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1 上原記念生命科学財団研究報告集, 23(2009) 52. 細胞極性の形成, 維持のメカニズムの解明 原田彰宏 Key words: 細胞極性, 細胞内極性輸送, ノックアウトマウス, 線虫 * 群馬大学生体調節研究所生体情報部門細胞構造分野 緒言上皮細胞は頂端側 (apical), 側底側 (basolateral), 神経細胞も軸索, 樹状突起という極性を持つことが, 組織, 器官の正常な発生や機能に必須である. 極性の形成, 維持には, 合成された分泌蛋白や膜蛋白が TGN( トランスゴルジネットワーク ) 等で輸送小胞に分配, 濃縮された後,apical や basolateral に運ばれる必要がある. この方向性のある輸送を極性輸送と呼ぶ. 極性輸送には, 低分子量 GTP 結合蛋白質 (Rab8),SNARE(SNAP (Soluble NSF Attachment Protein) REceptors) 蛋白 (syntaxin3, VAMP7, SNAP23) などが重要であることが知られている 1). 今日まで国内外において, これらの蛋白の研究は主に培養細胞を用い, 当該分子の過剰発現や antisense DNA, sirna 等による発現低下を用いて行われてきた. しかしこの手法では (1) 他の組織や個体における当該分子の機能が全く分からないこと (2)siRNA でも目的の蛋白を完全には無くすことが出来ないことや, 目的分子以外の分子に働く可能性もあること, などの限界がある. 更に,(3) これらの分子を欠損する動物の作製, 解析は殆ど行われていない. 本研究はこれらの限界を克服し, これらの分子の組織や個体でのより正確な役割を知るためにこれらの蛋白の時期, 組織特異的ノックアウトマウスを作製して解析するものである. 方法 1. 極性輸送関連遺伝子の floxed マウスを図 1 のように作製し, その解析を行った. 解析においては, 下記の組織特異的に Cre recombinase を発現するマウスを用いた. 神経 nestin-cre,tau-cre( 当研究室で作製済 ) 2) 小脳プルキンエ細胞 Pcp2-Cre 小腸 villin-cre, 肝臓 albumin-cre, 膵インスリン分泌細胞 Insulin-Cre 時期特異的 ( 肝臓, 胸腺, 脾臓など ) Mx1-Cre 神経細胞特異的かつ時期特異的 tau-crepr( 当研究室で作製済 ) 3) 解析には下記の手法を用いた. a) 上皮, 神経組織における組織形成 維持の異常を, 光学顕微鏡 ( 通常の組織染色, 免疫組織化学等 ), 電子顕微鏡 ( 通常の電顕並びに免疫電顕法 ) を用いて解析した. b) その上皮, 神経細胞内での極性輸送を様々な apical, basolateral のマーカー蛋白を用いて, 組織, 細胞の抗体染色や生きた細胞内での GFP とマーカーの融合蛋白の動きを共焦点レーザー顕微鏡で観察すること等によって解析した. * 現所属 : 大阪大学大学院医学系研究科細胞生物学教室 1

2 図 1. 復帰可能なノックアウトマウス (revertible knockout) 作製法の説明. 概念図 A wild-type allele( 上 ) に対応するような targeting vector( 中央 ) を作製した. その際,Neo 遺伝子の前に強力な splice acceptor(sa) と internal ribosomal entry site(ires) をいれ, それを FRT 配列で挟んだ. 更にその前に loxp 配列を入れた. また次のイントロンに1つの loxp 配列のみを入れた. 相同組み換えをおこした遺伝子 (targeted allele; 下 ) では目的遺伝子の mrna が強力な splice acceptor によって trap されて途中で切れ, 蛋白が発現しなくなった ('OFF'). 概念図 B A で得た相同組み換え遺伝子を持つ ES 細胞からマウスを作製すると, 遺伝子の片方がつぶれたマウスが出来た ('trapped'). そのマウスに Flp recombinase を全身で発現するマウスを交配すると,SA-IRES-Neo-polyA が抜けて, 目的遺伝子が再発現した ('reverted'). このマウスは通常の組織特異的ノックアウトマウスとしても使用することができ,Cre recombinase を標的臓器で発現するマウスと交配すると, 目的遺伝子を標的臓器で欠損するマウスを作製することができた ('deleted'). 2. 線虫を用いた極性輸送に関与する新規分子の同定 (1) GFP で標識されたマーカータンパク質を腸細胞において発現する形質転換体の構築および解析 2

3 線虫の腸細胞は高等生物と類似の細胞接着により仕切られた apical,basolateral 面を持ち, 細胞のサイズが大きいなど, 極性輸送のモデル系として優れた特性を持っている. 腸細胞での極性輸送をモニターする系を構築するため,apical 面に局在することが示されている, または予測されるタンパク質群と緑色蛍光タンパク質 (GFP) の融合遺伝子を腸で発現する形質転換体を Microparticle Bombardment 法によって構築した. (2) 極性輸送に異常を示す変異株の分離 (1) で作成した形質転換体について変異原処理を行い, apical,basolateral 面への分泌もしくは輸送が異常になった変異体を蛍光実体顕微鏡を用いてビジュアルスクリーニングした. 具体的には,Apical 側への輸送マーカーには腸消化酵素,basolateral 側への輸送マーカーには腸細胞から体腔側に分泌される卵黄タンパク質 YP170 を考えている. これらのタンパク質に GFP を結合し, 腸において発現させた場合, 野生株では腸消化酵素は腸の内腔へ,YP170 は体腔側へ分泌されると考えられる 4) ( 図 2). しかし極性輸送に異常が生じた変異株では, これらが細胞内に蓄積するか, もしくは逆方向 ( 腸消化酵素が体腔側へ, YP170 は腸内腔側へと ) へと誤って輸送されてしまうと予想される. 一方, 目的の遺伝子を容易にノックアウトできる RNAi 法を用いた逆遺伝学的アプローチも開始し, 極性輸送に関わる因子を網羅的に探索する. 図 2. 線虫を用いたスクリーニングの概略. YP170 という腸細胞から分泌されて卵母細胞に取り込まれるタンパクの遺伝子に GFP( 緑色蛍光タンパク質 ) を融合した遺伝子を線虫に導入すると通常の線虫では卵母細胞がこれを取り込んで蛍光を発するが,rme(receptor-mediated endocytosis) mutant では取り込みが行われないため,YP170-GFP が体腔に蓄積し, 体腔が蛍光を発した. 結果および考察マウスについて Rab8a:Rab8a を全身で欠損するノックアウトマウスでは, 小腸の apical 面へ輸送されるべき,transporter, peptidase などが細胞内に蓄積, 分解されるため ( 図 3), 生後死亡した. またこのマウスではヒトの遺伝性疾患である微絨毛萎縮症の症状と非常に類似した症状と所見を示した. これらの表現型についてまとめて Nature に報告した 5). 3

4 図 3. Rab8a 欠損マウスの小腸における DPPIV の分布. DPPIV(dipeptidyl-peptidase IV) は野生型の小腸 (WT) では apical 面に分布するが,Rab8a 欠損マウス (KO) で は apical 面の量が減少し, 細胞内に蓄積した. Rab8b: 全身で欠損するマウスは生存, 繁殖可能であるため, 様々な臓器 ( 神経, 消化器, 泌尿器など ) の細胞極性に異常がないか, 更に詳細に解析する. また,rab8a との double knockout mouse を作製して, 機能重複がないかどうか解析する. Syntaxin3, VAMP7: 神経, 上皮細胞の極性形成についての知見をまとめて論文に投稿し発表する ( 平成 21 年度中に投稿予定 ). SNAP23:(1) 神経, 上皮細胞の極性形成における機能を神経, 小腸特異的ノックアウトマウスを用いて解析した.(2) 調節性分泌に必要とも考えられるため, 膵インスリン分泌細胞特異的ノックアウトマウスを用いてインスリン分泌を解析した. また, インスリン感受性や肥満の有無について解析し, 生活習慣病のモデルマウスとなりうるか検討した.annexin13,MAL2, FAPP1, 2, PKD1, 2: ノックアウトマウスの作製が終了し, 神経, 上皮細胞の極性形成を組織特異的ノックアウトマウスを用いて解析中である. 線虫について YP170 は basolateral marker である LDL 受容体と結合して卵細胞に取り込まれるため,YP170 の取り込みに異常のある線虫は basolateral marker の分布に異常があると考えられる. 我々は共同研究で既に YP170 の取り込みに異常を生じる変異体を発見しており, それが LDL 受容体の細胞内輸送に異常があることを確認し,EMBO Journal に報告した 6). 現在その原因遺伝子である Rab35 の欠損マウスを作成中であり, マウスでも同様の異常を生じるか, 調べているところである. また更に極性のマーカーの分布に異常のある線虫を RNAi ライブラリーを用いてスクリーニングしているところである. これらの研究を通じて, 細胞極性の形成 維持機構の包括的な解明を行うと共に臨床への応用も視野に入れた研究も進めたいと考えている. 4

5 文献 1) Tanos, B. & Rodriguez-Boulan, E.:The epithelial polarity program: machineries involved and their hijacking by cancer. Oncogene, 27: , ) Muramatsu, K., Hashimoto, Y., Uemura, T., Kunii, M., Harada, R., Sato, T., Morikawa, A. & Harada, A.: Neuron-specific recombination by Cre recombinase inserted into the murine tau locus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 370: , ) Hashimoto, Y., Muramatsu, K., Uemura, T., Harada, R., Sato, T., Okamoto, K. & Harada, A. :Neuronspecific and inducible recombination by Cre recombinase in the mouse. Neuroreport, 19 : , ) Grant, B., Zhang, Y., Paupard, MC., Lin, SX., Hall, DH. & Hirsh D. : Evidence that RME-1, a conserved C. elegans EH-domain protein, functions in endocytic recycling. Nat. Cell Biol., 3 : , ) Sato, T., Mushiake, S., Kato, Y., Sato, K., Sato, M., Takeda, N., Ozono, K., Miki, K., Kubo, Y., Tsuji, A., Harada, R. & Harada, A. :The Rab8 GTPase regulates apical protein localization in intestinal cells. Nature, 448 : , ) Sato, M., Sato, K., Liou, W., Pant, S., Harada, A. & Grant, BD. :Regulation of endocytic recycling by C. elegans Rab35 and its regulator RME-4, a coated-pit protein. EMBO J., 27: ,

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受精に関わる精子融合因子 IZUMO1 と卵子受容体 JUNO の認識機構を解明 1. 発表者 : 大戸梅治 ( 東京大学大学院薬学系研究科准教授 ) 石田英子 ( 東京大学大学院薬学系研究科特任研究員 ) 清水敏之 ( 東京大学大学院薬学系研究科教授 ) 井上直和 ( 福島県立医科大学医学部附属生

受精に関わる精子融合因子 IZUMO1 と卵子受容体 JUNO の認識機構を解明 1. 発表者 : 大戸梅治 ( 東京大学大学院薬学系研究科准教授 ) 石田英子 ( 東京大学大学院薬学系研究科特任研究員 ) 清水敏之 ( 東京大学大学院薬学系研究科教授 ) 井上直和 ( 福島県立医科大学医学部附属生 受精に関わる精子融合因子 IZUMO1 と卵子受容体 JUNO の認識機構を解明 1. 発表者 : 大戸梅治 ( 東京大学大学院薬学系研究科准教授 ) 石田英子 ( 東京大学大学院薬学系研究科特任研究員 ) 清水敏之 ( 東京大学大学院薬学系研究科教授 ) 井上直和 ( 福島県立医科大学医学部附属生体情報伝達研究所准教授 ) 内山進 ( 大阪大学大学院工学研究科准教授 ) 2. 発表のポイント :

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背景 歯はエナメル質 象牙質 セメント質の3つの硬い組織から構成されます この中でエナメル質は 生体内で最も硬い組織であり 人が食生活を営む上できわめて重要な役割を持ちます これまでエナメル質は 一旦齲蝕 ( むし歯 ) などで破壊されると 再生させることは不可能であり 人工物による修復しかできませ

背景 歯はエナメル質 象牙質 セメント質の3つの硬い組織から構成されます この中でエナメル質は 生体内で最も硬い組織であり 人が食生活を営む上できわめて重要な役割を持ちます これまでエナメル質は 一旦齲蝕 ( むし歯 ) などで破壊されると 再生させることは不可能であり 人工物による修復しかできませ 報道機関各位 ips 細胞からエナメル質をつくる細胞を誘導 歯の再生への応用が期待 平成 24 年 2 月 10 日 東北大学大学院歯学研究科 ポイント 歯のエナメル質をつくる細胞( エナメル芽細胞 ) は 歯の萌出後に失われる ips 細胞からエナメル芽細胞を世界で初めて誘導 エナメル芽細胞の分化機序解明や 歯の再生への細胞ソースとして利用可能 概要 国立大学法人東北大学は 幹細胞が上皮細胞との相互作用により

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