すイオンが一定の距離を飛行する時間を測ることでイオ察することができますこれが質量顕微鏡のアイディアですンの質量を知ることができます MALDI 法と組み合わされることが多いのですが ESI 法と組み合わされた装置も市販されています室温が変化すると飛行管の長さが変化したり試料台の高さ

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れんかほがり
5 years ago
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1 質量顕微鏡の植物組織観察への適用高橋勝利 ( 産業技術総合研究所計測フロンティア研究部門 ) 1. はじめに NMR 2. 現代の質量分析 2002 B ESI MALDI Q TOF 3D/Linear - FT FTICR - MS, OrbiTrap ESI MALDI APCI APPI EI FAB ESI MALDI ESI MALDI MALDI LDI TOF FT TOF 10 kv 10

すイオンが一定の距離を飛行する時間を測ることでイオ察することができますこれが質量顕微鏡のアイディアですンの質量を知ることができます MALDI 法と組み合わされることが多いのですが ESI 法と組み合わされた装置も市販されています室温が変化すると飛行管の長さが変化したり試料台の高さが変化した場合にはイオンが飛行する距離が変わり同じ質量のイオンの飛行時間が変化して違う質量の

2 すイオンが一定の距離を飛行する時間を測ることでイオ察することができますこれが質量顕微鏡のアイディアですンの質量を知ることができます MALDI 法と組み合わされることが多いのですが ESI 法と組み合わされた装置も市販されています室温が変化すると飛行管の長さが変化したり試料台の高さが変化した場合にはイオンが飛行する距離が変わり同じ質量のイオンの飛行時間が変化して違う質量のイオンに見えてしまいますですので頻繁に質量のキャリブレーションを行う必要があります一回の測定は短時間で終わります FT 型質量分析法では磁場または電場によりイオンをトラップしておきそこに高周波を印加してイオンの周期運動を励起した後その運動によりアンテナ電極に生ずる誘導電流の時間変化トランジェントを測定します軽いイオンは早く運動し重いイオンはゆっくりと動きますのでトランジェントデータをフーリエ変換するとイオンの周期運動の周波数スペクトルが得られますそこからイオンの質量スペクトルを得るという他の手法とはかなり異なる原理を用いた質量分析法です非常に高い質量分解能が得られますし一般には質量の測定精度も非常に高いのが特徴ですし図 1 質量顕微鏡って小さく絞ったレーザー光を試料の照射してレーザースポットから生じるイオンの質量スペクトルを測定しますこれをレーザーの照射位置を XY 軸にそってラスタースキャンしながら繰り返すと各 XY 位置に質量スペクトルが貼り付いたデータキューブが得られます一旦データキューブが得られたらデータキューブを測定の質量に関してスライスすればその質量をもつイオンの強度の XY 分布が得られそのイオンの強度を顕微鏡で見ている様に観察することが出来ますこれが質量顕微鏡の原理ですアイディア自身は単純ですが実現するのは非常に大変です何が大変なのかを次で説明したいと思いますかし高分解能スペクトルを得ようとするとその分測定時間が長くなるというデメリットもあります質量分解能が非常基本的に質量顕微鏡装置のイオン源は紫外パルスレーザーに高いので多くの夾雑物を含む混合物の一斉分析に向いてを備えた MALDI イオン源のことが多いと思います最近はいます植物組織に含まれている様々な物質の混合物を一斉 DESI 脱離エレクトロスプレーイオン化を使って質量イに分析するためには FT 型質量分析によって得られる高分解メージングを行うこともありますしビデオ顕微鏡下でナノ能高精度質量分析が必須ですこのため私の研究室では ESI ニードルを使って組織や細胞の特定の位置から物質をサ FTICR-MS を利用していますンプリングして質量分析を行う方法も質量顕微鏡として使え質量分析法には様々な種類があり方式により得られる質量ないこともありませんがほとんどの場合は MALDI イオン分析結果の特性がかなり異なりますから注意が必要ですまた源です普通 MALDI イオン源には 384 穴プレートと同じサ自分が行いたい分析に適したイオン化法と質量分析法を適切にイズのターゲットプレートを入れメカニカルステージでプ選択することが良い結果を得るためには必要不可欠ですレートを動かしてプレート上のレーザー照射位置を変えられるものがほとんどですですから市販の MALDI-MS 装置を使って制御ソフトウエアの変更だけで質量顕微鏡測定を行 3 質量顕微鏡とは質量顕微鏡技術とは顕微鏡で試料を観察するのと同じようケースが多いと思いますただ実際に質量顕微鏡測定を行うに試料上での位置情報を保持したまま質量分析を行う方うためにはレーザー照射スポット径を小さくしたりステー法であると定義することができます MALDI MS ではマトジの位置制御を精密化するなど装置的な改造が必要なことリクスと混合した試料の表面に集光したレーザー光を照射しも多くあります - て照射部位から生ずるイオンの質量を測定しますレーザー私の研究室では市販の MALDI-FTICR-MS 装置のが照射された部位のみからイオンが生じますのでレーザー MALDI イオン源を取り外して独自設計して製作した顕微を照射する位置を変えればその部位ごとの質量スペクトルが MALDI イオン源を取り付けて質量顕微鏡測定を行っていま得られます生体組織をすりつぶさずそのままの状態でマすこのイオン源を使うと 10 mm 10 mm の導電性コーティトリクスを吹きかけて小さく絞ったレーザーの照射位置をングを施した薄いガラス板の上に置いた試料を下からリア矩形上にラスタースキャンしながら各ポイントで質量分析をルタイムにビデオ顕微鏡観察しながら上からレーザーを照すれば各ポイントごとに質量スペクトルが得られます図射することができますレーザーの集光スポットサイズは 1 すると一連の測定から試料上の位置座標 x, y 軸とミクロンで質量顕微鏡測定をする場合の試料ステー質量 m/z 軸に対する 3 次元のデータキューブが得られるジの送り幅は 1 ミクロン以下に設定することが可能ですことになりますデータキューブを質量軸に関して薄くスラ質量分析法としては FTICR-MS を用いており非常にイスすればその質量をもつイオンの x, y 平面での分布高い分解能で質量分析を行うことができます最大分解能を顕微鏡をのぞいている様に観察できますデータキューブ 100 万程度まで可能ですこの分解能では質量とを別の質量に関してスライスすれば別のイオンの分布を観のピークが分離しますまた質量の決定精度も 11

非常に高く外部標準でも 1 ppm 程度でイオンの質量を決必要となりますがなかなかそんなことができるソフトウ定することができますこの精度では質量 1000 のイオンのエアはありません典型的な TOF 型質量分析計の場合には質量を 0.

3 非常に高く外部標準でも 1 ppm 程度でイオンの質量を決必要となりますがなかなかそんなことができるソフトウ定することができますこの精度では質量 1000 のイオンのエアはありません典型的な TOF 型質量分析計の場合には質量をの精度で決定することができます質量顕微鏡測定を行うためにはイオン源の中の試料ステージ位置を精密に制御しレーザーを発振し生成したイオンの質量分析を行うためのトリガーを発し測定が終わっ 10,000 点の profile データでも 2 3 GB 程度には収まります私の研究室ではやはり LabView を用いた独自ソフトウエアを開発して質量顕微鏡データの解析を行っています質量顕微鏡測定で得られるデータは 2 次元画像の各ピたら再度試料ステージを制御して質量分析を行うという高クセルに質量スペクトルデータが貼り付いたデータキュー度な制御を行うソフトウエアが必須です私の研究室ではブ形式のデータですこのデータに関して例えば質量ナショナルインスツルメンツ社製の開発環境 LabView を用からの範囲のイオンの強度を計算しそのいて自作したソフトウエアを使ってイオン源質量分析部強度によって 2 次元画像を作ってどんなパターンを示してなどを有機的に制御することにより質量顕微鏡測定を実現いるのか観察することが行われますこれはデータキューブしていますを質量軸に関してスライスして観察することに対応しますしかし分解能の高い質量データの場合このスライス画像を観察することすら難しくなります例えば質量 200 から 300 までの間を 0.01 の質量幅でスライスすると 10,000 枚の画像ができますこれを人間の目ですべてみるというのはかなり大変な作業になります従って質量顕微鏡によって得られたデータを解析してそこから様々な有用な情報を得るためには高度な情報科学的手法を用いて解析を行うことが必要となります 5 植物試料への質量顕微鏡技術の適用ここまで述べたように質量顕微鏡技術を実現するためには図２質量顕微鏡を制御するソフトウエア質量顕微鏡測定を実現するためにはイオン源や質量分析部などを高度に制御するソフトウエアが必要です私の研究室で開発している質量顕微鏡ではイオン源に組み込まれた試料ステージビデオ顕微鏡などを制御するソフトウエアと市販の FTICR-MS 制御するソフトウエアさらに近接場顕微鏡プローブを制御するソフトウエアを高度に組み合わせて質量顕微鏡を制御しています 12 質量分析装置のハードウエア技術制御ソフトウエア技術得られるデータの解析技術の面で多くの改良が必要とされます特に FTICR-MS をはじめとした超高分解能質量分析を用いた質量顕微鏡装置の実現には様々なイノベーションが必要ですこのようなイノベーションにより実現した質量顕微鏡技術はこれまで主に動物組織の研究に用いられることが多くあ私の研究室で使っている FTICR-MS 装置では非常に高まり植物の研究には用いられてきませんでしたこれは動物い分解能と高い精度で質量スペクトルを得ることができまの研究に予算が付きやすいという政治的な側面もありますすがその分一回の測定あたり 20 MB 程度の容量のデーがそれ以上に植物の質量顕微鏡測定を実現するためにはタが生じます縦横のラスターで質量顕微鏡測定様々な技術的な困難を克服しなければならないという理由がを行った場合ポイントの数は 10,000 になります従ってありますどんな技術的困難が立ちはだかっているのか植この測定では 20 MB 10,000=200 GB ものデータが作られ物組織の試料調製を例にとって説明したいと思いますることになりますこの容量のファイルを単にコピーするだ生体組織の質量顕微鏡測定をするためには試料をごく薄けでも大変ですがこれをコンピュータでプロセスして中かい切片にすることが必要ですこれは i 試料表面の凹凸をら様々な情報を引き出さなくてはいけませんこれも非常になくすため ii 試料表面でのチャージアップを防止するた大変な作業になります 200 GB のデータはそのままでは普め iii 一様なマトリクス結晶を成長させるためなど様々通のパーソナルコンピュータのメモリー上にはロードできまな理由があります一般的な MALDI-TOF 装置を使う場合せんそこで各々の質量スペクトルに対してピークピッキ i は非常に重要になります試料表面に凹凸があるとイオングをおこなってピーク位置とその強度の情報だけを含む質ンが生じる箇所も上下することになります TOF-MS ではイ量スペクトル線スペクトル centroid スペクトルとも言いオンがスタートするポイントとゴールするポイント間の距離ますに変換してその後の処理を行うことが普通ですしが変化してしまうと同じ飛行時間を示すイオンでも質量がかし線スペクトルでは各ピークの広がりや形に関する情報が変わって見えます ii は分析感度に依存する項目で電圧失われているためこのような情報を後で確認しなければなを印加した試料プレートの上に厚い非導電性の試料が乗ってらない場合には元のスペクトル profile スペクトルと呼びまいると対で生じた正負イオンのうち分析に使われない方のすに戻らなければならないこともありますこのためにはイオンの電荷が試料表面に蓄積し極端に分析感度を低下さ 200 GB もの容量の質量顕微鏡データにアクセスすることがせるという現象が起こりますこれを防ぐためにごく薄い切

図にはシロイヌナズナの若葉の薄切切片に 9 - aminoacridin を蒸着した表面の顕微鏡写真を載せています細胞壁の上にマトリクスが結晶を作りやすいことが分かります 4 図 4 質量顕微鏡による植物切片の分析 :

4 40 MALDI - MS 3 図 3 試料調製の流れ : 質量顕微鏡測定のための植物試料切片の調製には動物試料とは全く異なる手法が必要ですここでは植物組織を一旦氷に包埋しそれを切削用の包埋剤に包埋した後 - 40 以下でトリミングを行い特殊な粘着テープを使って植物組織の薄切切片を作成する方法を図示しましたさらに切片を氷温下で真空乾燥した後マトリクスを吹きかけて乾燥させてから質量顕微鏡測定を行いますここでも動物組織の場合と違いマトリクスが試料表面に一様に乗ってくれません図にはシロイヌナズナの若葉の薄切切片に 9 - aminoacridin を蒸着した表面の顕微鏡写真を載せています細胞壁の上にマトリクスが結晶を作りやすいことが分かります 4 図 4 質量顕微鏡による植物切片の分析 : 植物組織を急速凍結した後特殊な粘着テープを使って薄切切片を作りますここにマトリクスを塗り小さく絞ったレーザー光をラスタースキャンしながら質量分析を行うことにより様々な質量をもつイオンの平面分布を一度に測定することが出来ます aminoacridin 13

の確立です今のところ柔らかな葉っぱを 10 ミクロン程度の厚みに薄切した後にマトリクスを蒸着して質量顕微鏡測定を行うことには成功しましたしかしシロイヌナズナの根などの微細な組織の凍結切片を作成するのは至難の業です凍結ミクロトームで切片を作成する際に包埋剤に埋もれている組織を肉眼で認識することすら困難で精密に位置決めをして根を縦切りにするなど到底できそうにもありません

5 の確立です今のところ柔らかな葉っぱを 10 ミクロン程度の厚みに薄切した後にマトリクスを蒸着して質量顕微鏡測定を行うことには成功しましたしかしシロイヌナズナの根などの微細な組織の凍結切片を作成するのは至難の業です凍結ミクロトームで切片を作成する際に包埋剤に埋もれている組織を肉眼で認識することすら困難で精密に位置決めをして根を縦切りにするなど到底できそうにもありませんその場合切片を作らずに直接レーザーを照射するということもできますが玉ねぎの上皮のように細胞壁が頑丈な場合には手が出ませんまた木の枝の凍結切片を作成することもかなり難しいのが実情です特に硬い組織と柔らかい組織が共存している植物組織の凍結切片を作成するためにはかなりのアイディアと熟練を要します図 5 シロイヌナズナの若い芽の直接質量顕微鏡測定シロイヌナズナの若芽を導電性コートを施したガラス状に貼り付けて乾燥させたのち 9-aminoacridin を蒸着した試料の質量顕微鏡測定結果を示しました細胞壁が柔らかい組織の場合薄切切片を作らなくてもそのまま質量顕微鏡測定をして異なる空間分布を持つイオンを複数見つけることに成功しました細胞壁が柔らかいという事だけでなく質量顕微鏡に使われているパルスレーザーのパルス幅やパルス強度にも必要条件がありそうですがそれらの条件を明らかにするのは今後の課題です植物組織中には様々な 2 次代謝物が含まれていますが得られた質量スペクトルの情報から 2 次代謝物を含めてどのような物質が含まれているのかを同定することが質量顕微鏡技術を植物組織に適用する場合の最終ゴールだと思いますそのために超高分解能質量分析法を利用した質量顕微鏡装置とその利用技術を開発してきたわけですが検出された物質の精密質量情報のみからその物質がなんなのかを一義的どこに設定するのかによって質量顕微鏡測定結果が変化しに同定するためにはまだまだイノベーションが必要です 2 再現性に問題が生じることが多くなります次代謝物を含む質量データベースを拡充することや高分解植物組織の試料調製に関していまだに様々な困難があり誰でも簡単に実施できるプロトコール化ができていない状況能質量スペクトルから得られる同位体パターンを利用して検出された物質の組成式を決定するアルゴリズムを適用するなですさらに質量顕微鏡装置のハードウエアソフトウエアどアプローチはさまざまありますがどれも更なる改良の及びデータ解析というところでも動物組織の分析にはない余地を大きく残しています様々な問題点がありそれを一つ一つ解決しながら少しずつ前進している状況です 7 まとめこのでは質量顕微鏡技術がどんなものなのか 6 今後の課題ここまで述べたようにこれまで主に薄切した動物組織にのかを紹介しました質量顕微鏡技術では従来の質量分析で適用されてきた質量顕微鏡技術ですが超高分解能質量分析は得られなかった質量スペクトル上のピークの空間パターン法の利用新しい顕微 MALDI イオン源とそれらを有機的にを得ることが出来ます単にターゲットとしている分子が制御するソフトウエアの開発によって植物組織の研究にも組織内にどのように分布しているのかを観察するだけではな用いることが出来るようになってきました動物組織の場合く逆に従来はシグナルなのかノイズなのか判別できなかっと違って植物組織を薄切して質量顕微鏡測定できるようにたような質量スペクトル上の小さなピークが空間的に特異試料調製するのは非常に難しいのですが万能ではありませ的なパターンを示すことからシグナルであると判別できるなんがある程度どうやったら良いのかが分かってきましたど従来よりも多くの情報を質量スペクトルデータから読みその過程でマトリクスを塗布しなくても質量顕微鏡測定で出すためにも非常に有用であることが分かってきましたきるケースがあることもわかってきました 14 どのようにして植物組織の観察に利用できるようにしてきたまだまだ簡単に使えて色々な情報がすぐに読み出せるといしかし質量顕微鏡技術を植物組織に普遍的に適用するう技術ではありませんが今後植物研究者の皆さんと二人三ためにはまだまだ克服しなくてはならない課題があります脚で技術を枯らし誰にでも使える普遍的な技術として育てもっとも重要なのはなんといっても植物組織の試料調製法てゆきたいと思っています

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<4D F736F F F696E74202D C834E D836A834E83588DDE97BF955D89BF8B5A8F F196DA2E > 7-1 光学顕微鏡 8-2 エレクトロニクス材料評価技術途による分類透過型顕微鏡体組織の薄切切や細胞細菌など光を透過する物体の観察にいる落射型顕微鏡 ( 反射型顕微鏡 ) 理学部材料機能学科属表や半導体など光を透過しない物体の観察にいる岩素顕 iwaya@meijo-u.ac.jp 電線を使った結晶の評価法透過電顕微鏡査電顕微鏡実体顕微鏡拡像を体的に