異常脳障害 原因は様々ですが 近年 原因の遺伝子異常が徐々に明らかにされてきています そのそのそのその代表代表代表代表が SCN1A 遺伝子遺伝子遺伝子遺伝子 の異常異常異常異常で ドラベドラベドラベドラベ症候群症候群症候群症候群 と呼ばれるれるれるれる乳児乳児乳児乳児に発症発症発症発症するするするする難治難治難治難治てんかんのてんかんのてんかんのてんかんの原因原因原因原因となります 興奮抑制正常脳興奮抑制てんかん脳形成異常その他

8 ドラベドラベ症候群症候群 と病因 重度のてんかん発作のみならず 知的障害 運動障害 行動異常なども伴う 大変重いてんかんです その原因となる遺伝子である SCN1A 遺伝子からは 神経細胞の活動に重要なナトリウムチャネルという物質が作られますが マウスの研究では 脳の抑制機能を担う神経細胞に存在しているので この遺伝子の異常によって 脳の抑制能力が弱くなって てんかんが発症すると考えられています ただし 人間とマウスとでは違いますので 実際の患者の病態は 患者の脳神経細胞を使って研究することが望ましいですが 実際にはできません そこで この遺伝子の異常があるドラベ症候群の患者からiPS 細胞を作り 神経細胞へ分化し 解析を行うことにしました しかししかし これまでにてんかん患者患者からから作った ips 細胞の研究報告研究報告はありませんでしたはありませんでした

9 ドラベ症候群患者由来 ドラベ症候群患者由来iPS細胞 症候群患者由来 細胞の 細胞の樹立 と神経細胞の 神経細胞の分化誘導 ③ ② 分化 誘導 患者由来iPS細胞 山中4因子 導入 ① 患者由来分化神経細胞 神経細胞マーカー 神経細胞マーカー グリア細胞 グリア細胞マーカー 細胞マーカー* 患者由来皮膚線維芽細胞 *グリア細胞は神経細胞ではありませんが 脳に存在し神 経細胞が生きて活動するのに重要な細胞です

10 分化したした神経細胞神経細胞のうちのうち Na v 1.1を発現発現する細胞の多くがくが抑制性神経細胞 GAD67 Na v 1.1 重ね合わせ画像 Na v 1.1はSCN1A 遺伝子によってによって作られるナトリウムチャネルをられるナトリウムチャネルを指しますします GAD67は GABA 作動性神経細胞に発現発現するする物質物質で 抑制性神経細胞抑制性神経細胞であることをであることを示しますします 写真を重ね合わせると Na v 1.1( 赤 ) の多くが GAD67( 黄緑 ) と重なって黄色くなっていることが確認できます つまり Na v 1.1 発現細胞のうちのうち 半数以上半数以上が抑制性神経細胞であることがわかりましたであることがわかりました

11 SCN1A 発現レポーターのレポーターの作成 SCN1Aを発現する神経細胞がどれかは そのまま細胞をみてもわかりません しかし 電気活動をみるためには それがわかる必要があります そこで 神経細胞が生きた状態で その細胞を選択できるレポーターを作成し ウイルスにより細胞に入れました レポーターウイルス SCN1A プロモーター ATG Venus 感染 発光している細胞 : 5 - 非翻訳エクソン : 5 - 第一コードエクソンの 5 非翻訳領域 分化成熟 レポーターの構造 SCN1A 遺伝子を発現する細胞で Venus と呼ばれる蛍光物質を作らせることを可能にします 分化神経細胞ウイルスを用いてレポーター構造構造を細胞細胞へ導入 SCN1A 遺伝子発現細胞が Venus によりで発光 活動電位を誘発 蛍光を確認した細胞のうち 成熟した神経細胞を選んで電気生理解析

12 レポーターの蛍光蛍光のあるのある細胞細胞における Na v 1.1 発現 Venus Na v 1.1 Merge レポーターによる Venus の検出には 抗 GFP 抗体を用いています SCN1A のレポーターの蛍光蛍光が検出検出できたできた細胞細胞のうちのうち 多くのくの細胞でNa v 1.1の発現発現が確認確認できましたできました つまりつまり このレポーターがしっかりと目的目的の細胞細胞を検出検出していることをしていることを意味意味していますしています

13 ips 細胞からから分化分化させたさせた神経細胞神経細胞における活動電位の誘発 コントロール ドラベ症候群 ドラベ症候群の神経細胞では 正常人由来のものと比べ 誘発される電気活動 ( 活動電位 左図の尖った波形 ) の高さが次第に低くなり この電気活動の数も少ないことがわかりました

14 本研究のまとめ 難治てんかんの患者から ips 細胞を作りました てんかんの ips 細胞から分化させた神経細胞では 電気活動の能力が弱くなっていることがわかりました ips 細胞から分化させた神経細胞は 多くが未熟で 細胞毎の特性のバラツキが大きいため これまで機能の解析は困難でしたが 我々の用いた方法により その機能の異常を確認することが出来ました この研究結果は ドラベ症候群が GABA 作動性抑制性神経細胞の機能が減弱することにより発症する という これまでの知見を支持するものでしたが 我々は世界に先駆けて これを実際の患者様に由来した神経細胞で確認しました

15 本研究の今後今後の展望 今回の結果によって 今後のてんかん研究で ips 細胞を使って研究をすることが役に立つ可能性が分かりました 今回は抑制性神経細胞で その機能障害を確認しましたが 脳には様々な種類の神経細胞があります 今後は様々な種類の神経細胞について それぞれの機能を解析していくことが重要です これによって 将来的には これまでマウスを使った研究ではわからなかった 患者様の脳内のみで起こっている 重要なてんかんのメカニズムを発見することが可能となりますので これまでにない新薬の開発に大きく役立つことが期待されます

を行った 2.iPS 細胞の由来の探索 3.MEF および TTF 以外の細胞からの ips 細胞誘導 4.Fbx15 以外の遺伝子発現を指標とした ips 細胞の樹立 ips 細胞はこれまでのところレトロウイルスを用いた場合しか樹立できていない また 4 因子を導入した線維芽細胞の中で ips 細

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