Gene Therapy for chronic glomerulonephritis

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1 資料 1 文部科学省動物性集合胚の取り扱いに関する作業部会平成 27 年 5 月 22 日 動物性集合胚を用いない 臓器再生技術は可能か? 東京慈恵会医科大学附属病院腎臓 高血圧内科 横尾隆

2 1. そもそも臓器再生は必要なのか?

3 腎臓疾患の現況 1)2012 年の本邦での透析患者数 32 万人 毎年 1 万人ずつ増えている 人口の高齢化 糖尿病の増加によりその数は今後爆発的に増えることが予想されている 2) 国民総医療費約 32 兆円のうち透析医療のみで実に 1.4 兆円以上に及んでいる 3) 透析は life saving ではあるが 実際の QOL は著しく制限され また心血管疾患の合併による高い mortality となる 4) 移植可能な臓器であるが ドナー登録後平均 14 年待たなければならず 慢性的なドナー不足である また移植後も生涯にわたり免疫抑制剤の服用が必要で それによる副作用と戦い続けなければならない

4

5 2012 年末透析患者数は約 31 万人 日本透析医学会 HP より

6 2010 年に 万人が透析 移植を受けている しかしその 2-3 倍の末期腎不全患者が治療受けられず死亡している 2030 年までに今の倍以上の透析 移植が施行できる体制を目指す必要がある

7

8 生命の進化と時間軸 1/1 12/1 12/31pm 40 億年前生命誕生 3 億 6 千万年前上陸 血圧 10mmHg mmHg 100mmHg 20 万年前現代人の登場

9 表 1:iPS 細胞研究ロードマップ文部科学省 今後の幹細胞 再生医学研究の在り方について ( 平成 24 年 ) より抜粋

10 今ある腎臓の障害部位を修復する 再生医療 新たに腎臓を作る

11 de novo kidney regeneration 1) 脱細胞化死体臓器の使用 1)3Dプリンター 2) 胚盤胞補完法 3) 自己組織化能 4) 胎生臓器ニッチ法

12 BLACK BOX?

13 266 日 受精卵 新生児受精卵の段階で成体を作るすべてのプログラムが備わっている これをすべて解明するのは大変難しい 借りてしまおう!

14 子豚 胎児 受精卵 正常分娩 腎臓 胎児 移植 成長 キメラ動物 出産 仮親の子宮に戻す 注射

15 Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell 142:787;2010

16 Matsunari H et al. Blastocyst complementation generates exogenic pancreas in vivo in apancreatic cloned pigs. PNAS 110: , 2013

17 Usui J, et al. Generation of kidney from pluripotent stem cells via blastocyst complementation. Am J Pathol 2012; 180:

18 胚盤胞補完法の課題 キメラ形成能をもつヒトiPS 細胞の樹立 ( プライム型からナイーブ型へ ) ips 細胞 ES 細胞の発癌性の問題 特定の臓器だけ ( 内臓だけ ) にiPS 細胞を分化させる 血管系を患者由来にする ヒトと家畜は遠く キメラできるのか? 異種内でできた臓器の安全性 ( 補完した膵臓移植実験 ) 倫理的問題

19 キメラ形成能をもつヒト ips 細胞の樹立

20 mepiscs に E-cadherin を強制発現し胚盤胞補完法 キメラマウスを得ることができた PLoS One 2012

21 PECAM1: Naïve PSC marker IWP-2 Β カテニンの核内蓄積を減少させる E-cadherin 強制発現で (LIF) と組み合わせて PECAM 陽性細胞 IWP-2 β カテニン核内蓄積量 ES like colony

22

23 特定の臓器だけ ( 内臓 ) に ips 細胞を分化させる

24

25 2. 動物性集合胚を用いないでできないか? 倫理面の整備多能性の無限の可能性とリスク発癌性 樹立費用 時間 バンク化 次世代へのゲノム編集の継承の可能性 臓器特異性をもたせる多能性幹細胞でなくて臓器前駆細胞 (pluripotency vs. multipotency)

26 間葉系幹細胞 (mesenchymal stem cell:msc) 中胚葉系譜に分化が進んでいる発癌の報告なし集合胚をつくれない 患者の骨髄 脂肪から簡単に樹立できる安価 短時間 遺伝子導入必要なし自家移植が可能 分裂速度が速い十分な細胞数を得やすい 培養のメンテナンスが容易研究者間のバラツキが少ない

27 腎臓 胎児 仮親の子宮に戻す 移植 成長 出産 胚盤胞補完法 注射 大きい胎児 小さい胎児 腎臓 移植 腎臓 注射 胎生臓器ニッチ法

28 E11.5 E13.5 中腎管 c-ret GDNF 尿管芽 後腎間葉組織 間葉系幹細胞の注入

29 実験プロトコール LacZ 遺伝子導入 ( レトロウイルス ) ヒト間葉系幹細胞 ラット ( 胎生 11.5 日 ) 胎仔 microinjection GDNF 遺伝子導入 ( アデノウイルス ) 24 h 全胚培養 ラット ( 片腎摘出 ) 器官培養

30 Neo-kidney generated by modified relay culture (2 weeks) neo-kidneys Kidney Yokoo T et al. PNAS 2005 Yokoo T et al. JASN 2006

31 Electron microscopic appearance of metanephros transplanted into the omentum Red Blood cells

32 Urine-like fluid from neo-kidney serum cyst urine 30.4 ± ± :UN 0.3 ± ± :Cr Yokoo T et al. J Am Soc Nephrol 2006

33 3. 血管系を患者由来にできるのか?

34 実験プロトコール GDNF 遺伝子導入 ( アデノウイルス ) ヒト間葉系幹細胞 microinjection ラット ( 胎生 11.5 日 ) 胎児 24 h 全胚培養 (48h) LacZ ラット ( 片腎摘出 ) 器官培養 (24h)

35 vascular integration from the recipient Peritubular capillary

36 vascular integration from the recipient-2 M #1 #2 #3 ICAM-1 VCAM-1 PECAM-1 rgapdh Yokoo T et al. J Am Soc Nephrol 2006

37 4. ヒトに対応できるほど大型化できるのか?

38 腎臓作製のための異種胎児として ブタを選んだ理由 1) 成獣の腎臓の大きさが人に近い 2) 一般に食用として用いられるので倫理的に許容される可能性が高い 3) 異種免疫のデータが豊富 4) トランスジェニック動物の作成も可能

39 正常胎仔 No.5

40 5. 不要になったら除けるのか? 安全弁の獲得

41 臨床応用に向けての問題点 1) 樹立された再生組織はブタとのキメラ組織である 2) 異種部分が体内に残存することは 免疫拒絶反応のみならず 生理的不快感のための精神的拒絶が起こる可能性が高い 再生組織樹立後に 異種部分を排除するシステムの導入が必要となる

42 異種部分を排除することにより ホスト細胞由来の再生組織ができる

43 異種部分を排除するシステム E2F1 細胞分裂を調整する転写因子 その異所性発現は分裂細胞においてアポトーシスを誘導する Tamoxifen ER/E2F1 アポトーシス

44 ER-E2F1 mouse CAG-ER/E2F1 mouse CAG loxp neo loxp HA ER/E2F1 IRES2 VENUS ER/E2F1 mouse CAG-Cre mouse ユビキタスに ER/E2F1 が発現するマウス CAG Cre

45 方法 (in vivo) ER-E2F1 妊娠マウス (E13) E13 胎仔の後腎 後腎移植 LEWIS ラット FK506 (2mg/kg) および Tamoxifen(100mg/kg) を10 日間連日投与 摘出した発達後腎に対し組織染色 エリスロポエチン qpcr 細胞数カウントの検索

46 結果 Tamoxifen - Tamoxifen + ER-E2F1 + コントロール ER-E2F1 + コントロール TG+ TG- 移植後腎 元のラット腎臓

47 6. 尿の排泄経路はどうするのか?

48 7. 患者由来の間葉系幹細胞を使用できるのか?

49 長期透析患者 間葉系幹細胞 異種胎仔内分化誘導 再生腎臓原器 移植 透析患者の成体幹細胞は長期尿毒素暴露により 腎臓再生能が劣っている可能性がある 1) 透析患者由来間葉系幹細胞の腎臓再生能の検証 2)iPS 細胞樹立によりリセットしてから 間葉系幹細胞に分化誘導して 腎臓再性能がリカバーするか検証

50 間葉系幹細胞 脂肪細胞軟骨細胞骨芽細胞

51 長期透析患者脂肪由来間葉系幹細胞は増殖能 分化能 老化速度が健常者由来と有意差がなかった

52 PCR アレイ法による網羅的解析で PCAF のみが長期透析患者で抑制されていることが確認された PCAF はヒストンのアセチル化を介して細胞死や血管新生に強く関与するため 腎臓再生能は現弱している可能性が高い (Yamanaka S. et al., PlosOne 9(7)e102311, 2014) (Yamada A. et al. Human Cell 27;59-67, 2014)

53 7. 異種胎仔 ( の発生プログラム ) は必須か? ヒト以外で恩恵を受けることがあるのか?

54 犬ネコ 合計 1245 万頭 1263 万頭 2400 万頭 日本の 15 歳未満の子供 : 1780 万人 子供よりペットの数が上回っている!! ペットは子供のように愛されなくてはならない存在になってきている

55 ネコ慢性腎疾患の罹患率 >10y 7.7% >15y 15.3~30% 全年齢 5.8% ネコの死因の 30.3% が慢性腎不全であった Peterson ME et al, Journal of the American Ceterinary Medical Association 50% 以上が腎機能の低下が原因で亡くなったり安楽死を行っている Elliot J et al, Journal of Small Animal Practice 獣医臨床においてネコ腎不全の進行を遅らせることは急務となっている

56 獣医臨床とのコラボレーション まずネコの自己骨髄細胞から自己腎臓を 作製し 治療効果安全性を確認する そ こで得られた知見をヒト臨床に応用する

57 ブタ後腎 ネコ大網部 Pregnant Pig E30 embryo Metanephros Transplantation Cat omentum Immuno-suppression 組織学的検索種特異的プライマーを用いた RT-PCR

58 ネコ EPO 特異的プライマーによる PCR Cat EPO AGACAGGTGACCAGGTGCTCCTACCC AGACAGGTGACCAGGTGCTCCTACCC Identities=26/26 (100%) Sequencing: シークエンスにより ネコ EPO と同定された Cat EPO Positive control Pig EPO Positive control No Template ネコに移植したブタ後腎より ネコ EPO の発現が確認された エリスロポエチン産生細胞はホスト由来である

59 方法 マウス後腎 ラット大網 E13 embryo C57BL/6 mouse Metanephroi Transplantation SD Rat Omentum FK506 (2mg/kg) was daily administered for 2 weeks RT-PCR using species-specific primers

60 Fig. 1 発達後腎の所見 ( 肉眼 マッソン染色 ) a c b マッソン染色 : 大網部に移植した後腎は皮質から髄質まで極性を保って発達継続した

61 Epo (mu/ml) 大網移植後の後腎組織からの EPO 産生 80 0 Hr 24 Hr 60 n.s. ** 40 * 20 n.s. 貧血誘導 ( - ) 貧血誘導 (+) 0 Transplanted Sham *P<0.05, **P<0.005 免疫組織染色 両腎摘出後の血清 EPO 濃度

62 種特異的プライマーによる RT-PCR 発育した後腎が産生する EPO はホスト細胞由来であった Only metanephros had ability to produce EPO after transplantation in the omentum

63 方法 マウス後腎 GFP ラット大網部 E13 胎仔 C57BL/6 マウス 大網移植 GFP TG ラット FK506 (2mg/kg) 投与 (2 週間 ) 二重染色 (EPO GFP)

64 GFP EPO CD31 merge EPO 産生細胞は迷入した血管内皮細胞ではない EPO 産生細胞は血管内皮細胞から分化した細胞ではない

65 骨髄移植実験 EPO-BAC-GFP 骨髄移植群 骨髄移植 C57BL/6 マウス後腎移植 (E13) EPO-BAC-GFP マウス C57BL/6 マウス EPO-BAC-GFP の骨髄を持った C57BL/6 マウス コントロール : B6 BMT 群 C57BL/6 マウス後腎移植 (E13) 骨髄移植 C57BL/6 マウス C57BL/6 マウス C57BL/6 の骨髄を持った C57BL/6 マウス

66 EPO 産生細胞は 骨髄細胞由来である

67 LacZ レトロウイルス 内皮前駆細胞 ヒト骨髄細胞 間葉系幹細胞 輸注射 x5 後腎移植 ヒト EPO 産生? C57BL/6 マウス NOD/SCID マウス

68 EPO 産生細胞の起源はは間葉系幹細胞であった human EPO mouse GAPDH EPC MSC

69 rmsc Luc/LacZ TG rat bone marrow cells Infusion x5 Metanephros transplantation IVIS and X gal assay C57BL/6 mouse NOD/SCID mouse

70 Control Transplanted metanephros Transplanted metanephros Native kidney

71

72 ネコ化ブタ作成の為の fdaf クローニング Izuhara L, Yokoo T et al. Generation of a felinized swine cell line by expression of feline decay-accelerating factor. PlosOne Feb DOI:

73 遺伝子改変ブタ 腎不全ネコ 必要時販売配給 後腎 + ガラス化凍結後腎バンク 骨髄採取 腹腔鏡下移植 自己間葉系幹細胞樹立 薬剤内服 輸注 キメラ EPO 産生組織樹立 自己 EPO 産生組織樹立

74 Hospital Patient with ESRD Final differentiation in the Pt s body Removal of BM transplantation Organ Regeneration Center Pt-derived MSC Self- organ anlagen Organ specific differentiation in growing embryo Provide GMP pregnant pig

75 腎臓 胎児 移植 成長 キメラ動物 出産 仮親の子宮に戻す 注射 大きい胎児 小さい胎児 移植 腎臓 注射 腎臓

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ン投与を組み合わせた膵島移植手術法を新たに樹立しました 移植後の膵島に十分な栄養血管が構築されるまでの間 移植膵島をしっかりと休めることで 生着率が改善することが明らかとなりました ( 図 1) この新規の膵島移植手術法は 極めてシンプルかつ現実的な治療法であり 臨床現場での今後の普及が期待されます 報道機関各位 平成 25 年 12 月 12 日 東北大学未来科学技術共同研究センター (NICHe) 東北大学大学院医学系研究科 短期間の絶食とインスリン投与が膵島移植の効果を増大する - 糖尿病治療のための細胞移植の成績向上へ向けて - 研究概要 東北大学未来科学技術共同研究センター ( 大学院医学系研究科兼務 ) の後藤昌史教授 大学院医学系研究科先進外科の大内憲明教授および神保琢也医注 1

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インスリンが十分に働かない ってどういうこと 糖尿病になると インスリンが十分に働かなくなり 血糖をうまく細胞に取り込めなくなります それには 2つの仕組みがあります ( 図2 インスリンが十分に働かない ) ①インスリン分泌不足 ②インスリン抵抗性 インスリン 鍵 が不足していて 糖が細胞の イン 糖尿病ってなに 糖尿病は インスリンが十分に働かないために 血液中を流れるブドウ糖という糖 血糖 が増えてしまう病気です インスリンは膵臓から出るホルモンであり 血糖を一定の範囲におさめる働きを担っています 血糖の濃度 血糖値 が何年間も高いままで放置されると 血管が傷つき 将来的に心臓病や 失明 腎不全 足 の切断といった より重い病気 糖尿病の慢性合併症につながります また 著しく高い血糖は それだけで昏睡

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