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なおみおか
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1 技術論文ラテックス凝集法によるリコンビナント抗原を用いた梅毒 T 抗体試薬の検討小林一三 1) 和久井萌 1) 1) 大阪赤十字病院臨床検査科部要山本裕之 1) 田崎亜矢子 1) 大阪府大阪市天王寺区筆ヶ崎町 5-30 旨当院ではラテックス凝集法のメディエース TLA 極東製薬を使用してきたが偽陽性率が高く乳びや溶血の影響があった 3 社富士レビオデンカ生研シノテストのリコンビナント抗原を用いた T 抗体試薬を用いて測定を行った結果再現性プロゾーン試験などで良好な結果であった感度特異度が高く法に匹敵する特異度を持っていた菌体精製抗原を用いた T 抗体試薬にかわってリコンビナント抗原を用いた T 抗体試薬が使用されることによって T 抗体中和試験や他法で確認する機会が減ることが期待されるキーワードラテックス凝集法偽陽性率リコンビナント抗原菌体精製抗原梅毒 T Treponema pallidum 抗体試薬は原理や使用する抗原が異なるものが多数発売されているまれている可能性がある今回我々はリコンビナント抗原を用いた汎用機 1990 年に自動分析装置で測定可能なラテックス凝集器用の T 抗体試薬を用いて測定を行いその有用法による試薬の開発が報告され最近では化学発性について検討したので報告する 1) 光酵素免疫測定法やイムノクロマト法による試薬も使用されている 2), 3) I 対象及び方法当院では 2002 年よりラテックス凝集法のメディエース TLA 極東製薬以下極東を使用してき 1 対象たが 2011 年 9 月から 2012 年 11 月までの 1 年 3 ヶ 2012 年 2 月から 9 月の間に当院の梅毒検査で T 月間に提出された検体 18,690 件を調査した結果 T 抗体又は RR が判定保留もしくは陽性になった 128 抗体陽性率 2.% 偽陽性率 0.6%となりこれは陽例無作為抽出検体 111 例乳び検体 107 例特異性検体全体の 19.%が偽陽性を示すこととなり中性の検討のために自己免疫疾患検体など 9 例関節和試験が他の測定方法と不一致になる例も認められリウマチ 19 例全身性エリテマトーデス 6 例原発たさらに他施設の報告でも T 抗体陽性率 1.1 性胆汁性肝硬変 17 例免疫グロブリン異常症など 7 1.% 偽陽性率 0.22%という報告もなされている例を対象としたこれらについてはルーチン検メディエース TLA は菌体成分を抽出精製した抗査後に 80 で凍結保存した検体を融解し測定した ) 原を使用しており菌体の様々な分子量の蛋白が含まれている菌体培養抗原を使用した場合に比べて 2 測定機器および試薬機器は自動分析装置 BM800 日本電子を用いリコンビナント抗原を使用した場合の方が特異性のた評価対象の T 抗体測定試薬にはラテックス高い反応になっているという報告があり使用す凝集法の A ラピディアオート T 富士レビオ以る培養抗原によっては T に特異的でない蛋白が含下レビオ B LASAY オート TAb デンカ生研 5) 平成 25 年 10 月 7 日受付平成 26 年 7 月 28 日受理 75 81

2 Comparison among treponema pallidum antibody assays Table 1 Test name RAIDIA Auto T LASAY auto TAb Accuras Auto TAb Mediace TLA Distributor FUJI Seiken -TEST Manufacturer SHIMA Laboratories SHIMA Laboratories -TEST SEKISUI MEDICAL recombinant antigens recombinant antigens recombinant antigens antigens prepared from purified bacterial cells TpN7, TpN15 17 TpN7, TpN15 17 TpN7, TpN17 T.U. less than 5 less than 10 less than 0.5 less than 10 T.U. Indeterminant less than 10 but 5 or more less than 20 but 10 or more less than 1.0 but 0.5 or more less than 20 T.U. but 10 T.U. or more 10 or more 20 or more 1.0 or more 20 T.U. or more Neutralization test 80% or more 70% or more 50% or more 10/ /2010 8/2006 6/1993 Antigen Criteria Launch date T 抗体試薬の抗原や単位判定基準などを比較したものを表にした Table 2 Within-run precision test (n = 20) Sample A Mean SD CV (%) Sample B Between-run precision test (n = 5) Sample A Mean SD CV (%) Mean SD CV (%) Sample B Mean SD CV (%) 2 種類のプール血清を使って同時再現性と日差再現性を示した以下デンカ C アキュラスオート T 抗体シノた各社の測定単位は異なり判定基準は添付文書テスト以下シノと比較対照試薬として D メディ通りとしたなお極東は極東推奨の判定保留域をエース TLA 極東を用いた梅毒検査陽性検体設けたが本検討ではすべての試薬について判定保については ① 法日本凍結乾燥研究留を陽性として一致率を求めた Table 1 また所イムノクロマト法の② エスプライン T レプロゾーンチェックは各社推奨のパラメータを使ビオ粒子凝集法の③ セロディア-T A レビ用したオ以下 T-A 化学発光酵素免疫法の④ ルミパルスプレスト T レビオ以下 L- T ⑤ ウ II 結果エスタンブロッティング法 MIKROGEN 以下 WB 法 ⑥ 極東 ⑦ デンカ ⑧ シノの中和試験及 1 同時再現性び⑨ メディエース RR 極東 ⑩ ラピディア 2 濃度のプール血清を用いて評価対象 3 試薬でオート RR レビオ ⑪ LASAY オート RR デ 20 回測定した変動係数は 3%以内で良好であっンカ ⑫ RR テスト三光エーディアを用いた Table

3 2 日差再現性 0.0 転倒混和及びキャリブレーションを行わず 5 日間測定した変動係数は % 以内で良好であった Table 2 3 希釈直線性直線性試料や陽性患者血清を生理食塩液で 1/10 倍から原液まで 1/10 倍きざみで希釈系列を作り測定した Measured value 2 濃度のプール血清を用いて評価対象 3 試薬で 30.0 ﬁrst time second レビオは 500 デンカは 500 まで直線性が得られたシノは理論値 15 を超える濃度 0.0 から許容範囲より 10%以上はずれ標準液の最高濃 0/10 2/10 度 20 まで直線性が得られなかった Figure 1 プロゾーン試験 /10 6/10 8/10 10/10 Dilution Ratio Figure 1 Lineality test 極東での測定値が 32,000 T.U.の検体を原液で測定したところレビオとデンカは若干の測定値の減少シノの直線性を図示し理論値 15 を超える濃度から許容範囲より 10%を超え標準液の最高濃度 20 まで直線性が得られなかったことを示したとは二重測定が確認されたが測定範囲である 500 以下まで測定値が減少することはなかったシノは理論値ビリルビン F 19. mg/ml ビリルビン C を超える濃度からフック現象が生じた mg/ml 溶血ヘモグロビン 91 mg/ml 乳び 1,10 が常にプロゾーンチェック機能により判別するこ FTU リウマトイド因子 I 自製溶血ヘモとができた Figure 2 なお基準とした極東での本グロビン 500 mg/ml まで検討した 3 試薬ともに検試料の測定値は 29.9 T.U.を示しプロゾーンチェッ討した濃度では影響がみられなかったなお基準とした極東は自製溶血ヘモグロビン 500 クが機能しなかった mg/ml で 59%の正誤差となった干渉チェック A プラス及び干渉チェック RF シスメックスと自製溶血ヘモグロビンを用いて ﬁrst second 0/10 1/10 2/10 3/10 /10 5/10 6/10 7/10 8/10 9/10 10/ Error theoretical reduced value value 検出限界 2.6SD 法で 10 回測定し 0 濃度と区別できる調製 0.0 Measured value 5 共存物質の影響 rozone 0.0 0/10 2/10 /10 6/10 Dilution Ratio 8/10 10/10 Figure 2 rozone phenomenon シノはフック現象が生じたが常にプロゾーンチェック機能により判別することができたプロゾーンチェックは 3/10 より機能したとは二重測定 77 83

4 Table 3 Concordance rate between test and,,, concordance rate 70/7 = 9.6% concordance rate /5 = 88.9% concordance rate /128 = 92.2% concordance rate 72/76 = 9.7% concordance rate /52 = 92.3% 8 52 concordance rate /128 = 93.8% concordance rate 75/105 = 71.% concordance rate /23 = 95.7% concordance rate = 5 or more = 0.5 or more = 10 or more = 10 T.U. or more 法とレビオデンカシノ極東の一致率を求めた concordance rate 65/73 = 89.0% concordance rate /55 = 80.0% concordance rate /128 = 85.2% /128 = 75.8% 52 Table Concordance rate between and,, concordance rate 75/77 = 97.% concordance rate /211 = 83.% concordance rate /288 = 87.2% concordance rate 7/76 = 97.% concordance rate /212 = 83.0% concordance rate /288 = 86.8% concordance rate 75/79 = 9.9% concordance rate /209 = 83.3% concordance rate /288 = 86.5% = 5 or more = 0.5 or more = 10 or more = 10 T.U. or more 極東とレビオデンカシノの一致率を求めた試料の理論値を検出限界値とした検出限界値はレであり基準とした極東は 79.7%であったまた上ビオとデンカは 3.0 シノは 0.2 であった記 128 例に無作為抽出検体と自己免疫疾患検体など 7 法イムノクロマト法極東との比較を加えた 288 例での極東との全体一致率はレビオ T 抗体又は RR が判定保留もしくは陽性になっ 87.2% デンカ 86.8% シノ 86.5%となり参考までた 128 例を用いて法イムノクロマトに T-A 86.8% L- T 85.1%であった極東との法極東とリコンビナント 3 法を比較した FTA- 比較の表 Table を示すなお無作為抽出検体と ABS 法との全体一致率はレビオ 92.2% デンカ自己免疫疾患などの検体の偽陽性率に差は認めな 85.2% シノ 93.8%であったなお基準とした極東はかった 75.8%であった Table 3 イムノクロマト法との全 8 乳び検体の検討体一致率はレビオ 93.0% デンカ 85.9% シノ 96.1% 8 78 ホルマジン濁度 700 1,130 FTU の中等度乳び 36

5 Table 5 No. False-positive cases only in diagnosis Anti-T antibody TA L- T Neutralization test result immunoch romato result NT (+) NT T.U.or more 5 or more more L- T 1.0 or more NT not tested 極東のみが偽陽性になった 21 例を示した 10 or more 0.5 or 例では社ともに全例が陰性であった強乳び検体これらについては偽陽性は他法にて陰性である 71 例のうち極東は 30 例シノは 23 例デンカは 3 ことを確認し偽陰性はすべて梅毒の既往であった例が偽陽性レビオは全例が陰性であった極東のみ偽陽性の 21 例 Table 5 とそれ以外の偽 9 偽陽性と偽陰性陽性と偽陰性の 23 例 Table 6 を示す臨床症状法や WB 法の結果等から梅 10 感度特異度毒非梅毒と確定診断が可能であった 128 例につい梅毒疾患と確定された患者 80 例を含む全対象症て各試薬の結果を比較すると 31 例が非梅毒のな例 288 例を用いての感度特異度はレビオは感度かで偽陽性の結果となり 13 例が梅毒のなかで偽陰 92.5% 特異度 98.6% デンカは感度 85.0% 特異度性の結果となったその内訳は偽陽性 31 例につい 96.2% シノは感度 92.5% 特異度 98.1%であったては極東で 30 例レビオで 3 例デンカで 7 例シ Table 7 なお基準とした極東は感度 97.5% 特異ノで 3 例であった偽陰性 13 例については極東で 2 度 8.6%であった例レビオで 6 例デンカで 11 例シノで例であったなお偽陽性偽陰性は重複する場合がある III 考察ので合計数は一致しないまた今回検討を行なった梅毒検査陰性例を含む全症例である 288 例での検リコンビナント抗原を用いたラテックス凝集法に討における偽陽性/陽性率はレビオ 3.9% デンカよる T 抗体測定試薬であるレビオデンカシノ 10.5% シノ 5.1%であり基準とした極東は 29.1% はシノの希釈直線性に問題はあるが再現性プであったロゾーン試験など基本性能に問題なく臨床的にも 79 85

6 Table 6 False-positive and false-negative cases except for false-positive cases only in No. diagnosis Anti-T antibody WB WB WB immunochromato Neutralization test TA L- T result IgG IgM Tp7 Tp (+) 1. (+) anamnestic 7, 15, (+) 1.8 (+) anamnestic 7, 15, (+) 2.7 (+) anamnestic 7, 15, 17 7(?) ± (+) anamnestic 7 TmpA ± (+) 0. anamnestic ± (+) ± (+) anamnestic 7, 15, 17, 257, ± (+) 2.1 (+) + + NT ± (+) anamnestic 7, NT 31 ± nonspecific TmpA, 53 + NT ± (±) 0.5 anamnestic TmpA, ± (+) anamnestic 17, 257, nonspecific NT (+) anamnestic NT anamnestic 15, negative NT negative nonspecific TmpA TmpA negative negative 0.2 :10 T.U. or more :5 or more :10 or more :0.5 or more L- T :1.0 or more WB7:TpN7 NT:not tested 極東のみが偽陽性になった例を除いた偽陽性と偽陰性の 23 例を示した. Table 7 Sensitivity Specificity Sensitivity 7/80 = 92.5% Specificity 205/208 = 98.6% ostive likelihood ratio 6.13 False-negative rate 7.5% False-positive rate 1.% Sensitivity 68/80 = 85.0% Specificity 200/208 = 96.2% likelihood ratio False-negative rate 15.0% False-positive rate 3.8% Sensitivity 7/80 = 92.5% Specificity 20/208 = 98.1% ostive likelihood ratio 8.9 False-negative rate 7.5% False-positive rate 1.9% Sensitivity 78/80 = 97.5% Specificity 176/208 = 8.6% ostive likelihood ratio 6.3 False-negative rate 2.5% False-positive rate 15.% = :5 or more = :0.5 or more = :10 or more = :10 T.U. or more 各試薬の感度と特異度を示した. (86)750

7 感度と特異度が高く日常検査において信頼性の高陽性率は大幅に改善されたい試薬であった 3 試薬を比較するとレビオとシノ極東で T 抗体が陽性になった検体を中心としたの感度特異度はデンカに比べて高く直線性が良対象例での比較であるので公平さには欠けるが今く乳びの影響がないレビオが 1 番優れた試薬であっ回の検討から極東の特異度は明らかに低いことが判たなおリコンビナント抗原を用いた T 抗体試薬明したに変更する際には一部の梅毒既往患者が陰性になることや Table 6 の No. 36 検体のように TpN17 抗体 IV 結語のみ検出される場合は陽性になる場合があることなどを理解しておく必要がある一方従来法である極東は菌体精製抗原を用いた試薬のため T 抗原の精製度合いが良くなければリコンビナント抗原を用いた T 抗体試薬は菌体精製抗原を用いた T 抗体試薬と比べて偽陽性が少なく有用な試薬であることを確認した培養動物由来の非特異反応が発生する可能性があ T 抗体試薬はメーカーごとに使用する抗原が異りまた T 抗体試薬と T 抗体中和試験に同じ抗原なりリコンビナント抗原を使用した試薬でも使用を使用した場合には T 抗体中和試験では抗原由来抗原やその使用割合が異なり反応条件等も異なるの非特異反応を回避できないという弱点をもつさまた単位が同じでも判定基準が異なる等の問題があらにプロゾーンチェックがかからず T 抗体価が低る今後は T 抗体試薬の単位を統一しリコンビ値になっている場合は T 抗体中和試験は偽陰性とナント抗原の種類や割合を同じにすることでどの試なる危険性を有しているそのため極東で陽性に薬を使用しても同じような値が出るように試薬メーなった場合は T 抗体中和試験のみならずイムノカーの努力を期待したいクロマト法や法等で確認する必要があるのが現状であるそのほか従来より乳び検体での影響についても報告されており 6) 本検討でも強乳び検体はレビオ以外の試薬での影響が認められた今回の 288 例を用いた検討では極東の偽陽性陽性率は 29.1%であった一方でレビオが 3.9% デンカが 10.5% シノが 5.1%となったことよりリコンビナント抗原を用いた 3 社の T 抗体試薬に変更することで T 抗体中和試験や他法で確認する機会が減ると考える当院では現在レビオに試薬変更したことで 2013 年月から 201 年月までの 1 年 1 ヶ月に提出された検体 17,599 件を調査した結果 T 抗体陽性率 1.5% 偽陽性率 0.05% 偽陽性陽文献 1) 松本美枝石川文雄ラテックス凝集反応による自動分析装置用梅毒診断試薬 TLA の開発臨床化学補冊 2 111B. 2) 桜庭尚哉他ルミパルスプレスト T 改良試薬の評価医学と薬学 ) 大里和久他イムノクロマトグラフィー法による抗 T 抗体迅速検出用試薬の基礎検討医学と薬学 ) 糸島浩一他自動分析装置用に適用可能な梅毒抗リン脂質抗体測定用ラテックス試薬メディエース RR と従来法との比較について医学検査 ) 山本克彦抗体測定における非特異反応とその除去臨床化学補冊 2 55a. 6) 大竹皓子可野象次郎免疫学的測定法における干渉検査と技術性率は 3.%となり冒頭で述べた極東使用時より偽

8 Technical Article Evaluation of anti-treponema pallidum antibody reagents based on recombinant antigens by latex agglutination test Ichizou KOBAYASHI 1) Moe WAKUI 1) Hiroyuki YAMAMOTO 1) Ayako TASAKI 1) 1) Department of Clinical Laboratory, Osaka Red Cross Hospital (5-30, Fudegasaki-cho, Tennouji-ku, Osaka-shi, Osaka , Japan) Summary Mediace TLA (Kyokuto harmaceutical Industrial Co., Ltd) has been used at our hospital as a diagnostic reagent for syphilis by the latex agglutination method. However, we often encountered high false-positivity rates owing to the influences of chyle and hemolysis. In this study, we evaluated anti-treponema pallidum antibody reagents based on recombinant antigens from three manufacturers (Fujirebio Inc., Seiken Co., Ltd., and Shino-Test Corporation). Good results were obtained in terms of reproducibility, prozone test, and other types of test. High sensitivity and specificity were obtained; in particular, the specificity was comparable to that obtained by the method. It is expected that the required frequency of confirmatory testing by the T antigen neutralization test and other methods will be reduced with the use of the anti-t. pallidum antibody reagents based on recombinant antigens in place of those based on antigens prepared from purified bacterial cells. Key words: latex agglutination test, false positive rate, recombinant antigen, antigen prepared from purified bacterial cell (Received: October 7, 2013; Accepted: July 28, 201)

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untitled 抗梅毒抗体検査キットの検討高野弘紀, 伊瀬郁, 島田信子, 貞升健志, 甲斐明美 Evaluation of Commercial Diagnostic Kits for Anti-syphilis Antibodies Hiroki TAKANO, Iku ISE, Nobuko SHIMADA, Kenji SADAMASU and Akemi KAI 東京都健康安全研究センター研究年報第 61