[PDF] Biacore 3000 ver3 日本語マニュアル

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1 Biacore3000 Ver.3 JJ ( )

2 目 次 1. セットアップ 電 源 およびソフトウェアの 起 動 1 1) 電 源 の 立 ち 上 げおよび 緩 衝 液 の 準 備 1 2)BIACORE コントロールソフトウェアの 起 動 システムの 初 期 化 3 1)Dock(センサーチップの 挿 入 ) 3 2)Prime 5 3)ラックベースの 設 定 7 4) 温 度 設 定 9 5)Normalize 基 本 操 作 サンプルのインジェクト レポートポイントの 取 り 方 ファイルの 保 存 17 3.リガンドの 固 定 化 プレコンセントレーションの 検 討 (マニュアル 操 作 ) プログラム 操 作 によるリガンドの 固 定 化 24 1)ファイルの 呼 び 出 し 24 2)Method の 編 集 28 3)エラーの 検 索 29 4)プログラムの 実 行 30 5)プログラムの 終 了 MANUAL INJECT を 用 いた 固 定 化 量 の 調 節 方 法 相 互 作 用 の 検 討 マニュアル 操 作 による 相 互 作 用 の 検 討 プログラムによる 相 互 作 用 の 検 討 50 1)ファイルの 呼 び 出 し 5 2)Method の 編 集 52 3)エラーの 検 索 52 4)プログラムの 実 行 52 5)プログラムの 終 了 ファイルの 保 存 様 式 シャットダウン 実 験 の 終 了 センサーチップの 抜 き 取 り(Undock) センサーチップの 保 存 55

3 6. メンテナンス メンテナンス Air の 除 去 流 路 系 に 詰 まりがあるとき システムチェック データ 管 理 62 1)My Computer から 作 成 する 方 法 62 2)Explore から 作 成 する 方 法 63 8.プログラムの 説 明 64 ステップ1) MAIN ボックス 64 ステップ2) APROG ボックス 65 ステップ3) レポートポイント 68 ステップ4) DETECTION と FLOWPATH 72 ステップ5) 固 定 化 のプログラム 75 ステップ6) 相 互 作 用 のプログラム 82 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Surface preparations ph スカウティング Immobilization( 固 定 化 操 作 ) Regeneration scouting( 再 生 条 件 検 討 実 験 ) Surface performance test Binding analysis( 特 異 的 結 合 実 験 ) Kinetic analysis Concentration series Control experiments( 各 種 コントロールの 実 験 ) 135 1)Mass transfer control 135 2)Linked Rreaction のチェック Customer Application wizard アイコンの 説 明 基 本 操 作 147 ステップ1)1 個 のアナライトについての 分 析 147 ステップ2) 複 数 個 のアナライトについての 分 析 158 ステップ3)If/Then を 使 用 した 再 生 の 操 作 省 略 162 ステップ4) 実 験 途 中 で 流 路 (FLOWPATH)や 流 速 を 変 更 する 164 ステップ5) 濃 度 測 定 Wizard Template について 172 1) アルデヒドカップリング 法 173 2) HPA センサーチップカップリング 法 178 3) リガンドチオールカップリング 法 183

4 1.セットアップ 1 1.セットアップ 1-1. 電 源 およびソフトウェアの 起 動 1) 電 源 の 立 ち 上 げおよび 緩 衝 液 の 準 備 電 源 安 定 化 装 置 プリンター モニター 画 面 システム 本 体 コンピ ューター の 順 番 に 電 源 を 入 れる 本 体 のフロントパネル 上 の 左 にあるインジケータ(ライト)が 点 灯 し 30 秒 程 でリセット 後 新 たに 必 要 事 項 のみが 点 灯 あるいは 点 滅 する Biacore 本 体 のドアを 開 け 本 体 右 側 下 部 の 細 い 2 本 のインレットチューブをラ ンニング 緩 衝 液 のボトルに 入 れ 太 いシリコンチューブを 廃 液 入 れの 空 ボトル に 入 れる 装 置 の 配 置 センサーチップを 入 れる 場 所 サンプルバイヤル インジケーター 電 源 廃 液 入 れ ランニング 緩 衝 液

5 2 1.セットアップ 2)コントロールソフトウェアの 起 動 モニターの 初 期 画 面 中 左 下 のスタートを 押 し BIA programs をクリックし Biacore 3000 Control Software のアイコン( )をク リックする 画 面 の 説 明 Menu bar BIACORE の 全 ての 操 作 コマンドが 含 まれている Toolbar 使 用 頻 度 の 高 いコマンドをアイコン 化 しており 簡 便 にコマンド 操 作 を 選 択 できる Sensorgram window センサーグラムをリアルタイムに 表 示 Report point table 指 定 した 時 間 におけるレスポンスを 数 字 で 表 示 結 合 量 の 表 示 等 に 使 用 Eventlog window 測 定 中 の 操 作 内 容 を 表 示 グラフの X 軸 上 の( )と 対 応 Status window 現 在 のシステムの 状 態 を 表 示 時 間 レスポンス(RU) 流 速 使 用 フローセル 温 度 Run 実 行 状 態

6 1.セットアップ システムの 初 期 化 1)Dock(センサーチップの 挿 入 ) ソフトウェアを 立 ち 上 げると Dock ボックスに 自 動 的 が 表 示 される 黒 のカバーを 開 け コンベアを 手 前 に 引 く コンベアによって 引 かれてきたガ イドピンにセンサーチップシートのホールが 入 るようにセンサーチップをセッ トし コンベアを 押 し 込 み カバーを 戻 す (フロントパネルのインジケータの Sensor chip のシグナルが 緑 色 に 点 滅 する) Dock ボックスの Dock をクリックする (フロントパネルのインジケータの Sensor chip のシグナルが 緑 色 の 点 灯 に 変 わ る)

7 4 1.セットアップ Dock 操 作 における 注 意 事 項 解 説 1 各 種 のセンサーチップは 同 様 に Dock することができる 2センサーチップの 交 換 は 必 ず Undock の 状 態 で 行 う インジケータの Sensor chip が Dock 状 態 ( 本 体 シグナルが 緑 色 の 点 灯 時 )に 強 引 にセンサーチップを 抜 かないこと 3センサーチップ 内 のプラスチックシートがセンサーチップのカバーにしっかり 収 まって いることを 確 認 してから 挿 入 する 4センサーチップを 冷 蔵 庫 から 取 り 出 した 場 合 には 室 温 に 戻 した 後 包 装 あるいは 容 器 から 取 り 出 すようにする センサーチップには 以 下 の 種 類 がある (1) CM5: カルボキシルメチルデキストランをコーティングしたチップ アミンカップリ ング チオールカップリング アルデヒドカップリング 等 の 固 定 化 に 利 用 する 汎 用 性 の 高 いチップ Research Grade:ロット 間 の 誤 差 が 15% 以 下 のチップ 通 常 の 実 験 に 使 用 できる Certified Grade:ロット 間 の 誤 差 が 5% 以 下 のチップ 品 質 管 理 等 で 長 期 にわたる 精 密 な 実 験 を 組 む 場 合 等 に 使 用 する (2) CM4: CM5 のカルボキシルメチルデキストラの 導 入 量 を 減 少 させたチップ カルボキシ ル 基 にイオン 交 換 的 に 非 特 異 的 結 合 する 塩 基 性 物 質 を 含 むサンプルを 用 いる 場 合 に 使 用 する (3) CM3: CM5 のカルボキシルメチルデキストラを 短 くしたチップ 巨 大 分 子 ( 細 胞 細 菌 ファージ 等 )の 固 定 化 や 添 加 して 相 互 作 用 測 定 を 行 う 場 合 に 利 用 する (4) C1: 金 表 面 に 直 接 カルボキシル 基 のみを 導 入 したチップ CM3 と 同 様 に 巨 大 分 子 ( 細 胞 細 菌 ファージ 等 )を 用 いる 場 合 に 使 用 する 比 較 的 非 特 異 的 結 合 が 多 い (5) SA: ストレプトアビジンをあらかじめ 固 定 化 してあるカルボキシルメチルデキストラ ンベースのチップ ビオチン 化 した DNA ペプチド 化 合 物 等 ビオチン 化 分 子 の 固 定 化 に 使 用 する (6) NTA: NTAをあらかじめ 固 定 化 してあるカルボキシルメチルデキストランベースのチッ プ ヒスチジンタグを 持 つ 発 現 タンパク 質 (His-Tag Fusion Protein)をNi 2+ を 介 して 固 定 化 できる (7) HPA: 金 表 面 にオクタデシル 基 (C18)を 導 入 したチップ 疎 水 性 の 高 い 表 面 で リン 脂 質 や 糖 脂 質 などをリポソームとして 添 加 することで 単 層 (Monolayer)で 固 定 化 で きる (8) L1: 疎 水 性 分 子 をあらかじめ 固 定 化 してあるカルボキシルメチルデキストランベース のチップ リン 脂 質 や 糖 脂 質 などをリポソームとして 添 加 することで 2 重 膜 (Bilayer) で 固 定 化 できる 糖 脂 質 リン 脂 質 や 膜 貫 通 型 レセプター 等 の 固 定 化 に 使 用 できる

8 1.セットアップ 5 2) Prime Dock 操 作 終 了 後 自 動 的 に Working Tools の Prime が 選 択 される 緩 衝 液 および 廃 液 入 れを 確 認 後 Start をクリックする 内 容 を 確 認 後 Start をクリックする Prime 終 了 後 Exit をクリックする

9 6 1.セットアップ Prime における 注 意 事 項 解 説 このボックスは Tools Working Tools の 操 作 で 開 くことができる 実 験 途 中 でランニング 緩 衝 液 を 交 換 する 場 合 には Working Tools を 開 いて Prime を 行 う Prime は 新 しくセンサーチップをセットした 時 やランニング 緩 衝 液 を 交 換 した 時 に 行 い ポンプやマイクロ 流 路 系,オートサンプラー 等 をランニング 緩 衝 液 で 洗 浄 置 換 する 操 作 で ある ランニング 緩 衝 液 として 弊 社 から HBS 緩 衝 液 を 発 売 している HBS-EP 10 mm HEPES ph 7.4/0.15 M NaCl/3 mm EDTA/0.005 % Surfactant P 20(pH7.4) フィルターろ 過 脱 気 済 み HBS-P 10 mm HEPES ph 7.4/0.15 M NaCl/0.005 % Surfactant P 20(pH7.4) フィルターろ 過 脱 気 済 み HBS-N 10 mm HEPES ph 7.4/0.15 M NaCl(pH7.4) フィルターろ 過 脱 気 済 み 実 験 目 的 にあわせ 緩 衝 液 の 変 更 は 自 由 であるが 各 自 で 調 製 した 場 合 には 0.22 μm フィ ルターでろ 過 を 行 い さらに 十 分 脱 気 を 行 う また CM5 センサーチップ 使 用 の 場 合 は リガンドの 固 定 化 終 了 時 まで アミン 系 の 緩 衝 液 (トリスあるいはグリシン 緩 衝 液 等 )は 使 用 しない

10 1.セットアップ 7 3)ラックベースの 設 定 Biacore 本 体 にセットしてあるラックベースの 設 定 を 行 う Command Rack Base をクリックする ラックに 変 更 がある 場 合 には をクリックしラックを 選 択 する ラック 設 定 後 OK をクリックする 各 ラックと 使 用 できるバイアルについては 8 ページを 参 照 すること

11 8 1.セットアップ ラックベース 設 定 における 注 意 事 項 解 説 ラックベースは 向 かって 左 側 が Rack Base1 右 側 が Rack Base2 となる 各 ラックは 次 のバイアルがセットできる Thermo_A 7 mm プラスチックバイアル 9 mm ガラスバイアル 0.5 ml 容 エッペンチューブ 16 mm ガラスバイアル Thermo_B 9 mm のガラスバイアル 0.5 ml 容 エッペンチューブ Thermo_C 2 ml プラスチックバイアル 1.5 ml 容 エッペンチューブ MICRO 96 穴 のマイクロタイタープレート 中 央 のラックベー スには 洗 浄 溶 液 専 用 のラック(リージェントラック)がセットできる Reag_A 16 mm ガラスバイアル 2 ml プラスチックバイアル 1.5 ml 容 エッペンチューブ ラックのサンプルの 位 置 は 以 下 のように 指 定 される ラックベースは 向 かって 左 側 が Rack Base1 右 側 が Rack Base2 となる たとえば 右 側 の ラックの f の 列 の 2 番 目 のサンプル( 黒 く 塗 りつぶした 位 置 )は r2f2 となる マイクロ タイタープレート(96 穴 )の 場 合 にも 同 様 な 方 法 で 設 定 する なお Reag_A での 位 置 の 設 定 は 手 前 から RR1,RR2,RR3 である Biacore 社 純 正 以 外 のバイアルを 使 用 する 場 合 の 注 意 事 項 1 バイアルの 底 がラックの 穴 の 底 に 届 くものを 使 用 する 2 ニードルはラックの 穴 の 中 央 に 下 りる バイアルのエッジがぶつからないものを 使 用 す る 3 蓋 付 のバイアルは 蓋 を 取 るかニードルがぶつからないように 注 意 する 4 バイアルの 高 さは 5cm 以 下 のものを 使 用 する

12 1.セットアップ 9 4) 温 度 設 定 フローセルを 含 む 検 出 器 部 位 の 温 度 の 設 定 を 行 う Command Set Temperature をクリックする 4 ~40 の 範 囲 で 設 定 し OK をクリックする 温 度 設 定 における 注 意 事 項 解 説 1 温 度 設 定 は 4~40 で 設 定 できる 2 設 定 温 度 に 達 していない 場 合 には 画 面 上 の states window 中 の 温 度 の 表 示 が 赤 の 点 滅 本 体 インジケータの Temperature のシグナルが 橙 色 の 点 滅 である 設 定 温 度 に 達 し 温 度 が 安 定 した 場 合 には 画 面 上 の 温 度 の 表 示 が 黒 インジケータは 点 灯 に 変 わる 3 温 度 が 安 定 するまでに 比 較 的 時 間 がかかるので 室 温 から 離 れている 場 合 は 早 めに 設 定 する 4サンプルラックの 温 度 を 調 整 したい 場 合 には 恒 温 循 環 槽 のチューブを 本 体 右 側 面 のノ ズルに 接 続 する この 時 専 用 のアダプターを 使 用 する

13 10 1.セットアップ 5) Normalize BIAmaintenance kit 中 の BIAnormalize solution 0.5 ml を R2F2 にセットし Tools Working Tools Normalize を 行 う 溶 液 をセット 後 Start をクリックする Normalize における 注 意 事 項 解 説 この 操 作 は SPR シグナルの 校 正 を 行 うものである 以 下 の 場 合 に 実 行 する 1 設 定 温 度 を 変 更 した 場 合 2 センサーチップの 種 類 を変 更 した 場 合 3 最 大 感 度 を 得 たい 場 合 温 度 が 安 定 してから 行 う

14 2. 基 本 操 作 基 本 操 作 ここでは サンプルのインジェクトについて 基 本 操 作 の 解 説 をする サンプルは Sucrose 溶 液 を 使 用 して 説 明 する BIACORE はセンサーチップ 表 面 近 傍 の 屈 折 率 を 測 定 しているため 密 度 の 異 なる 溶 液 がフローセルを 通 過 するとレスポンスとして 検 出 される (サンプル) 1 2% Sucrose 2 4% Sucrose 3 8% Sucrose 4 16% Sucrose 2-1.サンプルのインジェクト サンプル(100μl)をそれぞれラックにセットする アイコン( )あるいはRun Run sensorgram をクリックし センサー グラムをスタートする Detection modeの 選 択 後 OKをクリックする

15 12 2. 基 本 操 作 流 速 (1~100μl/min)を 入 力 後 OK をクリックする (センサーグラムが 表 示 され 測 定 が 開 始 される) アイコン( )あるいはCommand Inject をクリックする サンプルのポジションおよび 容 量 (10 μl 程 度 )を 入 力 し Start Injection をクリ ックする RU Injection of several concentration of Sucrose Response Time s 2%Sucrose のインジェクション 引 き 続 き 次 のサンプルをインジェクトする

16 RU Tim e s 2. 基 本 操 作 13 全 てのサンプルのインジェクションが 終 了 したら アイコン( )もしくはRun Stop Sensorgramをクリックし 測 定 を 終 了 する マニュアル 操 作 における 注 意 事 項 フローセル 全 部 で 4 個 ある 流 路 の 流 し 方 は 以 下 の 中 から 選 択 できる 1. 単 独 で 使 用 する 場 合 RU フローセル 1 フローセル 2 フローセル 3 フローセル 4 2. 複 数 個 のセルを 同 時 に 使 用 する 場 合 フローセル 1-2 フローセル 3-4 Response Response Time s RU リガンドとの 結 合 コントロール Tim e s フローセル Response コントロール

17 14 2. 基 本 操 作 2-2. レポートポイントの 取 り 方 レポートポイントは センサーグラム 上 の 任 意 の 時 間 におけるレスポンス(RU) を 下 のテーブルに 表 示 させるものである アイコン( )あるいはView Reference Lineをクリックし グラフ 中 にリ ファレンスラインを 表 示 させる マウスのカーソル( 矢 印 )をリファレンスラインの 縦 線 上 に 移 動 後 マウスの 左 ボタンをドラッグし レポートポイントを 取 りたい 時 間 に 移 動 するか もし くはレポートポイントを 取 りたい 場 所 のセンサーグラム 上 の 位 置 でカーソルを ダブルクリックし リファレンスラインを 移 動 する アイコン( )あるいはEdit Add Report Pointをクリックする

18 2. 基 本 操 作 15 Id の 欄 にコメントを 書 きます ベースラインとする 場 合 には Baseline にチェ ックを 入 れる 表 中 の 相 対 値 (RelResp)の 値 が 0 になる リファレンスラインを 他 のポイントに 移 動 後 同 様 にレポートポイントを とるとベースラインからの 相 対 値 (RelResp)が 表 示 される さらに 必 要 な 場 所 のレポートポイントを 作 成 する

19 16 2. 基 本 操 作 レポートポイントにおける 注 意 事 項 解 説 1センサーグラムの 下 の 表 をレポートポイントテーブルと 呼 ぶ サンプルをインジェクト する 前 のベースライン インジェクト 後 の 結 合 量 をレスポンス 量 として 表 示 することがで きる 2レポートポイントの 名 前 として baseline bound 等 を 入 力 する 3レポートポイントは ボックス 中 の Window に 示 された 秒 間 隔 における 平 均 値 である こ の 間 隔 は 2 秒 以 上 で 設 定 することが 可 能

20 2. 基 本 操 作 ファイルの 保 存 得 られたセンサーグラムを 保 存 するには File Save As を 選 択 する Save in:で C:\Bia Users\( 自 分 のフォルダー)に 移 動 後 ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする

21 18 3. リガンドの 固 定 化 3.リガンドの 固 定 化 リガンド 相 互 作 用 を 検 討 する 分 子 のうち 固 定 化 する 分 子 を リガンド と 言 う リガ ンドの 精 製 度 は リガンド 結 合 の 特 異 性 やキャパシティーに 大 きく 作 用 するの で 非 常 に 重 要 な 要 因 となる 90% 以 上 の 精 製 度 のリガンドを 使 用 する リガンドの 固 定 化 方 法 の 種 類 1 リガンドの 固 定 化 方 法 (CM5 を 使 用 する 場 合 )には 以 下 のような 方 法 がある 1 アミンカップリング リガンド 表 面 に 存 在 するアミノ 基 (N 末 端 アミノ 基 あるいはリジン ε-アミノ 基 ) を 利 用 して 固 定 化 する 方 法 CM デキストランのカルボキシル 基 を NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)で 活 性 化 し プレコンセントレーションを 利 用 して 濃 縮 したリガンドを 固 定 化 する 残 った 活 性 NHS 基 をエタノールアミンでブロッキングする 2 チオールカップリング(183 ページ 参 照 ) リガンドチオールカップリング リガンドの 表 面 に 存 在 する 遊 離 型 チオール 基 を 用 いて 固 定 化 する 方 法 表 面 チオールカップリング センサー 表 面 にチオール 基 を 導 入 し リガンドのカルボキシル 基 を 解 して 固 定 化 する 方 法 リガンドの 修 飾 など 操 作 が 複 雑 である 3 アルデヒドカップリング(173 ページ 参 照 ) 大 量 の 糖 鎖 を 持 つムチンタンパク 質 等 の 固 定 化 をする 方 法 糖 鎖 の 非 還 元 末 端 をメタ 過 ヨウ 素 酸 により 解 裂 させアルデヒド 基 を 作 成 し ヒドラジンによりア ミノ 基 を 導 入 したセンサーチップにシッフ 塩 基 で 固 定 化 する 方 法 リガンドの 修 飾 など 操 作 が 複 雑 である

22 3. リガンドの 固 定 化 19 リガンドの 固 定 化 方 法 の 種 類 2 リガンドの 固 定 化 方 法 (SA を 使 用 する 場 合 )には 以 下 のような 方 法 がある DNA の 固 定 化 DNA(プライマー 等 )を 固 定 する 場 合 末 端 ビオチン 標 識 した DNA を 適 当 な 緩 衝 液 に 希 釈 (1~10μg/ml)し そのままインジェクトして 固 定 化 を 行 う この 場 合 には アミン 系 の 緩 衝 液 を 使 用 してもかまわない 50 ベース 以 上 の DNA を 固 定 化 する 場 合 には 荷 電 の 影 響 を 少 なくするために 食 塩 を 150mM 程 度 添 加 する ここでは 固 定 化 法 として 汎 用 されるアミンカップリングを 中 心 に 記 載 する ( 準 備 するもの) アミンカップリングキット(GE ヘルスケア バイオサイエンス 社 製 ) ランニング 緩 衝 液 (トリスあるいはグリシン 緩 衝 液 等 の 1 級 アミンを 含 まな いもの) リガンド(アジ 化 ナトリウム 等 の 求 核 性 物 質 の 含 まないもの) リガンド 希 釈 液 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (リガンドの 等 電 点 よりも 1~2 低 いpH) リガンドの 等 電 点 が 不 明 な 場 合 には 21,89 ページのプレコンセントレーショ ン 操 作 を 行 い 固 定 化 ph を 決 める アミンカップリングキット アミンカップリングキットには 以 下 の 試 薬 が 含 まれている EDC(N-ethyl-N -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochroride) NHS(N-hydroxysuccinimide) 1 M ethanolamine hydrochloride 溶 液 (ph 8.5) ( 試 薬 の 調 製 方 法 ) キットに 添 付 されている 説 明 書 にしたがってい EDC および NHS はそれぞれ 10ml の 超 純 水 に 溶 解 し 直 ちに 200μl ずつ 0.5ml 容 のマイクロチューブあるい は 7mm プラスティックバイアル( 弊 社 発 売 )にそれぞれ 小 分 けし 蓋 をして 使 用 直 前 まで-20 で 冷 凍 保 存 する 使 用 に 際 して 1 組 ずつの 試 薬 を 取 り 出 し 溶 解 後 使 用 する 溶 解 後 の 試 薬 の 再 凍 結 はできない エタノールアミンは 溶 液 で 供 給 されており 4 で 保 存 する 200μl ずつ 小 分 けしておくか 使 用 する 直 前 にサンプリングする

23 20 3. リガンドの 固 定 化 リガンド 希 釈 液 タンパク 質 の 固 定 化 リガンド 濃 度 は 通 常 5~200μg/ml 程 度 になるよう 10mM 酢 酸 緩 衝 液 で 希 釈 して 固 定 化 を 行 う 酢 酸 緩 衝 液 の ph はリガンドの 等 電 点 より 1~2 低 い ph か 21,89 ページに 示 したプレコンセントレーション 操 作 により 決 定 した ph を 用 いる ま た リガンド 希 釈 用 緩 衝 液 は 非 アミン 系 で 比 較 的 低 塩 濃 度 (10 mm)のものを 使 用 する 希 釈 用 緩 衝 液 は ph3.5 以 下 のものは 使 用 しない プレコンセントレー ション 効 果 が 見 られない 場 合 (ペプシン 等 の 酸 性 タンパク 質 )には ビオチン 化 後 SA チップに 固 定 化 する ペプチドや 低 分 子 物 質 の 固 定 化 リガンドがペプチドや 化 合 物 等 低 分 子 物 質 の 固 定 化 の 場 合 は プレコンセン トレーションの 効 果 が 見 られない 場 合 がある この 場 合 には 弱 アルカリ 性 条 件 で 固 定 化 を 行 う つまり プレコンセントレーションを 行 う 代 わりに 高 濃 度 のリガンド 溶 液 を 使 用 する 活 性 型 NHS 基 とアミノ 基 とのカップリング 効 率 は ph8.5 前 後 がもっとも 高 いので この ph 付 近 で 固 定 化 を 行 う 例 えば 希 釈 液 として 10~50mM 炭 酸 緩 衝 液 (ph 8.5)を 使 用 し サンプル 濃 度 を 100μg/ml 以 上 の 比 較 的 高 濃 度 で 固 定 化 する 方 法 である リガンドの 荷 電 の 影 響 がある 場 合 には 食 塩 を 150mM 程 度 添 加 する しかし この 場 合 必 ずしも 目 的 の 固 定 化 量 が 得 られるとは 限 らない 酸 性 タンパクの 場 合 は ビオチン 化 後 SA チッ プへ 固 定 化 する 方 法 をお 勧 めする

24 3. リガンドの 固 定 化 プレコンセントレーションの 検 討 (マニュアル 操 作 ) プレコンセントレーションとは? 固 定 化 操 作 において センサー 表 面 の CM デキストランに 存 在 するカルボキシル 基 は 非 常 に 重 要 である リガンドを 正 に 荷 電 した 状 態 でインジェクトすると 負 に 荷 電 している CM デキストランとの 間 に 静 電 気 的 な 相 互 作 用 が 生 じ リガン ドをデキストラン 中 に 濃 縮 することができる この 方 法 を 用 いることで 固 定 化 効 率 を 上 昇 させることができる したがって リガンドは 等 電 点 よりも 低 い ph の 緩 衝 液 に 希 釈 し リガンドを 正 に 荷 電 させる 必 要 がある 等 電 点 が 既 知 のサ ンプルの 場 合 は リガンドの 等 電 点 よりも 1~2 低 い ph 条 件 を 使 用 すればよい が 等 電 点 が 不 明 な 場 合 には プレコンセントレーションの 検 討 を 行 って... 固 定 化 に 適 する ph を 調 べることができる この 操 作 では 何 も 処 理 していない... フローセルを 使 用 し 各 ph におけるセンサー 表 面 へのリガンド 濃 縮 の 程 度 を 見 るものである サンプル 調 製 例 リガンドを 最 終 濃 度 で 5~50μg/ml になるよう 各 緩 衝 液 で 希 釈 する 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 6) 100μl 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 5) 100μl 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 4) 100μl... この 操 作 によりリガンドは 固 定 化 されることはない インジェクトが 終 了 後 高 い 塩 濃 度 のランニング 緩 衝 液 ( 例 えば 150mM 食 塩 を 含 む HBS 緩 衝 液 )に 置 換 された 後 に 速 やかに 解 離 する しかし リガンドがデキストランに 非 特 異 的 吸 着 を 起 こすことも 考 えられるので 操 作 終 了 後 洗 浄 溶 液 ( 例 えば 50mM NaOH 30 秒 間 ) 等 で 洗 浄 を 行 う プレコンセントレーションに 使 用 したセンサーチッ プはそのまま 固 定 化 に 利 用 することができる (この 操 作 は Application Wizard を 用 いて 行 うこともできる 89 ページ)

25 22 3. リガンドの 固 定 化 サンプル 調 製 例 リガンドを 最 終 濃 度 で 5~50μg/ml になるよう 各 緩 衝 液 で 希 釈 する 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 6) 100μl 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 5) 100μl 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 4) 100μl サンプルをラックにセットする アイコン( )あるいは Run Run Sensorgram をクリックし センサー グラムをスタートする 使 用 する 流 路 を 選 択 し OK をクリックする 流 速 を 10μl/min に 設 定 し OK をクリックする アイコン( )あるいは Command Inject をクリックする サンプルの 位 置 容 量 (μl)を 入 力 し Start Injection をクリックする

26 3. リガンドの 固 定 化 23 引 き 続 き 残 りのサンプルも 同 様 にインジェクトする ph 5 ph 4 ph 6 Human IgG のプレコンセントレーション アイコン( )もしくは Run Stop sensorgram をクリックし 測 定 を 終 了 する プレコンセントレーションの 評 価 について プレコンセントレーション 効 果 は 希 釈 緩 衝 液 の ph を 下 げれば 増 加 する しかし 低 い ph 環 境 下 では 活 性 型 NHS 基 とアミノ 基 とのカップリング 効 率 は 減 少 する 上 記 のセンサ ーグラムの 場 合 ph4 の 方 が 5 比 べ 速 い 速 度 でプレコンセントレーションしているが 必 ずしも ph4 で 固 定 化 量 が 多 いとは 限 らない また タンパク 質 の 安 定 化 のためにはできる だけ 高 めの ph を 使 用 すべきである したがって 濃 縮 効 果 のある 一 番 高 い ph 条 件 を 使 用 する 上 記 の 場 合 ph5 で 十 分 である

27 24 3. リガンドの 固 定 化 3-2. プログラム 操 作 によるリガンドの 固 定 化 リガンドのアミンカップリングについて 記 載 する 固 定 化 は マニュアル 操 作 プログラム 操 作 および Application Wizard(96 ページ 参 照 )で 行 うことができる が ここでは プログラム 操 作 によるリガンドの 固 定 化 について 記 載 する プログラムの 詳 細 については 64 ページ 参 照 のこと 1)ファイルの 呼 び 出 し アイコン( )あるいは File Open をクリックする C:\Program File\BIACORE 3000\Guide\Methods とフォルダーを 開 け アミ ンカップリングのメソッドファイルである Amine をクリックする アイコンの 種 類 1Program File ( 拡 張 子.blm) 2Result File ( 拡 張 子.blr) 3BIAevaluation File ( 拡 張 子.ble) 以 下 のプログラムが 表 示 される

28 3. リガンドの 固 定 化 25 ( 固 定 化 プログラム) DEFINE APROG immob CAPTION Amine coupling!グラフのタイトル FLOW 10! 流 速 10μl/min DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50!NHS/EDC の 混 合 液 の 作 成 * INJECT R2E3 70!NHS/EDC の 混 合 液 の 添 加 -0:10 RPOINT Baseline b!レポートポイントの 表 示 INJECT R2A1 70!リガンド 溶 液 の 添 加 * INJECT R2E4 70!エタノールアミンの 添 加 * INJECT R2F3 10! 洗 浄 溶 液 の 添 加 2:00 RPOINT immob!レポートポイントの 表 示 END MAIN RACK 1 thermo_b!ラックベースの 設 定 RACK 2 thermo_a!ラックベースの 設 定 DETECTION 1! 検 出 フローセルの 設 定 APROG immob!aprog immob の 実 行 APPEND standby!standby の 実 行 END ( 試 薬 およびサンプルの 位 置 ) R2A1 : リガンド( 至 適 な ph に 酢 酸 溶 液 に 希 釈 したもの) R2E1 : NHS(もしくは EDC 冷 凍 庫 から 取 り 出 し 溶 解 直 後 のもの) R2E2 : EDC(もしくは NHS 冷 凍 庫 から 取 り 出 し 溶 解 直 後 のもの) R2E3 : 空 容 器 (9 mm ガラスバイアルあるいは 0.5ml マイクロチューブ) R2E4 : エタノールアミン 溶 液 R2F3 : 洗 浄 溶 液 このプログラムは 1つのフローセルにリガンドを 固 定 化 する 方 法 である 4 つのフローセルに 同 じリガンドを 固 定 する 場 合 や 別 々のリガンドを 固 定 化 す る 場 合 のプログラムを 作 成 する 場 合 には プログラムの 説 明 (79 ページ)を 参 照 すること

29 26 3. リガンドの 固 定 化 (コマンドの 説 明 ) 詳 しいプログラムの 解 説 は 64 ページを 参 照 すること FLOW 10 流 速 を 10μl/min に 設 定 している DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 R2E1 のサンプルと R2E2 のサンプルを 等 量 とり R2E3 で 混 合 液 を 調 製 する ここでは EDC と NHS の 混 合 液 を 作 成 している この 操 作 によって 混 合 液 が 200μl 作 成 される 50 は R2E1 の 混 合 割 合 が 50%であることを 示 している * INJECT R2E3 70 調 製 した 混 合 液 を 70μl インジェクトし センサー 表 面 を 活 性 化 する 添 加 時 間 7 分 7 分 間 の 添 加 で CM デキストランのおよそ 40%が 活 性 化 される ことになる 目 的 によって 時 間 を 増 減 する 残 存 カルボキシル 基 を 少 なくした い 場 合 には この 活 性 化 時 間 を 長 くする 活 性 化 時 間 と 固 定 化 量 との 関 係 は 約 10 分 間 まで 比 例 関 係 である INJECT R2A1 70 R2A1 のポジションにあるリガンドを 70μl インジェクトし カップリングを 行 う 添 加 時 間 7 分 サンプルは 添 加 量 + 30μl(この 場 合 は 100μl)を 用 意 する * INJECT R2E4 70 R2E4 のポジションにある 1M エタノールアミンを 70μl インジェクトし 残 余 の 活 性 型 NHS 基 をブロッキングする EDC と NHS の 混 合 液 の 添 加 時 間 と 同 じ 時 間 添 加 する サンプルは 添 加 量 + 30μl(この 場 合 は 100μl)を 用 意 する * INJECT R2F3 10 R2F3 のポジションにある 洗 浄 溶 液 を 10μl インジェクトすることで センサー 表 面 を 簡 単 に 洗 浄 する 通 常 は 10mM Gly-HCl(pH 1.5~2.0)あるいは 10~50mM NaOH 等 を 使 用 する 1 回 のインジェクションは 1 分 間 以 内 にする

30 3. リガンドの 固 定 化 27 ファイルの 呼 び 出 しおよび 修 正 における 注 意 事 項 解 説 1 試 薬 およびサンプルの 位 置 と 添 加 量 は 自 由 に 変 更 できる 変 更 する 場 合 は プログラム 中 のサンプル 位 置 および 添 加 容 量 を 変 更 する 2 リガンドの 希 釈 液 については 21 ページのプレコンセントレーションの 項 を 参 考 にす る 3 洗 浄 溶 液 の 添 加 は 非 特 異 結 合 により 結 合 しているリガンドを 洗 浄 するために 行 うもの である 不 必 要 な 場 合 には 省 略 する 4 C:\Program Files\BIACORE 3000\Guide\Methods 中 にあるプログラムは 書 き 直 さな いようにする 書 き 直 す 場 合 には 自 分 のフォルダーにオリジナルプログラムをコピー 後 上 書 きするようにする

31 28 3. リガンドの 固 定 化 2)Method の 編 集 作 成 あるいは 修 正 したプログラムのコマンドの 文 字 を 全 部 大 文 字 にし 行 をそ ろえることができる Edit Adjust Method Second あるいは Minute をクリックする define aprog immob caption immobilization flow 5 dilute r2e1 r2e2 r2e3 * inject r2e3 35-0:10 rpoint baseline -b end (Edit Adjust Method Minute すると) DEFINE APROG immob CAPTION immobiilization FLOW 5 DILUTE r2e1 r2e2 r2e3 * INJECT r2e3 35-0:10 RPOINT baseline -b END と 変 更 される METHOD の 編 集 における 注 意 事 項 解 説 1 この 操 作 はプログラムを 実 行 する 上 で 必 ずしも 必 要 ではない プログラムは 大 文 字 と 小 文 字 のどちらを 使 用 してもかまわない また コマンドとコマンドの 間 隔 も 任 意 である (1 スペースあればよい) 2 レポートポイントの 時 間 表 示 を 秒 表 示 にしたい 時 には Second を また 分 表 示 にした い 時 には Minute を 選 択 する

32 3. リガンドの 固 定 化 29 3)エラーの 検 索 作 成 したプログラム 中 に 言 語 等 の 誤 りがあるかを 検 索 する Run Prerun Method をクリックする エラーがある 場 合 には 以 下 の 様 なメッセージが 現 れる エラーの 内 容 が 表 示 されるので OK をクリック 後 訂 正 する >>Expected:'1','2','3','4','1,2','2-1','3,4','4-3','1,2,3,4', '2-1,4-3'... >> ^ DETECTION 5 >> ^ マークのある 項 にエラーがあるので 正 しく 変 更 し もう 一 度 Prerun Method を 実 行 する ( 上 下 のメッセージは 消 去 する 必 要 はない) 何 もエラーが 表 示 されない 場 合 には エラーがない エラーの 検 索 における 注 意 事 項 解 説 1 実 際 にセットしたサンプルの 位 置 の 認 識 はしないので サンプル 位 置 は 間 違 えないよう にする 2 プログラム 実 行 前 には 必 ず( Run Prerun Method )を 実 行 する

33 30 3. リガンドの 固 定 化 4)プログラムの 実 行 Run Run Method をクリックする 呼 び 出 してきたプログラム(Amine.blm)の 内 容 を 書 き 直 した 場 合 以 下 のメッ セージが 表 示 される ここで Yes をクリックすると 元 のファイルが 書 き 直 おされる 基 本 となるメソ ッドファイルは 書 き 換 えないよう 注 意 する 通 常 は No をクリックする 保 存 先 の 各 自 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックす る

34 3. リガンドの 固 定 化 31 Response RU immobilization Time s ( 固 定 化 センサーグラム) プログラムの 実 行 における 注 意 事 項 解 説 1 プログラムを 保 存 しなかった 場 合 でも Method は Result ファイルの 中 に 保 存 される Result ファイルの View Method をクリックすれば その 時 の Method を 見 ることが できる また その Method を 再 実 行 することも 可 能 である 2 拡 張 子.blm は 省 略 しても 自 動 的 に 書 き 込 まれる 拡 張 子 について BIACORE のファイル 名 には 以 下 の 拡 張 子 が 付 いている ファイル 名. blm :Method ファイル ファイル 名. blr :Result ファイル ファイル 名. ble :BIAevaluation software で 作 成 したファイル 拡 張 子 の 種 類 からどれに 属 するファイル 名 か 確 認 できる ( 重 要 ) 実 行 後 にプログラムを 強 制 終 了 したい 場 合 には キーボードの を 同 時 に 押 す Ctrl( 左 下 )+ Break( 右 上 )

35 32 3. リガンドの 固 定 化 5)プログラムの 終 了 プログラムが 終 了 すると Standby 状 態 になる(プログラムの MAIN ボックスの APPEND Standby による) Stop をクリックし Standby を 停 止 する データは 先 に 入 力 したファイル 名 で 保 存 される

36 3. リガンドの 固 定 化 33 固 定 化 全 体 における 注 意 事 項 固 定 化 量 は 実 験 の 目 的 によって 調 節 する 必 要 がある 1 特 異 的 結 合 の 確 認 実 験 特 異 的 な 結 合 を 確 認 するための 実 験 の 場 合 には アナライトのレスポンスが 十 分 得 られる ような 固 定 化 量 があればよい したがって リガンドの 固 定 化 量 は 多 くしてもかまわな い 感 度 を 良 くするためにも 固 定 化 量 を 多 くする 方 が 理 想 的 である 低 分 子 のアナライト の 場 合 には リガンドの 固 定 化 量 を 十 分 に 多 くしなければならない リガンドの 固 定 化 量 とアナライトのレスポンスとの 関 係 は それぞれの 分 子 量 によって 決 まる 固 定 化 したリガンドにアナライトが 最 大 どれだけ 結 合 するか 以 下 の 式 で 算 出 するこ とができる アナライトの 結 合 量 =アナライトの 分 子 量 リガンドの 固 定 化 量 /リガンドの 分 子 量 s ( 最 大 結 合 量 Rmax) (Da) (RU) (Da) s はリガンドの 結 合 部 位 数 ( 例 ) リガンドの 分 子 量 50,000 Da リガンド 固 定 化 量 1,000 RU リガンド 結 合 部 位 数 1 アナライト 分 子 量 20,000 の 場 合 アナライトの 最 大 結 合 量 (Rmax) 以 下 の 値 となる アナライトの 最 大 結 合 量 (Rmax)= 20,000 1,000 / 50,000 1 = 400RU 特 に 低 分 子 のアナライトを 使 用 する 場 合 には 最 大 アナライトの 結 合 量 が 最 低 でも 50~ 100RU 程 度 は 必 要 であるので 注 意 する 2 濃 度 測 定 濃 度 測 定 を 行 う 場 合 には 固 定 化 量 はできるだけ 多 くする 目 安 としては 10,000~15,000RU 程 度 は 固 定 化 したい 固 定 化 量 を 多 くするとスタンダードサンプルを 使 用 した 際 の 検 量 線 の 直 線 性 がより 高 くなる

37 34 3. リガンドの 固 定 化 3 反 応 速 度 定 数 ( 結 合 速 度 定 数 (k ass ) 解 離 速 度 定 数 (k diss ))の 算 出 反 応 速 度 定 数 (Kinetics Parameter)を 算 出 させる 場 合 には 固 定 化 量 はできるだけ 抑 える 必 要 がある 至 適 な 固 定 化 量 は 以 下 の 式 から 得 られた 最 小 固 定 化 量 と 最 大 固 定 化 量 の 間 の 固 定 化 量 (RU)を 目 安 にする ( 最 小 固 定 化 量 ) 200 1/S (リガンドの 分 子 量 /アナライトの 分 子 量 ) ( 最 大 固 定 化 量 ) /S (リガンドの 分 子 量 /アナライトの 分 子 量 ) Sはリガンドの 結 合 部 位 数 例 えば 50 kda のリガンドと 120 kda のアナライトを 使 用 する 場 合 のリガンドの 固 定 化 量 は(S=1 として) 最 小 固 定 化 量 200 1/1 (50,000/120,000)= 83 RU から 最 大 固 定 化 量 /1 (50,000/120,000)= 417 RU の 間 となる 固 定 化 量 を 調 節 する 場 合 には Manual Inject を 使 用 すると 便 利 である(35 ページ 参 照 )

38 3. リガンドの 固 定 化 MANUAL INJECT を 用 いた 固 定 化 量 の 調 節 方 法 Manual Inject は サンプルのインジェクトを 小 刻 みに 繰 り 返 すことのできる Inject の 方 法 であり この 方 法 を 使 用 することで 厳 密 な 固 定 化 量 の 調 節 を 行 う ことができる この 操 作 は 全 ての 段 階 をマニュアル 操 作 で 行 う(プログラム 操 作 では 行 えない) NHS 活 性 化 やエタノールアミンブロッキング 時 は 通 常 の INJECT を 使 用 し リガンドのインジェクト 時 にのみ MANUAL INJECT を 使 用 する アイコン( )あるいは Run Run Sensorgram をクリックし センサーグ ラムをスタートさせる(22 ページ 参 照 ) Manual Inject をする 場 合 には Command Queue を 閉 じておく 必 要 がある 画 面 上 の をクリックする File Close をクリックする Yes をクリックする 画 面 上 から が 消 える

39 36 3. リガンドの 固 定 化 (1)NHS の 活 性 化 NHS/EDC の 当 量 混 合 液 ( 自 分 で 混 合 する)をラックにセットする アイコン( )あるいは Command Inject をクリックする サンプル 位 置 および 添 加 容 量 を 入 力 し Start Injection をクリックする (7 分 間 活 性 化 が 基 本 となる) RU Response Time s NHS 活 性 化 反 応 が 行 われる

40 3. リガンドの 固 定 化 37 (2)リガンドの 添 加 アイコン( )あるいは Command Inject をクリックする MANUAL INJECT を 選 択 し Start Injection をクリックする をクリックする Load Loop をクリックする サンプル 位 置 およびサンプルロード 量 を 入 力 後 OK をクリックする

41 38 3. リガンドの 固 定 化 Manual を 選 択 し Start をクリックするとリガンドが 添 加 され Stop をクリッ クすると 停 止 する(この 操 作 を 繰 り 返 し 固 定 化 量 を 調 節 する) ( 結 合 量 の 確 認 ) アイコン( )をクリックし リファレンスラインを 表 示 させ リガンドイン ジェクション 前 に 移 動 後 View Baseline をクリックすると 画 面 上 のレス ポンスが 0 になる さらに 添 加 後 に 移 動 させると 結 合 量 を 表 示 させること ができる

42 3. リガンドの 固 定 化 39 (3)エタノールアミンの 添 加 NHS/EDC 混 合 液 の 添 加 時 と 同 様 に 通 常 の INJECT コマンドを 使 用 し エタノー ルアミンを 添 加 する(NHS/EDC と 同 じ 添 加 時 間 ) R es Ti この 方 法 を 用 いることで 任 意 の 固 定 化 量 に 調 節 できる なお Application Wizard を 用 いると 簡 単 に 固 定 化 量 の 調 節 ができる(99 ペ ージ 参 照 )

43 40 4. 相 互 作 用 の 検 討 4. 相 互 作 用 の 検 討 アナライト 相 互 作 用 を 見 る 場 合 インジェクトする 方 の 分 子 をアナライトという アナラ イトとしては 血 清 や 培 養 上 清 等 のクルード(crude)なサンプルも 使 用 するこ とができるが 不 溶 性 の 粒 子 等 は 遠 心 などで 除 去 しなければならない また 正 確 な 反 応 速 度 定 数 を 算 出 する 場 合 には サンプルはできるだけ 精 製 したもの を 使 用 する サンプルは できるだけランニング 緩 衝 液 で 希 釈 する 必 要 のある 場 合 には ランニング 緩 衝 液 でゲルろ 過 等 を 使 用 し 緩 衝 液 交 換 するか ランニング 緩 衝 液 をサンプル 溶 解 液 の 条 件 に 変 更 する 緩 衝 液 が 異 なる 場 合 には 結 合 領 域 と 解 離 領 域 の 緩 衝 液 組 成 が 異 なることになる また 溶 液 効 果 (Bulk Effect)が 発 生 する 場 合 があるので 注 意 する(47 ページ 参 照 ) アナライト 濃 度 はアフィニティーや 分 子 量 にもよるが およそ 数 十 ng/ml~ 数 百 μg/ml で 行 う 反 応 速 度 定 数 を 算 出 する 場 合 には 予 想 される K D ( 解 離 定 数 ) 値 濃 度 の 1/10~10 倍 の 濃 度 で 分 析 すると 良 好 な 結 果 が 得 られる 再 生 溶 液 結 合 したアナライトを 強 制 的 に 全 部 解 離 させる 操 作 を 再 生 (Regeneration) 操 作 という 再 生 操 作 は 以 下 の 条 件 を 満 たしていることが 必 要 である 1リガンドの 活 性 を 失 わないこと 2リガンドがセンサーチップ 表 面 から 遊 離 しないこと 3アナライトを 完 全 に 解 離 させること 再 生 溶 液 としては 通 常 は 以 下 のような 種 類 のものを 使 用 する ( 詳 しくは 45 ペ ージ 参 照 ) 1 高 塩 濃 度 溶 液 2pH を 変 化 させる 溶 液 ( 酸 性 溶 液 あるいはアルカリ 溶 液 ) 3キレート 剤 ( 多 価 カチオン 依 存 性 反 応 の 場 合 ) 4 界 面 活 性 剤 5 有 機 溶 媒 6 変 性 剤 再 生 溶 液 を 添 加 する 場 合 には 30 秒 ~1 分 間 の 短 いインジェクションで 行 い 充 分 再 生 されない 場 合 には この 短 時 間 のインジェクションを 数 回 繰 り 返 す( 長 時 間 の 添 加 は 避 ける)

44 4. 相 互 作 用 の 検 討 マニュアル 操 作 による 相 互 作 用 の 検 討 サンプルをラックにセットする アイコン( )あるいは Run Run sensorgram をクリックし センサー グラムをスタートする 使 用 するフローセルの 選 択 およびコントロール 差 し 引 き 機 能 の 選 択 を 行 い OK をクリックする (46 ページ 参 照 ) 流 速 を 設 定 し OK をクリックする 反 応 速 度 定 数 (k ass, k diss )を 算 出 する 場 合 には 比 較 的 速 い 流 速 (20~50μl/min)に 設 定 する アイコン( )あるいは Command Inject をクリックする

45 42 4. 相 互 作 用 の 検 討 INJECT の 右 のをクリックすると 各 種 のインジェクトコマンドが 表 示 される( 下 図 参 照 ) (インジェクトコマンドの 種 類 ) コマンド 内 容 試 料 添 加 量 試 料 消 費 量 INJECT 通 常 使 用 のモード 5-325μl +30μl KINJECT 反 応 速 度 を 算 出 する 際 に 有 効 μl +40μl 解 離 時 間 を 入 力 する QUICKINJECT 試 料 の 必 要 量 が 少 ない 5-325μl +10μl 測 定 開 始 までの 待 ち 時 間 が 少 ない COINJECT 2つのサンプルを 間 隔 を 空 けず 連 続 して 添 加 できる Sample 1: μl +40μl Sample 2: μl +40μl BIGINJECT 大 容 量 の 試 料 を 添 加 する μl +52μl MANUAL INJECT 35 ページを 参 照

46 4. 相 互 作 用 の 検 討 43 RU Response Time s 解 離 状 態 を 観 察 後 再 生 溶 液 (45 ページ 参 照 )を 添 加 し(この 場 合 は INJECT で 良 い) 結 合 したアナライトを 洗 い 流 す RU Response Time s さらに 分 析 するサンプルがある 場 合 には Run Start New Cycle をクリックす ると 同 一 ファイル 内 に 新 しいサイクルとしてセンサーグラムを 開 始 することが できる 測 定 を 終 了 する 場 合 アイコン( )あるいは Run Stop Sensorgram をク リックし 測 定 を 終 了 する レポートポイント 作 成 方 法 については 14 ページをご 参 照 すること 通 常 は サンプル 添 加 前 10 秒 程 度 のポイントでベースラインをとり サンプル インジェクト 終 了 10 秒 ~30 秒 後 を 結 合 量 として 表 示 させる また コントロー ルブランク 差 し 引 きグラフを 表 示 している 場 合 には サンプルインジェクト 終.. 了 直 前 の 値 を 結 合 量 とする 場 合 もある

47 44 4. 相 互 作 用 の 検 討 RU Binding of DSA(100ug/ml) to immobilized Asialofetuin Time s 相 互 作 用 のセンサーグラム

48 4. 相 互 作 用 の 検 討 45 再 生 溶 液 について 再 生 溶 液 は 通 常 以 下 のようなものが 使 用 されるが 結 合 したアナライトが 完 全 に 再 生 され かつ 固 定 化 したリガンドの 活 性 が 保 持 されていなければならない 再 生 溶 液 の 例 試 薬 濃 度 あるいは ph ( 塩 ) NaCl < 1M ( 酸 性 条 件 ) 10mM Gly-HCl > ph 1.5 HCl < 100mM Phosphoric acid < 100mM Formic acid < 20% (アルカリ 条 件 ) 10mM Gly-NaOH < ph 12 NaOH Ethanolamine Ethanolamine-HCl < 100mM < 100mM < 1M (キレート 剤 )- 多 価 カチオン 依 存 性 反 応 の 場 合 EDTA < 0.35M ( 界 面 活 性 剤 ) Surfactant P-20 (Tween 20) < 5% Triton X-100 < 5% SDS < 0.5% Octylglycoside < 40mM ( 有 機 溶 媒 ) Acetonitrile < 20% DMSO < 8% Ethyleneglycol in HBS buffer < 50% Ethanol < 20% Formamide < 40% ( 変 性 剤 ) Guanidine-HCl Urea < 5M < 8M

49 46 4. 相 互 作 用 の 検 討 流 路 の 選 択 について 実 験 の 目 的 によって サンプルを 流 す 流 路 を 選 択 できる ブランクコントロールを 同 時 にとる 場 合 には 複 数 のセルを 選 択 後 インラインコントロ ール 差 し 引 き 機 能 を 利 用 して コントロールを 差 し 引 いたグラフを 表 示 することができる この 場 合 コントロールセルとできるのは フローセル1と3である 上 図 の 場 合 フローセル1をコントロールにして フローセル2のレスポンスからフロー セル1のレスポンスを 差 し 引 きしたグラフを 表 示 することができる また Fc を 選 択 すると 以 下 のボックスの 各 種 引 き 算 のグラフを 表 示 することができる

50 4. 相 互 作 用 の 検 討 47 センサーグラムの 表 示 表 示 するセンサーグラムを 変 更 することができる 11 本 表 示 (Single Plot) View Plot Single をクリックすると センサーグラム 1 本 だけを 表 示 する 左 上 の Curve: のをクリックし 表 示 セ ンサーグラムを 選 択 することができる 2 複 数 表 示 (Overlay Plots) View Plot Overlay をクリックすると すべてのセンサーグラムを 表 示 することができる 3カーブの 種 類 による 表 示 表 示 センサーグラムの 種 類 が 多 い 場 合 には センサーグラムの 種 別 で 表 示 変 更 することが できる View Plot Curve Classes をクリックし Curves:で 選 択 することで 各 フローセルのセン サーグラムもしくは 差 し 引 きグラフを 選 択 して 表 示 することができる サンプルの 調 製 サンプルは できるだけランニング 緩 衝 液 で 希 釈 する サンプル 溶 液 とランニング 緩 衝 液 の 組 成 とが 異 なる 場 合 には 溶 液 効 果 (bulk effect)が 大 きくなる 場 合 がある Bulk Effect

51 48 4. 相 互 作 用 の 検 討 インジェクトの 中 止 インジェクトを 途 中 で 中 止 したい 場 合 には アイコン( )もしくは Command Stop Inject をクリックする ニードルに 残 ったサンプルを 設 定 したポジション(あるいは WASTE) に 戻 すことができる インジェクトコマンドの 拡 張 機 能 Extra Cleanup クルードなサンプル 等 を 使 用 し 添 加 後 の 洗 浄 を 通 常 よりも 良 くしたい 場 合 には 添 加 時 インジェクションボックスの 拡 張 機 能 を 利 用 する More>>をクリックする Extra Cleanup にマークを 入 れる

52 4. 相 互 作 用 の 検 討 49 Command Queue について マニュアル 操 作 でセンサーグラムを 開 始 すると Command Queue ボックスのアイコンがセ ンサーグラム 画 面 右 上 に 表 示 される このボックスをクリックして 開 くと マニュアル 操 作 で 入 力 したコマンドを 確 認 することができる 入 力 したコマンドは 入 力 順 に 実 行 してい く また 入 力 したコマンドの 1 つを 削 除 したい 場 合 には Edit Delete コマンド 間 に コマンドを 挿 入 したい 場 合 には Edit Insert をクリックし 新 たにコマンドを 入 力 する Command Queue ボックスは 右 上 の 縮 小 ボタンをクリックしてアイコン 化 ( 縮 小 )すること ができる また アイコンをクリックすると 再 びボックスを 開 くことができる

53 50 4. 相 互 作 用 の 検 討 4-2. プログラムによる 相 互 作 用 の 検 討 固 定 化 と 同 様 に 基 本 となるメソッドファイルを 呼 び 出 し 修 正 後 実 行 する ここでは 相 互 作 用 検 討 用 のメソッドファイルである Assay.blm を 基 本 に 説 明 す る プログラムの 詳 細 については 64 ページを 参 照 すること Application Wizard を 用 いると 簡 単 に 相 互 作 用 の 実 験 を 行 うことができる 1. 特 異 的 結 合 の 検 討 (スクリーニング) 122 ページ 参 照 2. 結 合 解 離 反 応 速 度 定 数 の 算 出 128 ページ 参 照 1)ファイルの 呼 び 出 し アイコン( )あるいは File Open をクリックする C:\Program Files\BIACORE 3000\guide\Methods とフォルダーを 開 け 相 互 作 用 測 定 用 のファイルである Assay.blm を 選 択 後 Open をクリックする

54 4. 相 互 作 用 の 検 討 51 DEFINE APROG assay PARAM %pos %ID %conc CAPTION Binding of %ID(%conc) to immobilized antibody FLOW 20 FLOWPATH 1,2 * KINJECT %pos :10 RPOINT Baseline -b 3:10 RPOINT bound * QUICKINJECT R2F3 20 2:00 RPOINT Regeneration END MAIN RACK 1 THERMO_B RACK 2 THERMO_A DETECTION 2-1 APROG assay R2A1 Antigen 25ug/ml APROG assay R2A2 Antigen 12.5ug/ml APROG assay R2A3 Antigen 6.25ug/ml APROG assay R2A4 Antigen 3.125ug/ml APPEND standby END このプログラムでは フローセル2に 固 定 化 したリガンドに 対 し アナライト を 反 応 させる 場 合 のプログラムを 表 示 している(フローセル1はコントロール) コントロールの 差 し 引 きグラフを 作 成 する 場 合 には DETECTION 2-1 に 設 定 す る DETECTION の 設 定 (シングル 検 出 ) (マルチ 検 出 ) ( 差 し 引 き 機 能 ) DETECTION 1 DETECTION 1,2 DETECTION 2-1 DETECTION 2 DETECTION 3,4 DETECTION 4-3 DETECTION 3 DETECTION 1,2,3,4 DETECTION 2-1,3-1,4-1 DETECTION 4 DETECTION 2-1,4-3 以 上 の 中 から 選 択 する

55 52 4. 相 互 作 用 の 検 討 このプログラムにおけるサンプルの 位 置 サンプルポジション サンプル( 例 ) 濃 度 ( 例 ) R2A1 Antigen 25μg /ml R2A2 Antigen 12.5μg /ml R2A3 Antigen 6.25μg /ml R2A4 Antigen 3.125μg /ml R2F3 再 生 溶 液 (10mM Gly-HCl (ph 1.75)) 2)Method の 編 集 固 定 化 操 作 の 項 (28 ページ)を 参 照 すること 3)エラーの 検 索 固 定 化 操 作 の 項 (29 ページ)を 参 照 すること 4)プログラムの 実 行 固 定 化 操 作 の 項 (30 ページ)を 参 照 すること RU Binding of DSA(100ug/ml) to immobilized Asialofetuin Time s 5)プログラムの 終 了 固 定 化 操 作 の 項 (32 ページ)を 参 照 すること ( 重 要 ) 実 行 後 にプログラムを 強 制 終 了 したい 場 合 には キーボードの を 同 時 に 押 し 緊 急 停 止 する Ctrl( 左 下 )+Break( 右 上 )

56 4. 相 互 作 用 の 検 討 53 プログラムの 実 行 における 注 意 事 項 解 説 Method ファイルは Result ファイル 中 に 保 存 される Result ファイル 上 で View Method をクリックすれば センサーグラム 作 成 時 の Method が 表 示 される ま た 改 めてその Method を 実 行 することができる 4-3.ファイルの 保 存 様 式 データは1つのサンプルで 1 つのグラフ(サイクル)として 保 存 される Cycle のサイクル 番 号 を 選 択 すると 他 のサンプルのデータを 表 示 するこ とができる 1つのファイルの 中 にたくさんの Cycle が 存 在 することになる

57 54 5.シャットダウン 5.シャットダウン 5-1. 実 験 の 終 了 実 験 が 終 了 した 場 合 には 次 の 2 方 法 のどちらかを 行 う 1 Standby 状 態 での 放 置 2 電 源 を 落 として 終 了 比 較 的 頻 繁 (3 日 以 内 に 使 用 する)に BIACORE を 使 用 する 場 合 には 1の Standby にする 3 日 以 上 使 用 しない 場 合 には 2の 電 源 を 落 として 終 了 を 行 う 1 Standby の 実 行 Tools Working Tools をクリックし Standbyを 選 択 し 実 行 する 5 μl/min の 流 速 で 最 大 96 時 間 ランニング 緩 衝 液 を 送 り 続 ける 操 作 を 自 動 的 に 行 う 週 末 に 使 用 しないような 場 合 Standby を 実 行 する 96 時 間 の Standby でランニング 緩 衝 液 の 消 費 量 はおよそ 80 ml 程 度 である 2 電 源 を 落 として 終 了 電 源 を 落 とす 場 合 には 基 本 的 にシステムを 水 で 洗 浄 して Biacore の 流 路 中 の 緩 衝 液 を 完 全 に 除 く( 洗 浄 には 洗 浄 用 センサーチップを 使 用 ) 流 路 系 等 に 塩 の 析 出 を 防 ぐために 行 うものである これには 2 つの 方 法 がある 超 純 水 で Prime 緩 衝 液 ボトルを 超 純 水 ボトルに 置 き 換 え Tools Working Tools をクリック し Primeを 実 行 する Close 16 mm ガラスバイアルに 超 純 水 を 3 ml 入 れ R2F3 におき Tools Working Tools をクリックし Closeを 実 行 する

58 5. シャットダウン センサーチップの 抜 きと(Undock) Command Undock をクリックし Undockを 実 行 する フロントパネルの Sensor chip の 緑 のライトが 点 灯 から 点 滅 に 変 わったら センサーチップを 抜 きとる Biacore システム コンピューター モニター プリンターの 電 源 を Off にする ランニング 緩 衝 液 廃 液 入 れをかたづける 5-3.センサーチップの 保 存 実 験 に 使 用 後 Undock したセンサーチップは 以 下 の 方 法 で 保 存 することができ る 1Dry 状 態 での 保 存 取 り 出 したセンサーチップを 50 ml 容 のふたつプラスチック 管 等 に 入 れ 4 で 保 存 する 安 定 なタンパク 質 や DNA を 固 定 したセンサーチップの 保 存 に 用 いる 2Wet 状 態 での 保 存 取 り 出 したセンサーチップのシート 部 分 をカバーから 抜 きとり シートだけを PBS 等 の 緩 衝 液 を 入 れた 容 器 (50 ml 容 のふたつプラスチック 管 等 )に 入 れ 4 で 保 存 する センサーチップを 再 Dock するときには シートについたバッファ ーをふきとった 後 カバーに 戻 し 使 用 する リガンドの 固 定 してある 側 につい ては 細 くとがらせたキムワイプ 等 をセンサー 部 分 の 四 角 の 隅 に 置 き 余 分 な バッファーを 吸 い 取 る リガンドの 固 定 していない 側 のセンサー 部 分 は 反 射 面 でとなるので キムワイプ 等 で 全 体 をきれいにふきとる 反 射 面 に 濁 りや 汚 れ 等 がないように 注 意 する センサー 部 分 以 外 の 白 い 部 分 は キムワイプ 等 でし っかりふきとる タンパク 質 の 種 類 によっては どちらの 方 法 を 用 いても 保 存 中 に 変 性 する 場 合 があるので 再 Dock 後 活 性 を 確 認 すること

59 56 6.メンテナンス 6.メンテナンス 6-1. メンテナンス Biacoreのメンテナンスは Working Tools(Tools Working Tools ) 中 のコマ ンドを 用 いて 行 う 実 験 を 行 う 前 に Prime 新 しいセンサーチップを Dock したときやランニング 緩 衝 液 を 交 換 したときに 行 う 操 作 である ポンプや IFC(マイクロ 流 路 系 ) オートサンプラー 等 をランニ ング 緩 衝 液 で 置 換 洗 浄 する ( 所 要 時 間 約 6 分 20 秒 間 ) Prime はランニング 緩 衝 液 でシステムを 初 期 化 する 操 作 である 大 きく 塩 濃 度 が 変 化 する 緩 衝 液 や 粘 性 の 異 なる 緩 衝 液 に 交 換 する 場 合 には Prime を 2~3 回 繰 り 返 すことをお 勧 めする ランニング 緩 衝 液 で 洗 浄 したい 場 合 に Flush IFC とフローセルをランニング 緩 衝 液 で 簡 単 に 洗 浄 する ( 所 要 時 間 約 2 分 20 秒 間 ) Rinse IFC フローセル 回 収 カップをランニング 緩 衝 液 で 高 流 速 にて 洗 浄 する ( 所 要 時 間 約 3 分 間 ) 通 常 の 洗 浄 は 実 験 の 各 段 階 で 自 動 的 に 行 われるが 粘 性 の 高 いサンプルや 非 常 にクルードなサンプルを 用 いたときなどに 使 用 する 定 期 的 な 洗 浄 Desorb( 毎 週 1 回 が 目 安 ) IFC やフローセル 等 に 付 着 したタンパク 質 や 脂 質 を 洗 浄 する 操 作 である BIA メンテナンスキット 中 の BIAdesorb solution 1(0.5 % SDS 溶 液 )および BIAdesorb solution 2(50 mm Gly-NaOH ph 9.5)を 使 用 する

60 6.メンテナンス 57 Thermorack A をラックポジション 2( 右 側 )にセットし R2F3 に 3ml の BIAdesorb solution 1 を R2F4 に 3 ml の BIAdesorb solution 2 をセットして 行 う ( 所 要 時 間 約 22 分 間 ) BIACORE のメンテナンスにおいて Desorb は 非 常 に 重 要 である BIAdesorb solution 1 は 4 で 保 存 すると 結 晶 が 析 出 するので 室 温 におくこと センサーチップに 固 定 してあるリガンドは 失 活 するので 必 ず 洗 浄 用 のセン サーチップと 入 れ 替 えて 行 う 設 定 温 度 を 20 以 下 で 行 わない Sanitize( 毎 月 1 回 が 目 安 ) IFC やフローセルを 殺 菌 する 操 作 である BIAdisinfectant solution( 次 亜 塩 素 酸 ナトリウム 溶 液 )と 超 純 水 を 使 用 する ステップ 1:1.5 ml の BIAdisinfectant solution を BIA メンテナンスキット 内 の 専 用 の 容 器 に 入 れ 20 ml の 超 純 水 で 希 釈 し ランニング 緩 衝 液 の 位 置 に 置 き 実 行 する ステップ 2: 超 純 水 15 ml をランニング 緩 衝 液 の 位 置 に 置 き 実 行 する センサーチップに 固 定 してあるリガンドは 失 活 するので 必 ず 洗 浄 用 のセン サーチップと 入 れ 替 えて 行 う Sanitize 終 了 後 ランニング 緩 衝 液 あるいは 超 純 水 で Prime を 1~2 回 行 う 病 原 性 があるサンプル 等 を 使 用 したときには 適 時 Sanitize を 実 行 する 6-2. Airの 除 去 脱 気 していない 緩 衝 液 を 使 用 したり Air をインジェクトすると Air が 流 路 系 内 に 留 まってしまうことがある

61 58 6.メンテナンス このような 場 合 には 以 下 の 操 作 を 順 次 行 い Air の 除 去 を 確 認 する 1 Tools Working Tools Prime Flush あるいはRinseを 組 み 合 わせて 数 回 行 う 2 Tools Service Tools Uncloggingを 行 う... 3 充 分 脱 気 したランニング 緩 衝 液 をセットし Prime を 数 回 繰 り 返 す 上 記 のような 乱 れが 解 決 しない 場 合 には IFC(マイクロ 流 路 系 )の 劣 化 の 可 能 性 も 考 えられるので システムチェックを 行 って 機 械 の 状 態 を 把 握 する(59 ペ ージ 参 照 ) 6-3. 流 路 系 に 詰 まりがあるとき 不 溶 性 のサンプルや 吸 着 性 の 高 いサンプルを 使 用 した 場 合 には 流 路 が 詰 まる 場 合 がある このような 場 合 には センサーグラムに 乱 れが 発 生 したりする RU Rabbit IgG 1.25µg/ml Response Time s Unclogging を 行 って 詰 まりを 除 去 する Tools Service Tools のUncloggingを 行 う これは ランニング 緩 衝 液 を 高 流 速 で 流 すことにより 詰 まりを 除 去 するもの である

62 6.メンテナンス システムチェック ベースラインがドリフトするなど 機 械 の 調 子 が 思 わしくない 場 合 には 以 下 の 方 法 でシステムチェックを 行 う 使 用 するもの 1 新 しいセンサーチップ CM5( 使 用 しているチップは 使 用 できない) 2 HBS-EP 緩 衝 液 3 9mm ガラスバイアル 4 BIAtest soluton(bia maintenance kit) ( 方 法 ) BIA maintenance kit 中 の BIAtest solution 1 ml を 9 mm のガラスバイアルに 入 れ R2F1 にセットする(あらかじめ ラック 2 に Thermo_A をセットしておく) 空 の 9mm のガラスバイアル 4 本 を R2E1 から R2E4 にセットする Tools Test tools System checkをクリックする ( 所 要 時 間 : 約 40 分 ) Start をクリックする

63 60 6.メンテナンス ( 結 果 の 表 示 ) RU Re sponse Time s (システムの 評 価 ) 約 40 分 間 のシステムチェック 終 了 後 上 記 のようなボックスが 表 示 される Evaluateをクリックする

64 6.メンテナンス 61 RESULTS A. IFC Serial Sequential Clip Fc 1: OK OK -5 OK Fc 2: OK OK 7 OK Fc 3: OK OK 45 OK Fc 4: OK OK 37 OK Fc 1-2: OK 10 OK Fc 3-4: OK 17 OK Fc : OK 45 OK Leaks: 23 OK B. Refractometer test 15% Sucrose Baseline level Fc 1: Fc 1: Fc 2: Fc 2: Fc 3: Fc 3: Fc 4: Fc 4: Average: ( ) Average: Stdev: 27 ( < 200 ) Stdev: 29 ( < 300 ) C. Mixing Mix 1: Mix 2: Average: Difference (%): 1.2 OK Dilution factor: Check! D. Noise Short term Stdev Long term Slope Fc 1: 0.08 ( < 0.2 RU ) Fc 1: 0.01 ( < 0.05 RU/s) Fc 2: 0.05 ( < 0.2 RU ) Fc 2: 0.00 ( < 0.05 RU/s) Fc 3: 0.06 ( < 0.2 RU ) Fc 3: 0.00 ( < 0.05 RU/s) Fc 4: 0.08 ( < 0.2 RU ) Fc 4: 0.01 ( < 0.05 RU/s) エラーがある 場 合 には 赤 色 で 表 示 される 次 ページの 解 説 にしたがって 対 処 す る それでもシステムの 調 子 が 思 わしくない 場 合 には 機 械 の 故 障 が 考 えられ る システムチェックはできるだけ 定 期 的 に 実 施 する

65 62 7.データ 管 理 7.データ 管 理 実 験 結 果 ファイルは 各 自 のフォルダー 内 に 保 存 する 各 自 のフォルダーは 以 下 の 方 法 で Bia Users フォルダーの 中 に 作 成 する 1My Computerから 作 成 する 方 法 Windows 初 期 画 面 の My computer( ) をクリックする Bia(C):をクリックし Bia Users のフォルダーをダブルクリックして 開 く File New Folderをクリックし フォルダー 名 入 力 後 Enterをクリックす る

66 7.データ 管 理 63 2Exploreから 作 成 する 方 法 Start Program Windows Explores をクリックする C:(ハードディスク)の 中 のBia Usersのフォルダーをハイライトにし File New Folderをクリックする フォルダー 名 を 入 力 し Enter をクリックする フォルダーの 作 成 における 注 意 事 項 解 説 自 分 のフォルダーは Bia Users の 中 に 作 成 する 他 のフォルダー 内 に 作 成 すると( 例 えば Biacore 等 ) ソフトウェアの 再 インストール 時 に 消 去 されてしまう 場 合 がある 各 自 のフォルダーの 中 に さらに 詳 細 なフォルダーを 作 成 することも 可 能 である 日 付 あるいは 実 験 内 容 など 細 かくフォルダーを 作 成 すると 便 利 である ファイルの 容 量 について 基 本 的 な 実 験 での 各 ファイルの 容 量 はおおよそ 以 下 のようになる 1 固 定 化 操 作 (アミンカップリング) 1 個 のフローセルを 使 用 した 場 合 約 20 kb 4 個 のフローセルを 使 用 した 場 合 約 76 kb (チオールカップリング) 1 個 のフローセルを 使 用 した 場 合 約 20 kb 2 相 互 作 用 の 検 討 1 個 のフローセル 使 用 5 サンプルの 場 合 約 90 kb 5 個 のフローセル 使 用 5 サンプルの 場 合 約 150 kb

67 64 8. プログラムの 説 明 8.プログラムの 説 明 ここでは 簡 単 なプログラムを 基 礎 から 理 解 することを 目 的 として 説 明 する BIACORE のプログラムは 基 本 的 に 1 つの MAIN ボックスと 1 つあるいは 複 数 個 の DEFINE APROG ボックスから 成 り 立 っている MAIN ボックスは Method の 諸 条 件 を 決 め DEFINE APROG ボックスで 実 際 の 実 験 操 作 を 行 う どちらのボッ クスも 最 後 の 行 に END を 入 力 してボックスを 括 る ステップ 1: MAIN ボックス 1 つのプログラムには 必 ず 1 つだけの MAIN ボックスが 存 在 する MAIN ボック スの 内 容 は 上 のコマンドから 順 次 実 行 する プログラムは MAIN ボックスだけ で 動 かすことができる 非 常 に 簡 単 な MAIN ボックスのみのプログラムを 示 すと 次 のようになる File New Method をクリックし 新 しいMethodボックスを 開 き プログラムを 入 力 する MAIN DETECTION 1 END Run Run Method をクリックすると プログラムを 実 行 する モニター 画 面 上 の 右 下 Status windowのdetectionが 1 に 設 定 されすぐにプログラムが 終 了 する このように MAINボックス 内 のコマンドを 実 行 する 次 に この MAIN を 少 しだけ 複 雑 にする 以 下 のプログラムを 入 力 する 同 様 に Run させる MAIN DETECTION 1 DETECTION 2 DETECTION 3 DETECTION 4 END Run させると DETECTION と 切 り 替 わり 終 了 する このように MAIN ボックスはコマンドを 上 から 順 番 に 実 行 していく

68 8. プログラムの 説 明 65 ( 参 考 ) MAIN ボックスだけを 使 用 し 便 利 な 洗 浄 プログラムを 組 むことができる プロ グラムで Working Tools 中 のメンテナンスコマンドを 実 行 することができる MAIN Prime Prime Rinse Rinse END 上 記 のように 入 力 後 Run させると Prime を 2 回 Rinse を 2 回 実 行 して 終 了 する しばらく BIACORE を 洗 浄 したいときに 便 利 である このように プログラム 中 に MAIN ボックスが 1 個 あれば プログラムは 実 行 さ れる また MAIN ボックスがないとプログラムを 実 行 させることができない ステップ 2: APROGボックス プログラムは MAIN ボックスがあれば Run させることができるが MAIN ボック スだけではサンプルの 添 加 等 の 実 験 操 作 を 行 うことはできない そこで APROG (Analysis Program の 略 )ボックスを 使 用 してこれらの 操 作 を 行 う ここでは サンプルを 1 回 インジェクトするプログラムを 作 成 してみる ラック 1 の R2A1 にサンプルをセットする このサンプルを 1 分 間 インジェクト するプログラムを 作 成 する DEFINE APROG injection FLOW 5 INJECT R2A1 5 END FLOW は 流 速 の 設 定 で この 場 合 5 μl/min になる DEFINE APROG injection の injection とは この APROG ボックスの 名 前 になる このプログラムを 入 力 し Run Prerun Methodを 行 うと 以 下 のような error が 表 示 される (Prerun Methodは 作 成 したプログラム 言 語 が 正 しいかどうか 検 索 するものである 29 ページ 参 照 )

69 66 8. プログラムの 説 明 >> Expecting keyword MAIN これは MAIN ボックスがないというメッセージである. プログラムは APROG ボックスだけで 実 行 することはできない 次 のプログラムのように MAIN ボックスを 使 用 して APROG ボックスを 行 う 命 令 を 入 力 する DEFINE APROG injection FLOW 5 INJECT R1A1 5 END MAIN END DETECTION 1 APROG injection まず MAIN ボックスを 順 番 に 実 行 し APROG injection で 上 記 の DEFINE APROG injection が 実 行 される APROG ボックスが 終 了 すると MAIN ボックスの END と なりプログラムが 終 了 する DEFINE APROG( 名 前 )と MAIN ボックスの APROG ( 名 前 )の 名 前 が 一 致 し ていないとプログラムは 実 行 されない

70 8. プログラムの 説 明 67 APROG を 数 回 繰 り 返 したい 場 合 には MAIN ボックスの APROG injection を 繰 り 返 したい 回 数 入 力 する 以 下 の 場 合 には APROG を 2 回 繰 り 返 して 実 行 する DEFINE APROG injection FLOW 5 INJECT R1A1 5 END MAIN END DETECTION 1 APROG injection APROG injection これを 少 し 変 形 すると APROG injection をフローセルを 変 えて 実 行 することが できる DEFINE APROG injection FLOW 5 INJECT R1A1 5 END MAIN END DETECTION 1 APROG injection DETECTION 2 APROG injection DETECTION 3 APROG injection DETECTION 4 APROG injection

71 68 8. プログラムの 説 明 ステップ 3: レポートポイント レポートポイントをとることで センサーグラムの 任 意 の 時 間 における 測 定 値 (RU)をセンサーグラムの 下 のレポートポイントテーブルに 表 示 させることが できる (14 ページ 参 照 ) この 表 がレポートポイントテーブルである このようなレポートポイントをプログラムでとることができる DEFINE APROG Injection FLOW 5 0:10 RPOINT 10 sec 0:20 RPOINT 20 sec 0:30 RPOINT 30 sec END MAIN END DETECTION 1 APROG injection センサーグラムをスタートさせた 後 任 意 の 時 間 でレポートポイントをとりこ む プログラム 中 の RPOINT の 前 の 時 間 がレポートポイントをとりこむ 時 間 とな る 0:20 RPOINT 20 sec

72 8. プログラムの 説 明 69 この 場 合 には センサーグラム 測 定 開 始 から 20 秒 後 にレポートポイントを 作 成 することになる プログラム 中 の RPOINT の 右 側 に 入 力 したもの( 例 えば 10 sec 20 sec 30 sec) はコメントなり 表 中 に 表 示 される レポートポイントテーブルの AbsResp は グラフ 上 の 値 ( 絶 対 値 ) RelResp は 設 定 したベースラインとの 差 ( 相 対 値 )に なる レポートポイントは 設 定 した 時 間 を 中 心 とした 5 秒 間 の 平 均 値 として 計 算 される(Window 5)

73 70 8. プログラムの 説 明 (アスタリスクマーク(*)を 使 用 した 時 間 設 定 の 仕 方 ) レポートポイントの 時 間 をセンサーグラム 開 始 からの 時 間 の 設 定 では 紛 らわし いので コマンドの 実 行 開 始 時 間 からの 設 定 にすることができる DEFINE APROG assay FLOW 5 * INJECT R1A1 5 0:10 RPOINT 10 sec 0:20 RPOINT 20 sec 0:30 RPOINT 30 sec * INJECT R1A1 5 0:10 RPOINT 10 sec 0:20 RPOINT 20 sec 0:30 RPOINT 30 sec END MAIN DETECTION 1 APROG assay END 例 えば 上 のプログラムの 0:10 RPOINT 10 sec は その 直 前 の * INJECT R1A1 5 の* 印 からの 時 間 つまり R1A1 のサンプルのインジェクション 開 始 時 間 から 10 秒 後 にレポートポイントを 作 成 することになる 上 のプログラムでは さら に 20 秒 後 30 秒 後 にレポートポイントをとるようになっている

74 8. プログラムの 説 明 71 (ベースラインの 取 り 方 ) サンプルの 結 合 量 を 表 示 させる 場 合 には インジェクトする 前 の 値 をベースラ インとし 結 合 量 をベースラインとの 相 対 値 で 表 示 させる プログラム 中 の RPOINT コマンドの 後 に-b と 入 力 すると 0:10 RPOINT 10 sec -b そのときの 値 がベースライン( 相 対 値 0)となり それ 以 後 の 値 がベースライン との 差 として 表 示 される DEFINE APROG assay FLOW 5 * INJECT R1A1 5 0:10 RPOINT 10 sec -b 0:20 RPOINT 20 sec 0:30 RPOINT 30 sec END

75 72 8. プログラムの 説 明 ステップ 4: DETECTIONとFLOWPATH BIACORE 3000 の 場 合 には 4 つのフローセルをそれぞれ 単 独 に 使 用 する 以 外 に いろいろな 組 み 合 わせで 直 列 に 流 して 分 析 を 行 うことができる これを 設 定 す るには 以 下 の 2 つのパラメーターを 設 定 する DETECTION : 検 出 のモード FLOWPATH : 流 路 の 設 定 DETECTION は 検 出 のモードのことである(MAIN ボックスで 設 定 ) FLOWPATH は 流 路 への 流 し 方 である(APROG ボックスで 設 定 ) それぞれは 以 下 の 組 み 合 わせの 中 から 設 定 できる FLOWPATH (APROG) DETECTION (MAIN) ,2 1,2 1,2(フローセル 1 をコントロールとする 場 合 ) 2-1 3,4 3,4 3,4(フローセル 3 をコントロールとする 場 合 ) 4-3 1,2,3,4 1,2,3,4 1,2,3,4(フローセル 1 をコントロールとする 場 合 ) 2-1,3-1,4-1 1,2,3,4(フローセル 1 および 3 をコントロールとする 場 合 ) 2-1,4-3

76 8. プログラムの 説 明 73 実 験 の 途 中 で FLOWPATH を 変 更 することができる FLOWPATH 1 FLOWPATH 2 FLOWPATH 3 FLOWPATH 4 FLOWPATH 1,2 FLOWPATH 1,2,3,4 上 の 中 から 選 択 することができる 途 中 で FLOWPATH を 変 更 する 場 合 には DETECTION モードは 必 ず DETECTION 1,2,3,4 に 設 定 する DEFINE APROG path FLOW 10 FLOWPATH 1 FLOWPATH 2 FLOWPATH 3 FLOWPATH 4 END MAIN END DETECTION 1,2,3,4 APROG path 上 のプログラムではスタート 後 FLOWPATH が 順 番 に 変 更 される

77 74 8. プログラムの 説 明 DEFINE APROG path FLOW 10 FLOWPATH 1 INJECT R1A1 10 FLOWPATH 2 INJECT R1A1 10 FLOWPATH 3 INJECT R1A1 10 FLOWPATH 4 INJECT R1A1 10 END MAIN END DETECTION 1,2,3,4 APROG path 上 のプログラムの 場 合 FLOWPATH 1 にした 後 R1A1 をインジェクトし さら に FLOWPATH 2 FLOWPATH 3 FLOWPATH 4 と 随 時 流 路 を 変 更 し R1A1 のサ ンプルをインジェクトすることになる

78 8. プログラムの 説 明 75 ステップ 5: 固 定 化 のプログラム C:\Program Files\Biacore 3000\Guide\Methods とフォルダーを 開 け 固 定 化 のプログラムである Amine.blm をクリックし ファイルを 呼 び 出 す DEFINE APROG immob CAPTION Amine coupling FLOW 10 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E3 70-0:10 RPOINT Baseline -b INJECT R2A1 70 INJECT R2E4 70 * INJECT R2F3 10 2:00 RPOINT immob END MAIN RACK 1 thermo_c RACK R Reag_a RACK 2 thermo_a DETECTION 1 APROG immob APPEND Standby END 今 までどおりMAINを 順 番 に 実 行 する RACK 1 thermo_bはラックベースの 設 定 であるが あらかじめCommand Rack Base で 設 定 している 場 合 には 削 除 しても 差 し 支 えない なお RACK R は 中 央 のラックベース 位 置 である この 位 置 にはReag_Aのみ 設 定 することができる APROG 中 には FLOWPATHの 設 定 を 行 っていないが FLOWPATHを 設 定 しない 場 合 には DETECTIONモードで 自 動 的 に 設 定 される

79 76 8. プログラムの 説 明 DETECTION 1 FLOWPATH 1 DETECTION 2 FLOWPATH 2 DETECTION 3 FLOWPATH 3 DETECTION 4 FLOWPATH 4 DETECTION 1,2,3,4 FLOWPATH 1,2,3,4 ( 説 明 ) APROG ボックス CAPTION センサーグラムのタイトル この 場 合 には タイトルが Amine coupling に なる センサーグラムのタイトルを 入 力 することができる FLOW 10 流 速 を 10 μl/min に 設 定 する DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 NHS と EDC の 混 合 液 を 調 製 する R2E1 に EDC 溶 液 を R2E2 に NHS 溶 液 を セット( 逆 でも 可 )し R2E3 に 混 合 するための 空 容 器 をセットする 50 は R2E1 のサンプルの 割 合 であり 50%である この 混 合 液 は 200μl 作 製 する INJECT R2E3 70 R2E3 で 作 成 した 混 合 液 70 μl をインジェクトする 流 速 が 10 μl/min なので 7 分 間 のコンタクトタイムになる( 目 的 によりこの 時 間 を 変 更 する) INJECT R2A1 70 R2A1 にセットされたリガンドを 70 μl インジェクトする ( 目 的 によりこの 時 間 を 変 更 する) INJECT R2E4 70 R2E4 にセットされたエタノールアミンを 70 μl インジェクトする ( 通 常 は NHS 活 性 化 時 間 と 同 じ 時 間 にする) INJECT R2F3 10 洗 浄 溶 液 をインジェクトする ( 例 )50 mm NaOH 等

80 8. プログラムの 説 明 77 MAIN ボックス DETECTION 1 検 出 モードをフローセル 1 にする APROG immob APROG immob を 実 行 する APPEND Standby すべてのプログラムを 終 了 したら Standby 状 態 (すべてのフローセルに 5 μl/min の 流 速 でランニング 緩 衝 液 を 流 すコマンド 54 ページ 参 照 ) プログラム 作 成 のときは 通 常 は 最 後 に APPEND Standby と 入 力 する このプログラムを 実 行 すると 通 常 以 下 のような 結 果 が 得 られる

81 78 8. プログラムの 説 明 ( 複 数 のフローセルに 同 じサンプルを 固 定 するプログラム) 75 ページのプログラムにおいて DETECTION を 1,2,3,4 に 変 更 すると 同 じ 固 定 化 を 4 個 のフローセルに 同 時 に 実 行 することができる この 場 合 には 流 速 を 20 μl/min に 上 げることで フローセル 間 のラグタイムを 短 縮 し それぞれの 固 定 化 量 を 再 現 性 よく 得 ることができる DEFINE APROG immob CAPTION amine coupling(fc=1,2,3,4) FLOW 20 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E :10 RPOINT Baseline -b INJECT R2A1 140 INJECT R2E4 140 * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT immob END MAIN DETECTION 1,2,3,4 APROG immob APPEND Standby END

82 8. プログラムの 説 明 79 (それぞれのフローセルに 異 なったリガンドを 固 定 化 する) それぞれのフローセルに 異 なったリガンドを 同 じプログラムで 固 定 化 するこ ともできる 下 のプログラムの 場 合 2 個 のフローセルについて 同 時 に NHS 活 性 化 した 後 に 各 フローセルに 別 々のリガンドを 固 定 化 し さらに 2 つのフローセルを 同 時 にエタノールアミンでブロッキングするプログラムである DEFINE APROG immob CAPTION Amine coupling FLOW 10 FLOWPATH 1,2 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E3 70-0:10 RPOINT Baseline -b FLOWPATH 1 INJECT R2A1 70 FLOWPATH 2 INJECT R2A2 70 FLOWPATH 1,2 INJECT R2E4 70 * INJECT R2F3 10 2:00 RPOINT immob END MAIN DETECTION 1,2 APROG immob APPEND Standby END 活 性 化 された NHS 基 の 安 定 性 が 悪 いため 上 記 のようなプログラムで 行 うと 後 半 の 固 定 化 量 が 低 くなる 傾 向 がある 同 一 条 件 で 異 なるリガンドを 固 定 化 す る 場 合 には NHS の 活 性 化 から 別 々に 行 う 以 下 のプログラムで 行 う 方 がよい

83 80 8. プログラムの 説 明 このプログラムでは 2 個 の APROG を 作 成 し それぞれの APROG をフローセル を 変 更 して 実 行 する DEFINE APROG immob1 CAPTION Amine coupling(flowcell1) FLOW 10 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E3 70-0:10 RPOINT Baseline -b INJECT R2A1 70 INJECT R2E4 70 * INJECT R2F3 10 2:00 RPOINT immob END DEFINE APROG immob2 CAPTION Amine coupling(flowcell2) FLOW 10 DILUTE R2E5 R2E6 R2E7 50 * INJECT R2E7 70-0:10 RPOINT Baseline -b INJECT R2B1 70 INJECT R2E8 70 * INJECT R2F3 10 2:00 RPOINT immob END MAIN DETECTION 1 APROG immob1 DETECTION 2 APROG immob2 APPEND Standby END

84 8. プログラムの 説 明 81 (4つのフローセルに 1 つのリガンドを 固 定 化 量 を 変 えて 固 定 する) 各 フローセルでリガンドのインジェクト 時 間 を 変 えて 固 定 化 量 を 変 化 させるこ とができる DETECTION および FLOWCELL を 1,2,3,4 に 設 定 し リガンドのインジェクトのコ マンドを 以 下 のように 変 更 する INJECT R2A1 70,35,20,10 このようにするとリガンドがフローセル 1,2,3,4 にそれぞれ 70 μl 35μl 20 μl 10 μl 流 れ 固 定 化 量 を 変 化 させることができる RU Gradient surface Response Time s DEFINE APROG immob CAPTION Amine coupling FLOW 10 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E3 70-0:10 RPOINT Baseline -b INJECT R2A1 70,35,20,10 * INJECT R2E4 70 8:00 RPOINT immob END MAIN DETECTION 1,2,3,4 APROG immob APPEND Standby END

85 82 8. プログラムの 説 明 ステップ 6: 相 互 作 用 のプログラム 相 互 作 用 のプログラムは 基 本 的 に 固 定 化 のプログラムと 同 様 である ここで サンプルを 2 分 間 インジェクトするプログラムを 作 成 してみる ここでは R2A1 に 置 いたサンプルをインジェクトするプログラムを 作 成 する DEFINE APROG assay FLOW 20 FLOWPATH 1 INJECT R2A1 40 END MAIN DETECTION 1 APROG assay APPEND Standby END.. このプログラムは R2A1 という 固 定 の 位 置 にサンプルを 1 個 置 いた 場 合 のプロ グラムであるが 通 常 の 実 験 では サンプルは 複 数 個 あり サンプルのポジシ ョンが 毎 回 変 わってくることになる 次 に 3 つのサンプルを 同 じプログラムで 測 定 するプログラムを 作 成 してみる 下 のプログラムの 場 合 サンプルは R2A1 R2A2 R2A3 にある DEFINE APROG assay PARAM %pos FLOW 20 FLOWPATH 1 INJECT %pos 40 END MAIN END DETECTION 1 APROG assay APROG assay APROG assay APPEND Standby R2A1 R2A2 R2A3

86 8. プログラムの 説 明 83 BIACORE のプログラムでは パラメーターは%で 表 示 する この 場 合 には サン プルのポジションが 毎 回 異 なるので INJECT %pos と 入 力 する パラメータ ーとして%pos があるので PARAM %pos と 入 力 する MAIN ボックスに APROG assay があるので APROG assay が 実 行 されるが APROG assay R2A1 と 入 力 す ると R2A1 がサンプル 位 置 (%POS)になり 2 回 目 は R2A2 3 回 目 は R2A3 がサンプル 位 置 になる このようなプログラムを 作 成 すると サンプル 位 置 が 異 なる 分 析 を 行 うことができる さらにサンプル 数 を 増 やしたい 場 合 には APROG assay サンプル 位 置 をコピー/ペーストして 増 やし ポジションを 変 更 していく 通 常 の 相 互 作 用 の 検 討 の 場 合 には アナライト 結 合 後 再 生 溶 液 で 再 生 を 行 う ので 以 下 のようなプログラムになる DEFINE APROG assay PARAM %pos FLOW 20 FLOWPATH 1 * INJECT %pos 40-0:10 RPOINT baseline b 2:20 RPOINT bound * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT regeneration END MAIN END DETECTION 1 APROG assay R2A1 APROG assay R2A2 APROG assay R2A3 APPEND Standby

87 84 8. プログラムの 説 明 ( 変 数 が 2 つ 以 上 ある 場 合 のプログラムの 作 成 ) プログラムの 中 に 変 数 ( 毎 回 変 化 するもの)が 2 つ 以 上 ある 場 合 でも 基 本 的 に 同 じ 方 法 をとる 例 えば サンプルのポジションとインジェクト 容 量 の 2 個 の パラメーターが 毎 回 変 化 する 場 合 のプログラムは 以 下 のようになる サンプルは R2A1 R2A2 R2A3 の 3 つのサンプルで それぞれを 10 μl 20 μl 30 μl と 異 なった 量 をインジェクトするとする DEFINE APROG assay PARAM %pos %vol FLOW 20 FLOWPATH 1 * INJECT %pos %vol -0:10 RPOINT baseline b 2:20 RPOINT bound * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT regeneration MAIN DETECTION 1 APROG assay R2A1 10 APROG assay R2A2 20 APROG assay R2A3 30 APPEND Standby END この 場 合 には 変 数 が% pos と% vol と 2 個 になる PARAM % pos % vol となり INJECT % pos % vol と 入 力 する さらに MAIN ボックス 中 の APROG assay の 後 に PARAM % pos % vol の 順 番 でそれぞれを 入 力 する つまり 1 回 目 は R2A1 のポジションで 10 μl( APROG assay R2A1 10) 2 回 目 は R2A2 のポジションで 20 μl( APROG assay R2A2 20) 3 回 目 は R2A3 のポジションで 30 μl( APROG assay R2A3 30) と 入 力 する APROG の 後 は PRAM で 設 定 した 変 数 内 容 の 順 番 で 入 力 する

88 8. プログラムの 説 明 85 ( 相 互 作 用 の 検 出 のための 基 本 的 なプログラム) 実 際 に 相 互 作 用 を 分 析 する 有 効 なプログラムを 作 成 してみる 実 験 のモデルとして 以 下 の 条 件 を 想 定 する フローセル 1 :コントロール フローセル 2 : 抗 体 固 定 化 フローセル アナライト : 抗 原 (2 種 類 2 濃 度 ) (サンプル) 1 Antigen_1 2 Antigen_1 3 Antigen_2 4 Antigen_2 25 μg/ml 12.5 μg/ml 25 μg/ml 12.5 μg/ml DEFINE APROG assay PARAM %pos %ID %conc CAPTION Binding of %ID(%conc) to immobilized antibody FLOW 20 FLOWPATH 1,2 * KINJECT %pos :10 RPOINT Baseline -b 3:20 RPOINT bound * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT regeneration END MAIN DETECTION 2-1 APROG assay R2A1 antigen_1 25ug/ml APROG assay R2A2 antigen_1 12.5ug/ml APROG assay R2A3 antigen_2 25ug/ml APROG assay R2A4 antigen_2 12.5ug/ml APPEND Standby END

89 86 8. プログラムの 説 明 このプログラムでは プログラム 上 で 変 数 となるのは サンプル 位 置 のみであ るが % ID(サンプルの 種 類 )および% conc(サンプル 濃 度 )と 変 数 として 入 力 することで 各 サンプルポジションにおけるサンプル 名 および 濃 度 を 具 体 的 に 入 力 して 表 示 し 記 録 することができる CAPTION Binding of % ID(%conc) to immobilized antibody を 記 載 しておくと センサーグラムのタイトルに%ID と% conc がそのまま 代 入 され 1 つめのサンプルでは タイトルが Binding of Antigen_1(25 ug/ml) to immobilized antibody となり 2 つめのサンプルでは Binding of Antigen_1(12.5 ug/ml) to immobilized antibody となって センサーグラムグラフのタイトルを 見 るだけでどのようなサンプル を 使 用 した 場 合 か 簡 単 に 分 かって 非 常 に 便 利 である 通 常 は このプログラムを 使 用 して( 必 要 があればインジェクト 容 量 などを 変 化 した) 測 定 すればよい このプログラムでは 変 数 がサンプル 位 置 だけなので タイトル 表 示 やサンプ ルの 記 載 等 を 必 要 としない 場 合 には 下 のような 簡 単 なプログラムを 作 成 して 実 験 を 行 ってもよい DEFINE APROG assay PARAM %pos FLOW 20 FLOWPATH 1,2 * INJECT %pos 40-0:10 RPOINT baseline b 2:20 RPOINT bound * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT regeneration MAIN DETECTION 2-1 APROG assay R2A1 APROG assay R2A2 APROG assay R2A3 APPEND Standby END

90 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 87 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 汎 用 性 の 高 い 実 験 方 法 に 関 して Wizard が 設 定 されており これを 使 用 するこ とにより 簡 単 に 実 験 を 進 めることができる 予 備 実 験 から 対 照 実 験 結 果 の 評 価 までの 一 連 の 流 れを 手 助 けしてくれる Application wizard には 以 下 のものがある Surface preparation Binding analysis Kinetic analysis Customized Application 9-1.Surface preparation Immobilization ph scouting 固 定 化 する 際 のリガンド 希 釈 液 の 選 択 を 行 うためのスカウティング 操 作 Immobilization 固 定 化 操 作 の Wizard 固 定 化 量 の 調 節 等 が 簡 単 にできる Regeneration scouting アナライトの 再 生 条 件 を 確 立 するための 再 生 溶 液 スカウティング 操 作 Surface performance test 再 生 溶 液 条 件 によるリガンドの 安 定 性 試 験 9-2.Binding analysis 固 定 化 終 了 後 に 各 種 アナライトの 結 合 の 有 無 を 調 べたい 場 合 に 使 用 する スクリーニングに 使 用 すると 便 利 である

91 88 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-3.Kinetic analysis Concentration series 各 種 のアナライト 濃 度 のサンプルを 用 意 し 全 自 動 でおおよその 結 合 速 度 定 数 (k a 単 位 M -1 s -1 )および 解 離 速 度 定 数 (k d 単 位 s -1 )を 算 出 させる Wizard で ある 得 られるデータを BIAevaluation3.0 で 解 析 することもできる Control experiments( 各 種 のコントロール 実 験 ) 1) Mass transfer control: リガンドの 固 定 化 量 が 多 すぎて マストランスポートリミテッド 状 態 になっ ているかどうかを 調 べるものである 2) Linked reaction: 固 定 化 したリガンドとアナライトが 1:1 の 反 応 なの か 複 雑 な 反 応 様 式 なのかを 調 べるものである 9-4.Customized Application 任 意 に 実 験 を 組 み 立 てるための Wizard である かなり 複 雑 な 操 作 を 簡 単 に 設 定 することができる 以 下 これらの Wizard を 説 明 する

92 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Surface preparations pH スカウティング 固 定 化 したいリガンドの 等 電 点 が 不 明 な 場 合 には 各 種 の ph の 10mM 酢 酸 緩 衝 液 に 希 釈 した 同 一 濃 度 のリガンド 溶 液 をセンサー 表 面 にインジェクトし デキ ストランへの 濃 縮 の 程 度 を 見 ることができる リガンド(5~100μg/ml 10mM 酢 酸 緩 衝 液 ph4~6) 洗 浄 溶 液 (50mM NaOH) Run Run Application Wizard をクリックする Surface Preparation を 選 択 し Start をクリックする

93 90 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Immobilization ph Scouting を 選 択 し Next>をクリックする 使 用 する ph の 酢 酸 緩 衝 液 にチェックを 入 れ Next>をクリックする 濃 縮 効 果 が 見 られる ph は ph5~4 の 範 囲 にある 場 合 が 多 い また ph3.5 以 下 の 緩 衝 液 は 使 用 しない 表 示 された 緩 衝 液 以 外 を 使 用 する 場 合 には Add をクリックして 設 定 する リガンド 名 インジェクト 時 間 ( 分 ) 流 速 (μl/min) 使 用 するセルを 選 択 し Next>をクリックする

94 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 91 ph スカウティング 終 了 後 非 特 異 的 に 結 合 したリガンドを 洗 浄 溶 液 で 洗 浄 する 2 段 階 (2 種 類 の 洗 浄 溶 液 )を 使 用 する 場 合 には Wash Method の Two Injections をクリックする 洗 浄 溶 液 名 および 条 件 を 入 力 し Next>をクリックする 洗 浄 溶 液 は 最 後 のリガンドを 添 加 した 後 に 添 加 される それぞれの ph のリ ガンドを 添 加 した 際 には 洗 浄 操 作 は 行 われない 洗 浄 溶 液 は 高 イオン 強 度 あるいは 高 い ph の 溶 液 での 洗 浄 を 推 奨 する(た とえば 3M NaCl,50mM NaOH, 1M Etnaolamine-HCl,pH8.5 等 )

95 92 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプルの 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し(101 ページ 参 照 ) Next>をクリックす る

96 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 93 サンプルの 位 置 容 量 を 再 度 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 実 験 がスタートする

97 94 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ( 実 験 結 果 の 表 示 ) 実 験 が 終 了 すると 以 下 のような 結 果 が 表 示 される さらに 以 下 のようなレポートも 表 示 される

98 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 95 上 記 の 結 果 から 使 用 する ph を 決 める ( 結 果 の 評 価 ) 一 般 的 には 濃 縮 効 果 が 得 られる 最 も 高 い ph の 条 件 を 用 いて 固 定 化 する 濃 縮 効 果 および 使 用 しているリガンドの 安 定 性 等 を 考 慮 して 最 終 的 に 決 定 する 基 本 的 に 濃 縮 効 果 が 得 られる 条 件 では 固 定 化 が 可 能 である

99 96 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Immobilization( 固 定 化 操 作 ) ~アミンカップリングによる 固 定 化 方 法 この 方 法 は アミンカップリングによりリガンドを 固 定 化 する 方 法 である そ の 他 の 固 定 化 方 法 (チオールカップリング アルデヒドカップリング)につい ては Wizard Template(172 ページ)を 参 照 すること Run Run Application Wizard をクリックする Surface Preparation を 選 択 し Start をクリックする

100 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 97 Immobilization を 選 択 し Next>をクリックする センサーチップ(CM5)および 固 定 化 方 法 (Amine Coupling)を 選 択 し Next> をクリックする

101 98 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Aim for Immobilized Level(99 ページ 参 照 ) 目 的 の 固 定 化 量 に 調 節 したい 場 合 に 使 用 Specify Flow Rate and Injection Time(107 ページ 参 照 ) 決 められた 条 件 (リガンドインジェクト 時 の 流 速 とインジェクト 時 間 の み 設 定 )で 行 う 場 合 に 選 択 する いずれかを 選 択 し Next>をクリックする

102 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 99 1 Aim for Immobilized Level あらかじめ 目 的 の 固 定 化 量 を 設 定 して 固 定 化 操 作 を 行 う 場 合 に 使 用 する Wizard である 流 速 は 5μl/min NHS 活 性 化 時 間 エタノールアミン 不 活 性 化 時 間 はそれ ぞれ 7 分 間 に 固 定 化 されており 変 更 はできない Aim for Immobilized Level 選 択 し を Next>をクリックする 固 定 化 したいリガンド 名 を 固 定 化 するフローセルに 入 力 し 目 的 の 固 定 化 量 (RU) 洗 浄 溶 液 を 入 力 し Next>をクリックする

103 100 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ( 補 足 ) 1 複 数 の 固 定 化 を 同 時 に 行 うこともできる この 場 合 には それぞれのフローセルに 同 様 にリガンド 名 固 定 化 量 を 入 力 する 2フローセル 1 および 3 をブランクコントロールとして 使 用 することができる この 場 合 には Blank にマーク( )を 入 力 すると NHS 活 性 化 後 そのままエタノールアミンで ブロッキングしたセルを 作 製 する 3 何 も 処 理 していないフローセルをコントロールにしたい 場 合 には この 画 面 上 では 処 理 を 行 わない 4ブランクコントロールのセルは フローセル 1 および 3 にすると 後 の 実 験 に 便 利 であ る

104 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 101 リガンドや 試 薬 のバイアルのセット 位 置 がラックベース 上 に 表 示 される バイアルのセット 位 置 を 変 更 する 場 合 には ラック 上 のバイアルにカーソル を 移 動 し ドラッグして 好 きな 場 所 に 移 動 することができる その 場 合 には 上 部 表 中 のサンプル 位 置 も 自 動 的 に 変 更 される サンプル 位 置 の 変 更 にとも ない バイアルの 大 きさが 変 わる 場 合 には サンプル 必 要 量 も 変 更 されるの で 注 意 すること

105 102 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 (サンプル 位 置 の 変 更 例 ) 毎 回 同 じ 設 定 で 固 定 化 したい 場 合 には この 設 定 を 保 存 することもできる Menu Template Save As で 保 存 する Next>をクリックする

106 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 103 バイアル 位 置 およびサンプル 容 量 に 間 違 いがないことを 確 認 して Start をクリッ クする 保 存 先 のフォルダーを 選 択 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 固 定 化 操 作 が 開 始 される

107 104 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 固 定 化 が 終 了 すると 上 記 の 様 なレポートが 表 示 される Response 1. リガンド 添 加 の 前 後 でのレスポンスの 比 較 Response 2. NHS 活 性 前 とエタノールアミン 添 加 後 のレスポンスの 比 較 固 定 化 量 が 少 ない 場 合 (1000RU 以 下 )には Response 1.を 参 考 にする

108 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 105 ( 補 足 ) この Wizard では 固 定 化 操 作 に 入 る 前 に リガンド 溶 液 をフローセルにテストインジェク トし プレコンセントレーション 効 果 がえられるか?また 目 的 の 固 定 化 量 に 固 定 化 できる 条 件 であるかを 機 械 的 に 判 断 する セットしたリガンド 溶 液 に 問 題 がある 場 合 には この 時 点 でプログラムが 自 動 的 に 終 了 す る この 場 合 フローセルにはリガンドは 固 定 化 されていないので リガンド 溶 液 を 調 製 しなおして 同 じフローセルに 再 度 固 定 化 操 作 を 試 みる リガンド 溶 液 に 問 題 がある 場 合 には 以 下 のような 表 示 が 出 る 1プレコンセントレーション 効 果 が 少 なすぎる 場 合 テストインジェクトにおいてリガンドの 濃 縮 が 観 察 されなかった 場 合 もしくはあまりに も 濃 縮 がゆっくりしているため 添 加 時 間 を 長 くしても 目 標 のレベルまで 固 定 化 できそう もない と 判 断 される 場 合 は 上 のようなメッセージが 表 示 され 固 定 化 操 作 が 中 止 される この 場 合 には 希 釈 緩 衝 液 の ph を 下 げるか リガンド 濃 度 を 上 げて プレコンセントレ ーション 効 果 を 上 げて 固 定 化 操 作 をやり 直 す

109 106 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 2プレコンセントレーション 効 果 が 高 すぎる 場 合 テストインジェクトにおいてリガンドの 濃 縮 が 高 すぎて 添 加 時 間 を 短 くしても 目 標 のレ ベル 以 上 に 固 定 化 されてしまうと 判 断 される 場 合 は 上 のようなメッセージが 表 示 され 固 定 化 操 作 が 中 止 される この 場 合 には 希 釈 緩 衝 液 の ph を 上 げるか リガンド 濃 度 を 下 げて プレコンセントレ ーション 効 果 を 下 げて 固 定 化 操 作 をやり 直 す

110 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Specify Flow Rate and Injection Time リガンドのインジェクトの 際 の 流 速 およびインジェクト 時 間 だけを 設 定 して 固 定 化 を 行 う Wizard である 決 められた 固 定 化 方 法 を 繰 り 返 すような 場 合 に 簡 単 で 便 利 である 実 験 条 件 流 速 時 間 NHS 活 性 化 5μl/min 7 分 間 リガンドインジェクト 自 由 に 設 定 自 由 に 設 定 エタノールアミン 不 活 性 化 5μl/min 7 分 間 Specify Flow Rate and Injection Time を 選 択 し Next>をクリックする

111 108 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 使 用 するフローセルに 固 定 化 するリガンドの 名 前 を 入 力 し リガンドインジェ クト 時 間 および 流 速 を 設 定 し Next>をクリックする サンプルのポジションが 表 示 されるので 指 示 どおりにサンプルをセットする か もしくはサンプルの 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 (101 ページ 参 照 )し Next >をクリックする

112 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 109 サンプルの 位 置 および 容 量 を 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 固 定 化 操 作 が 開 始 される

113 110 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 さらに 固 定 化 量 が 下 のように 表 示 される Response 1 および 2 についての 解 説 は 104 ページ 参 照 のこと

114 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Regeneration scouting ( 再 生 条 件 検 討 実 験 ) 固 定 化 操 作 を 終 了 後 アナライトとの 相 互 作 用 を 分 析 するにあたって アナラ イトの 再 生 条 件 を 検 討 する 必 要 がある 再 生 条 件 として 以 下 を 満 たす 必 要 がある 1 結 合 したアナライトを 完 全 に 再 生 できること 2 固 定 化 したリガンドが 失 活 しないこと 3リガンドが デキストランから 脱 落 しないこと 再 生 条 件 検 討 のための Wizard が Regeneration scouting である Regeneration scouting を 選 択 し Next>をクリックする

115 112 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 アナライトの 名 前 インジェクト 時 間 および 流 速 を 入 力 し 使 用 するフロー セルを 設 定 し Next>をクリックする 指 定 された 場 所 にアナライトを 置 くか 位 置 を 変 更 し Next>をクリックする

116 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 113 サンプル 位 置 および 容 量 を 再 度 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 開 き ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 実 験 が 開 始 される

117 114 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 RU Regeneration Scouting Re s p ons e Time s センサーグラムがスタートし アナライトがインジェクトされる 上 のようなボックスが 開 いたら Regeneration をクリックする (アナライトの 結 合 量 が 少 ない 場 合 には Add Analyte をクリックすると ア ナライトを 再 度 添 加 できる)

118 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 115 使 用 する 再 生 溶 液 を 選 択 し インジェクト 時 間 流 速 バイアル 位 置 を 設 定 し Start をクリックする 再 生 溶 液 の 1 回 のインジェクトは 30 秒 ~1 分 間 程 度 とし 再 生 が 不 充 分 な 場 合 には この 短 いインジェクトを 複 数 回 繰 り 返 すようにする ボックスの 中 に 使 用 したい 再 生 溶 液 がない 場 合 には Add をクリックして 溶 液 名 を 入 力 し OK をクリックし 再 生 溶 液 を 追 加 する RU Regeneration Scouting Response Time s

119 116 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 1 つ 目 の 再 生 溶 液 がインジェクトされ 再 生 状 況 がモニターできる さらに 異 なる 再 生 溶 液 を 試 みる 場 合 には Regeneration をクリックし その 他 の 再 生 溶 液 の 効 果 を 見 ていく RU Regeneration Scouting Re s ponse Time s 終 了 する 場 合 には Finish をクリックする ( 結 果 の 評 価 ) 再 生 効 率 が 20%よりも 少 ない(Analyte が 80% 以 上 残 る) 場 合 には 再 生 溶 液 の 条 件 を 厳 しくする (ph を 低 くする イオン 強 度 を 上 げる 等 ) 再 生 効 率 が 20~80%の(Analyte が 80~20% 残 る) 場 合 には 繰 り 返 し 同 じ 再 生 溶 液 を 2 回 添 加 してみる 最 初 の 添 加 で 再 生 効 率 が 90%もしくはそれ 以 上 の 場 合 (=ほとんど 再 生 さ れる 場 合 )には もう 少 しマイルドな 条 件 の 再 生 溶 液 を 使 える 可 能 性 がある

120 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Surface Performance Test ph Scouting Wizard 等 で 決 めた 再 生 条 件 について この 条 件 が 適 している 条 件 で あるかをテストするものである ここでは 次 のような 項 目 を 確 認 する 1 同 一 濃 度 のアナライト 結 合 量 が 各 サイクルで 変 化 がないか(リガンド の 失 活 は 起 きていないか) 2 再 生 が 各 サイクルで 十 分 できているか 3 ベースラインが 各 サイクルで 変 化 しないか Surface Preparation Test を 選 択 し Next>をクリックする アナライト 名 を 入 力 し インジェクト 時 間 ( 分 ) 流 速 (μl/min) 分 析 回 数 お よび 使 用 フローセルを 指 定 し Next>をクリックする

121 118 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 再 生 溶 液 を 入 力 し 再 生 回 数 再 生 時 間 等 を 入 力 し Next>をクリックする ( 注 意 ) 再 生 条 件 は 以 下 の3つのうちから 選 ぶことができる バッファーによる 解 離 ランニング 緩 衝 液 のみを 流 してアナライトを 解 離 させる ( 解 離 速 度 が 非 常 に 速 いアナライトのみに 使 用 可 能 ) シングルインジェクション 再 生 溶 液 を 1 回 添 加 する ( 最 も 一 般 的 な 方 法 ) ツーインジェクション 再 生 溶 液 を 2 回 添 加 する ( 上 の2つで 再 生 できないような 場 合 に 有 効 なことがある)

122 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 119 サンプル 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする

123 120 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプル 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Start>をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 再 生 条 件 の 検 討 を 開 始 する

124 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 121 ( 再 生 条 件 の 評 価 ) Baseline Level および Response Level が 表 示 される Baseline Level は 各 サイクルのベースラインレベルの 変 化 Response Level は 各 サ イクルの 同 一 濃 度 のアナライトの 結 合 量 の 変 化 を 表 している はっきりとした 傾 向 がなく 変 動 の 幅 が 小 さい 場 合 は 無 視 することができる しかし ベースラインが 上 昇 していく 傾 向 があるときは 一 般 的 に 再 生 が 不 充 分 でアナライトが 蓄 積 していることが 考 えられる レスポンスの 変 動 がなく 一 定 の 場 合 には ベースラインが 幾 分 か 減 少 しても あまり 問 題 にはならない しかしベースラインの 減 少 とともにレスポンスの 減 少 が 見 られる 場 合 は 再 生 操 作 中 にリガンドがセンサーチップから 外 れている 可 能 性 が 考 えられるので 注 意 が 必 要 である 一 方 Response Level が 減 少 しているときは 再 生 によりリガンドがダメージを 受 けていることが 考 えられる また アナライトが 蓄 積 していくと アナライ トが 結 合 できるキャパシティーを 減 少 することもあるので 注 意 が 必 要 である 以 上 をまとめて 下 に 表 示 すると ベースラインおよびアナライトのレスポンス に 明 らかな 変 動 がある 場 合 1Baseline Level 低 下 ()および Response Level 低 下 ()の 場 合 再 生 操 作 によりリガンドが 遊 離 していることが 考 えられる 2Baseline Level 不 変 ( )および Response Level 低 下 ()の 場 合 再 生 操 作 によりリガンドが 失 活 していることが 考 えられる 3Baseline Level 上 昇 ( )および Response Level 低 下 ()の 場 合 再 生 操 作 によってもアナライトが 完 全 に 遊 離 していないことが 考 えられる

125 122 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-2.Binding analysis( 特 異 的 結 合 実 験 ) 各 種 アナライトの 結 合 の 有 無 を 調 べたい 場 合 に 使 用 する Wizard である スクリーニング 等 の 多 検 体 の 分 析 に 使 用 する Run Application Wizard をクリックする Binding Analysis を 選 択 し Start をクリックする Direct Binding を 選 択 し Next>をクリックする

126 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 123 使 用 するフローセル 流 速 サンプルインジェクト 回 数 ( 同 一 サンプルのイン ジェクション 回 数 )およびインジェクション 時 間 ( 分 )を 入 力 し Next> をクリックする Wait After Injection: はそのままにしておく 多 段 階 の 反 応 を 見 る 場 合 には Number of Sample Injections:の 数 字 を 増 加 させる Response (RU) サンプル 目 3サンプル 目 サンプル 目 Time (seconds)

127 124 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Sample にサンプル 名 を Repl.に 同 一 サンプルの 繰 り 返 し 回 数 を 入 力 する As Entered をクリックすると 入 力 したサンプルの 分 析 順 を 指 定 することがで きる Next>をクリックする Random : 入 力 したサンプルをランダムに 実 行 As Entered : 入 力 した 順 番 で 実 行 Step :サンプルの 種 類 ごとで 分 析

128 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 125 再 生 条 件 を 設 定 し(111 ページ 参 照 ) Next>をクリックする バイアルのポジションを 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする

129 126 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 バイアル 位 置 容 量 を 再 度 確 認 後 Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 後 Save をクリックする プログラムが 動 き 出 す ( 実 験 結 果 の 表 示 ) 実 験 が 終 了 すると 以 下 のような 実 験 結 果 が 表 示 される

130 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 127 結 合 量 のグラフも 同 時 に 表 示 される 各 サンプルの 結 合 量 が 表 示 される

131 128 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-3. Kinetic analysis Concentration series 結 合 速 度 定 数 (k a )あるいは 解 離 速 度 定 数 (k d )を 算 出 する 場 合 には Application Wizard を 使 用 して 実 験 を 行 うと 便 利 である Run Run Application Wizard をクリックする Kinetic Analysis を 選 択 し Start をクリックする Concentration Series を 選 択 し Next>をクリックする

132 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 129 Control Experiments は 実 験 条 件 の 検 討 の 項 目 である 1 Mass Transfer マストランスファー リミット 効 果 が 現 れているか 調 べるもの 2 Linked Reactions 反 応 が 1:1 の 単 純 な 反 応 か 調 べるもの 目 的 により 選 択 する Direct Binding もしくは Binding Using Capturing Molecule を 選 択 する ここでは Direct Binding を 選 択 し Next>をクリックする 使 用 するフローセル 流 速 (μl/min) インジェクト 時 間 ( 分 ) 解 離 時 間 ( 分 )

133 130 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 アナライト 名 アナライトの 分 子 量 サンプルの 繰 り 返 し 測 定 回 数 濃 度 を 入 力 し Next>をクリックする 注 意 次 のメッセージが 出 てくる 場 合 がある これは アナライトの 濃 度 を 5 段 階 以 上 で 行 うことを 勧 めるものである 必 要 がない 場 合 には Ignore をクリックする これは アナライトの 同 一 濃 度 のサンプルを 複 数 回 分 析 することを 勧 めるもの である 必 要 がない 場 合 には Ignore をクリックする

134 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 131 サンプルの 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする

135 132 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 バイアルの 位 置 等 を 再 度 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 後 ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする プログラムが 動 き 出 す

136 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 133 ( 実 験 結 果 の 表 示 ) 実 験 が 終 了 すると 以 下 のような 実 験 結 果 が 表 示 される 同 時 に 得 られたセンサープラムからおよその 各 種 反 応 速 度 定 数 が 計 算 される k a : 結 合 速 度 定 数 (1/Ms) k d : 解 離 速 度 定 数 (1/s) K A : 親 和 定 数 (1/M) K D : 解 離 定 数 (M) Rmax:アナライトの 最 大 結 合 量 (RU) Baseline Level をクリックすると 各 サンプルのベースラインの 変 動 を 表 示 するこ とができる

137 134 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法

138 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Control experiments( 各 種 のコンロトール 実 験 ) 1)Mass transfer control 現 在 の 実 験 条 件 で マストランスポート リミテーション 効 果 が 現 れているか 調 べることができる この 効 果 は リガンドの 固 定 化 量 が 多 すぎるときに 発 生 する 効 果 であり 結 合 領 域 においては センサー 表 面 デキストラン 内 のアナライトの 濃 度 が 低 くなり また 解 離 領 域 においては 一 度 解 離 したアナライトが さらにリガンドに 再 結 合 する(Rebinding)ことにより 正 しい 反 応 速 度 定 数 を 算 出 することができ なくなる この Wizard では 同 一 アナライトを 同 一 濃 度 で 使 用 し 流 速 を 変 化 させてイン ジェクトする マストランスポート リミテーション 条 件 下 では それぞれの 流 速 でレスポンス( 結 合 量 )に 変 化 が 生 じる マストランスポート リミテー ション 条 件 下 で 実 験 を 行 った 場 合 には 正 しい 反 応 速 度 定 数 の 算 出 は 困 難 であ り 結 合 速 度 定 数 (k a )および 解 離 速 度 定 数 (k d )は 誤 って 算 出 されることがあ るので 十 分 注 意 が 必 要 である この 場 合 には 固 定 化 量 を 減 少 させて 実 験 をや り 直 すか BIAevaluation 3.0 での 解 析 の 際 に MODEL を 1:1(Langmuir) with mass transfer を 選 択 する Run Run Application Wizard をクリックし Kinetic Analysis をクリックする Mass Transfer を 選 択 し Next>をクリックする

139 136 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Direct Binding を 選 択 し Next>をクリックする 使 用 するフローセル サンプル 名 等 を 入 力 し Next>をクリックする

140 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 137 再 生 条 件 を 設 定 し Next>クリックする

141 138 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプル 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 実 験 が 開 始 される

142 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 139 上 記 な 実 験 結 果 が 示 される 実 験 結 果 の 評 価 理 想 的 な 実 験 条 件 では 固 定 化 したリガンドとインジェクトしたアナライトと の 間 の 相 互 作 用 ( 結 合 および 解 離 両 速 度 )には 流 速 は 全 く 影 響 しない しかし マストランスファー リミテーション 条 件 下 では 相 互 作 用 反 応 は 流 速 によって 大 きく 変 化 することになる 表 示 された 重 ね 書 きのセンサーグラム の 結 合 量 (レスポンス)に 違 いがあれば マストランスファー リミテーショ ン 条 件 下 であると 判 断 することができる この 場 合 には リガンドの 固 定 化 量 を 減 少 させて 実 験 をやり 直 すか BIAevaluation 3.0 での 解 析 の 際 に MODEL に 1:1(Langmuir) with mass transfer を 選 択 する

143 140 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 2)Linked Reaction のチェック リガンドとアナライトとの 反 応 が 1:1 なのか あるいはより 複 雑 な 反 応 かを Wizard を 使 って 調 べることができる この 実 験 では 同 一 アナライトを 同 一 濃 度 ( 平 衡 に 達 するに 十 分 な 濃 度 )で インジェクト 時 間 を 変 化 させて 分 析 し 解 離 領 域 のセンサーグラムから 反 応 が 1:1 であるかを 判 断 する 1:1 の 反 応 の 場 合 アナライトの 添 加 時 間 が 変 化 しても 解 離 の 仕 方 に 変 化 は なく 複 雑 な 反 応 系 の 場 合 解 離 の 仕 方 に 変 化 が 現 れる アナライト 濃 度 は 速 やか(2~3 分 間 )に 平 衡 に 達 するに 十 分 な 濃 度 のアナライ トを 用 意 する 必 要 がある Run Run Application Wizard をクリックし Kinetic Analysis をクリックする Linked Reaction を 選 択 し Next>をクリックする

144 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 141 Direct Binding を 選 択 し Next>をクリックする 使 用 するフローセルおよびアナライト 名 等 を 入 力 し Next>をクリックする

145 142 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 再 生 条 件 を 入 力 し Next>をクリックする

146 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 143 サンプル 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 して ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 実 験 が 開 始 される

147 144 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ( 実 験 結 果 の 評 価 ) 相 互 作 用 が 1:1 の 反 応 の 場 合 サンプルの 添 加 時 間 に 関 係 なく 解 離 のし 方 は 一 定 となるはずである 解 離 のし 方 に 差 がある 場 合 には 反 応 は 1:1 でなく よ り 複 雑 な 反 応 系 の 場 合 が 多 い また アナライトが 1 量 体 や 2 量 体 の 混 合 物 で あったりした 場 合 にも このような 現 象 が 起 こる 場 合 がある このような 場 合 に 1:1 の 反 応 系 で 分 析 を 行 うと 実 際 の 速 度 定 数 と 異 なる 値 として 算 出 される 場 合 があるので 注 意 が 必 要 である

148 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Customized Application プログラムを 自 分 で 自 由 に 組 み 立 てるたるための Wizard である サンプルのインジェクト 再 生 溶 液 のインジェクト レポートポイントの 作 成 等 の 条 件 を 含 むプログラムを 簡 単 に 作 成 することができる Run Run Application Wizard をクリックする Customer Applicationを 指 定 し Start をクリックする アイコンを 使 用 し 操 作 を 入 力 し 実 験 を 組 み 立 てる

149 146 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 アイコンの 説 明 1 DETECTION モード 検 出 セルおよび 測 定 温 度 を 設 定 する 2 Keyword レポートポイントテーブル 中 にサンプル 名 濃 度 等 の 任 意 のコメントを 表 示 させるコマンド 3 流 速 の 設 定 流 速 の 設 定 を 行 うコマンド 4 インジェクト 試 料 のインジェクトを 行 うコマンド 5 レポートポイント センサーグラム 上 の 任 意 の 点 のデータをレポー の 作 成 トポートポイントテーブル 上 に 表 示 させるコマ ンド 6 Transfer サンプルをバイアル 間 で 移 動 させるためのコマ ンド 7 Mix バイアル 中 の 試 料 を 混 合 するコマンド 通 常 は Transfer とセットで 使 用 する 8 Wash ニードルや IFC をランニング 緩 衝 液 で 洗 浄 する コマンド 9 Wait ランニング 緩 衝 液 を 流 した 状 態 で 待 機 させるコ マンド 秒 単 位 で 待 機 させることができる 10 Comment プログラム 画 面 中 にコメントを 入 力 するための コマンド!より 右 側 の 言 語 は コメントとし て 操 作 に 関 係 ないものと 認 識 する 11 If/Then 途 中 の 実 験 結 果 から 以 降 の 操 作 を 選 択 するため のコマンド 例 えば 一 定 量 の 結 合 量 がない 場 合 には 再 生 操 作 を 行 わずに 次 のサイクルに 移 動 する 場 合 等 に 利 用 する 結 合 物 質 のスクリ ーニング 等 に 有 効 である

150 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 基 本 操 作 ここでは 基 本 的 な Wizard 作 成 方 法 を 習 得 することを 目 的 に ステップを 踏 ん で 説 明 する ステップ 1.1 個 のアナライトについての 分 析 以 下 の 実 験 を 行 う 場 合 を 想 定 する リガンド :Protein A(フローセル 2 に 固 定 化 済 み) 測 定 温 度 :25 流 速 :20μl/min Detection モード :2-1 (フローセル 1 はリファレンスとして 使 用 ) アナライト :IgG(1 濃 度 ) アナライト 位 置 :R2A1 インジェクト : INJECT 使 用 40μl(2 分 間 ) 再 生 溶 液 :10mM Gly-HCl(pH2) 20μl(1 分 間 ) 再 生 溶 液 位 置 :R2F3 レポートポイント :IgG 添 加 10 秒 前 IgG 添 加 後 20 秒 後 再 生 溶 液 添 加 後 60 秒 後 Run Run Application Wizard をクリックする Customized Applicationを 選 択 し Start をクリックする

151 148 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 通 常 流 速 を 20μl/min で 実 験 を 行 うように 設 定 されている をクリックし Detection モードおよび 測 定 温 度 を 設 定 する ( 検 出 モードの 設 定 ) Detectionを 選 択 する 以 下 から 選 択 することができる Fc1 Fc2 Fc3 Fc4 Fc1,2 Ref 2-1 Fc3,4 Ref 4-3 Fc1,2 Fc3,4 Fc1,2,3,4 Fc1,2,3,4 Ref 2-1,4-3 Fc1,2,3,4 Ref 2-1,3-1,4-1

152 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 149 ここでは Fc1,2 Ref 2-1 を 設 定 する (リファレンス 差 し 引 き 機 能 については 46 ページ 参 照 ) ( 測 定 温 度 の 設 定 ) 検 出 部 位 の 温 度 を 設 定 する 4~40 の 範 囲 で 設 定 できる Set Temperatureにマークをいれ 温 度 を 入 力 する 設 定 後 OK をクリックする 以 下 のように 設 定 される ( 流 速 の 変 更 ) をダブルクリックする 流 速 を 入 力 し OK をクリックする

153 150 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 (アナライトのインジェクト) をクリックする アナライト(この 場 合 には IgG)の 名 前 およびインジェクト 容 量 を 入 力 し OK をクリックする Injection Mode:の をクリックすると インジェクトモードを 変 更 することがで きる インジェクトモードについては 42 ページ 参 照 ( 注 意 )コマンドを 入 力 するときは 入 力 したい 位 置 をハイライトにする 必 要 が ある この 場 合 インジェクトコマンドは FLOW 20 の 後 に 入 力 したいので FLOW 20 の 後 をハイライトにする ここをハイライトにする

154 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 151 ( 再 生 溶 液 のインジェクト) インジェクトしたい 位 置 をハイライトにする をクリックする 再 生 溶 液 の 名 前 およびインジェクト 容 量 を 入 力 し OK をクリックする

155 152 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 (レポートポイントの 作 成 ) アナライトのインジェクトによるレスポンス 上 昇 分 を 結 合 量 としてレポート ポイントテーブルに 表 示 させる(レポートポイントについては 14 ページ 参 照 ) 通 常 はアナライトインジェクトの 約 10 秒 前 をベースラインとして 取 り さらに インジェクト 終 了 後 10~30 秒 後 のレスポンスを 結 合 量 として 取 る リファレン ス 差 し 引 き 機 能 を 使 用 している 場 合 には インジェクト 終 了 直 前 のレスポンス を 結 合 量 として 使 用 する 場 合 もある 1アナライトインジェクト 前 のベースライン INJECT IgG 40 をクリックし ハイライトにする をクリックする Beforeにマークをいれ 10 秒 前 に 設 定 する Idにコメント(ここではbaseline)を 入 力 する このときのレスポンスをベースラインとする 場 合 には Baselineにマークをいれ OKをクリックする

156 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 153 2アナライトインジェクト 終 了 後 の 結 合 量 INJECT END(アナライトインジェクト 終 了 )をクリックし ハイライトにする をクリックする Afterにマークをいれ Idにコメントを 入 力 し OKをクリックする 3 再 生 後 のレポートポイント INJECT END( 再 生 溶 液 インジェクト 終 了 )をクリックしハイライトにする をクリックする

157 154 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 必 要 事 項 を 入 力 し OK をクリックする 一 連 の 実 験 操 作 ができあがる Next>をクリックする

158 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 155 実 験 の 繰 り 返 し 回 数 を 入 力 し(この 場 合 には 1 回 )し Next>をクリックする サンプル 位 置 と 容 量 を 確 認 する 位 置 を 変 更 する 場 合 には ラック 上 の 変 更 し たいサンプルをマウスで 移 動 先 までドラッグすると 変 更 できる

159 156 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 もう 一 度 サンプル 位 置 と 容 量 を 確 認 後 Startをクリックする ファイルの 保 存 先 を 指 定 し ファイル 名 を 入 力 後 Saveをクリックする 実 験 がスタートする

160 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 157 RU IgG Response Time s ( 入 力 したコマンドの 消 去 ) 消 去 したいコマンドをクリックし ハイライトにする マウスの 右 ボタンをクリックすると 以 下 のプルダウンメニューが 表 示 される プルダウンメニュー 一 番 下 のDelete Commandをクリックすると 消 去 できる

161 158 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ステップ 2. 複 数 個 のアナライトについての 分 析 以 下 の 条 件 で 実 験 を 行 う Wizard を 作 成 する リガンド :Protein A(フローセル 2 に 固 定 化 済 み) 測 定 温 度 :25 流 速 :20μl/min Detection モード :2-1 (フローセル 1 はリファレンスとして 使 用 ) アナライト :IgG(5 濃 度 ) アナライト 位 置 :R2A1 R2A2 R2A3 R2A4 R2A5 インジェクト :KINJECT 使 用 40μl(2 分 間 ) 解 離 時 間 :120 秒 間 再 生 溶 液 :10mM Gly-HCl(pH2) 20μl(1 分 間 ) 再 生 溶 液 位 置 :R2F3 レポートポイント :IgG 添 加 10 秒 前 IgG 添 加 後 20 秒 後 再 生 溶 液 添 加 後 60 秒 後 ステップ 1 の Wizard 作 成 法 にしたがって 作 成 する アナライトのインジェクトの 段 階 で 以 下 のように 作 成 する KINJECT を 使 用 の 際 には 解 離 時 間 も 入 力 する

162 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 159 サンプル 位 置 が 毎 回 異 なるので Vary by Cycle にマークをいれる 一 連 の 操 作 を 表 示 すると 以 下 のようになる Next>をクリックする

163 160 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Sample_ID に 5 種 類 のアナライトの 名 前 や 濃 度 を 入 力 する Repl は 同 一 サンプルの 繰 り 返 し 測 定 回 数 である この 場 合 には 1 を 入 力 する Next>をクリックする

164 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 161 サンプル 位 置 容 量 の 確 認 および 変 更 を 行 い Next>をクリックする 再 度 サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 後 Startをクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 後 Saveをクリックする 実 験 が 開 始 される

165 162 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ステップ 3.If/Then を 使 用 した 再 生 の 操 作 省 略 If/Then 機 能 を 使 用 することで アナライトの 結 合 が 見 られなかった 場 合 に 再 生 操 作 を 省 略 することができる 再 生 操 作 の 省 略 は 測 定 時 間 の 短 縮 やリガン ドの 安 定 性 保 持 につながる 結 合 物 質 のスクリーニング 等 の 実 験 に 有 効 である ステップ 2 の Wizard において 再 生 溶 液 インジェクトの 手 前 のコマンドをクリックしハイライトにする をクリックする

166 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 163 ここでは 結 合 量 (bound)が 50RU より 少 ない 場 合 に 再 生 溶 液 の 添 加 を 削 除 し 次 のサイクルに 行 くように 作 成 する 上 記 ボックスの 選 択 項 目 を 以 下 に 設 定 後 OK をクリックする IF( 何 が) : RelResp For Report Point(どの 値 が) : bound In Flowcell(どのセルで) : 2-1 Comparison(どうならば) : Is less Than Value(どの 値 ならば) : 50 THEN(どうする?) : Exit Cycle このように 設 定 すると アナライトの 結 合 量 が 50RU より 少 ない 場 合 には 再 生 操 作 を 行 わず 次 のサイクル( 次 のアナライトの 分 析 )に 移 行 することができ る

167 164 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ステップ 4. 実 験 途 中 で 流 路 (FLOWPATH)や 流 速 を 変 更 する (FLOWPATH の 変 更 ) 実 験 途 中 で FLOWPATH を 自 由 に 変 更 することができる をクリックする 目 的 の FLOWPATH を 選 択 し OK をクリックする サンプル 等 をインジェクトする さらに FLOWPATH を 実 験 途 中 で 変 更 する 場 合 には 同 様 の 操 作 を 行 う

168 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 165 ( 流 速 の 変 更 ) 変 更 したい 位 置 をハイライトにし をクリックする 流 速 を 入 力 し OK をクリックする

169 166 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ステップ 5. 濃 度 測 定 のための Wizard 濃 度 測 定 を 行 う 場 合 には Keyword 機 能 を 利 用 すると 便 利 である Keywordとは レポートポイントテーブル 中 にサンプル 名 あるいは 濃 度 等 の 任 意 のコメントを 表 示 させるために 追 加 するカラム 名 である Keywordに 入 力 したものが レポートポイントテーブルに 表 示 される 以 下 のサンプルの 濃 度 測 定 を 例 に 説 明 する リガンド :Protein A(フローセル 2 に 固 定 化 済 み) 測 定 温 度 :25 流 速 :10μl/min Detectionモード :1-2 (フローセル 1 はリファレンスとして 使 用 ) アナライト :スタンダード IgG (5 段 階 の 既 知 濃 度 サンプル) 未 知 濃 度 サンプル(5 種 類 ) インジェクト : INJECT 使 用 40μl 再 生 溶 液 :10mM Gly-HCl, ph 2 再 生 溶 液 位 置 :R2F3 レポートポイント :IgG 添 加 10 秒 前 IgG 添 加 後 20 秒 再 生 溶 液 添 加 後 60 秒

170 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 167 今 までのステップで 説 明 したように DETECTION モード 流 速 あるいはサンプ ルインジェクションを 入 力 する アナライトは 複 数 個 存 在 するので インジェ クション 時 Vary by Cycle を 利 用 する レポートポイントテーブルにアナライト 名 および 濃 度 を 追 加 するためのカラム を 作 成 する をクリックする Keyword:にAnalyteと 入 力 し OKをクリックする 同 様 にConc( 濃 度 )もKeywordに 入 力 し OKをクリックする をクリックする

171 168 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Vary by Cycleにマークをいれ Solution:にKeywordで 入 力 したAnalyteと 入 力 す る レポートポイントおよび 再 生 溶 液 の 添 加 は ステップ 4 と 同 様 に 設 定 する

172 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 169 Next>をクリックする Repl に 同 一 サンプルの 繰 り 返 し 回 数 Analyte にはサンプル 名 および Conc に 濃 度 を 入 力 する ( 注 意 )Conc には μg/ml などの 単 位 を 入 力 することもできるが Concentration Evaluation で 解 析 を 行 う 場 合 には 単 位 をいれないほうが 便 利 である Next>をクリックする

173 170 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプル 位 置 および 容 量 の 確 認 および 変 更 を 行 い(101 ページ 参 照 ) Next>を クリックする

174 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 171 再 度 サンプル 位 置 および 容 量 の 確 認 を 再 度 行 い Startをクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Saveをクリックする 実 験 が 開 始 される

175 172 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-5.Wizard Templateについて Biacore 3000 では あらかじめ 重 要 な Wizard Template が 保 存 されている アルデヒドカップリング 法 濃 度 分 析 HPAセンサーチップカップリング 法 リガンドチオールカップリング 法 競 合 反 応 法 再 生 条 件 検 討 法 ポジティブコントロール 5 サイクル 毎 のポジティブコントロール NTA センサーチップカップリング 法 NTA センサーチップ 前 処 理 法 SA センサーチップ 前 処 理 法 表 面 チオールカップリング 法 これらの 方 法 を 用 いて 実 験 を 行 うときには Template を 利 用 すると 非 常 に 便 利 である 次 に アルデヒドカップリング 法 HPA センサーチップカップリング 法 リガ ンドチオールカップリング 法 についての Wizard を 説 明 する

176 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 173 1アルデヒドカップリング 法 糖 タンパク 質 の 糖 鎖 を 介 して 固 定 化 する 方 法 である あらかじめ 糖 タンパク 質 をメタ 過 ヨウ 素 酸 で 還 元 し 糖 鎖 の 非 還 元 末 端 を 開 裂 (ホルミル 基 に)させた ものを 作 成 する また センサーチップ 表 面 は ヒドラジン 等 でアミノ 基 末 端 を 作 成 する メタ 過 ヨウ 素 酸 処 理 済 リガンドをインジェクトし シッフ 塩 基 で 固 定 化 後 還 元 して(アマドイ 転 移 ) 共 有 結 合 化 させる 方 法 である 詳 しくは BIAapplication Handbook を 参 照 すること ( 準 備 するもの) 5mM ヒドラジン 溶 液 メタ 過 よう 素 酸 処 理 糖 タンパク 質 (BIAapplication Handbook を 参 照 ) 0.1M Na-cyanoborohydride in 10mM Acetate buffer (ph4) 再 生 溶 液 ( 例 10mM Gly-HCl, ph2) ( 方 法 ) Run Run Application Wizard をクリックする Open Template をクリックする C:\Program Files\BIACORE 3000\Guide\Methods\Wizard Template を 開 き Aldehyde Coupling.blw を 選 択 する

177 174 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Edit をクリックする 一 連 の 操 作 の Wizard Template が 表 示 される

178 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 175 Next>をクリックする Number of Cycle of Runに 測 定 繰 り 返 し 回 数 1 を 入 力 し Next>をクリックする 使 用 するフローセルを 選 択 し Next>をクリックする

179 176 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 試 料 を 指 定 された 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 した 後 Next>をクリックする ( 上 記 の 場 合 のセット 位 置 例 ) R2A1:リガンド 希 釈 液 (バイアルの 8 分 目 までいれたもの リガンドイン ジェクト 前 のニードル 洗 浄 に 使 用 ) R2A2:リガンド(~50μg/ml) R2B1:0.1M Na-cyanoborohydride/ 0.1M Na-acetatebuffer (ph4) R2E1:EDC R2E2:NHS R2E3: 混 合 用 空 容 器 R2E4:1M エタノールアミン 塩 酸, ph 8.5 R2F1:5mM ヒドラジン 溶 液 (バイアルに 8 分 目 までいれたもの ヒドラジ ンインジェクト 前 のニードル 洗 浄 に 使 用 ) R2F2:5mM ヒドラジン

180 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 177 サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 後 Startをクリックする 続 いて Save Wizard Results Asのボックスが 開 いてくるので 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイ ル 名 を 入 力 してSaveをクリックする

181 178 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 2HPA センサーチップカップリング 法 この Wizard では HPA センサーチップを 使 用 して 糖 脂 質 やリン 脂 質 を 含 むリ ポソームをインジェクトし 脂 質 の 一 重 膜 として 固 定 化 する 方 法 である 詳 しくは センサーチップ 添 付 の 資 料 を 参 照 のこと ( 準 備 するもの) Liposome( 通 常 は 0.5mM ランニング 緩 衝 液 で 希 釈 したもの) Detergent(20mM Chaps あるいは 40mM Octylglicoside 等 ) BSA 溶 液 (0.1mg/ml ランニング 緩 衝 液 で 希 釈 したもの) 50mM NaOH 水 溶 液 Open Template をクリックする C:\Program Files\BIACORE 3000\Guide\Methods\Wizard Template を 開 き HPA Chip Coupling.blw をクリックする

182 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 179 Edit をクリックする 一 連 の 実 験 の Wizard Template が 表 示 される 必 要 により 内 容 を 変 更 し Next>をクリックする

183 180 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Number of Cycle to Run:に 測 定 繰 り 返 し 回 数 1 を 入 力 し Next>をクリックす る 使 用 するフローセルを 選 択 後 Next>をクリックする

184 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 181 表 示 の 位 置 に 試 料 をセットするか 変 更 して Next>をクリックする (サンプル 位 置 の 例 ) R2A1:Detergent R2B1:Liposome 溶 液 R2C1:BSA 溶 液 R2F3:50mM NaOH

185 182 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 し Startをクリックする 続 いて Save Wizard Results Asボックスが 開 いてくるので 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Saveをクリックすると 実 験 が 開 始 される

186 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 183 3リガンドチオールカップリング 法 リガンド 表 面 にある 遊 離 のチオール 基 を 介 して 固 定 化 する 方 法 である ( 準 備 するもの) リガンド(プレコンセントレーション 効 果 のある 緩 衝 液 に 希 釈 したもの 21,89 ページ 参 照 ) NHS EDC 80mM PDEA in 0.1M Borate buffer(ph8.5) 50mM l-cysteine-1m NaCl in 0.1M Formate buffer(ph4.3) Open Template をクリックする C:\Program Files\BIACORE 3000\Guide\Method\Wizard Template を 開 き Ligand Thiol Coupling.blw をクリックする

187 184 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Edit をクリックする 一 連 の 実 験 の Wizard Template が 表 示 される 必 要 により 内 容 を 変 更 し Next>をクリックする

188 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 185 Number of Cycle to Run:に 繰 り 返 し 測 定 回 数 1 を 入 力 し Next>をクリックす る 使 用 するフローセルを 選 択 後 Next>をクリックする

189 186 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 表 示 の 位 置 にサンプルをセットするか 変 更 して Next>をクリックする (セット 位 置 の 例 ) R2A1:PDEA(4.5mg in 250μl 100mM Borate buffer, ph 8.5 ) R2B1:リガンド 希 釈 液 (バイアルの 8 分 目 にいれたもの リガンドインジ ェクト 前 のニードル 洗 浄 用 ) R2B2:リガンド(プレコンセントレーション 効 果 のある 緩 衝 液 に 希 釈 した もの ) R2C1:L-cystein(1.5mg)/NaCl(14mg) in 250μl 0.1M Sodium formate buffer(ph 4.5) R2E1:EDC R2E2:NHS R2E3:NHS/EDC 混 合 用 空 バイアル

190 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 187 サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 後 Startをクリックする 続 いて Save Wizard Results Asボックスが 開 いてくるので 保 存 先 のフォルダを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 してSaveをクリックする

191 索 引 [あ] アスタリスクマーク 70 アナライト 40 アプリケーション ウイザード 87 アミンカップリング 18,19,24,96,107 アミンカップリングキット 19 アルデヒドカップリング 18,173 インジェクト 11,42,48 インジェクトの 拡 張 機 能 48 インジェクトの 中 止 48 ウイザード テンプレート 172 エアの 除 去 57 エクストラクリーンアップ 48 温 度 設 定 9 [か] 核 酸 の 固 定 化 19 カップリング 緩 衝 液 21,89 基 本 操 作 11 緊 急 停 止 31 固 定 化 プログラム 25,75 固 定 化 量 の 調 節 35 コントロールウエアソフトの 起 動 2 [さ] 再 生 溶 液 40,45 サニタイズ 57

192 サンプルの 調 整 20,47 システムチェック 59 システムの 初 期 化 3 シャットダウン 54 スタンバイ 54 センサーグラムの 表 示 47 センサーチップ 4 センサーチップの 挿 入 3 センサーチップの 抜 き 取 り 55 センサーチップの 保 存 55 相 互 作 用 の 検 討 (マニュアル 操 作 ) 41 相 互 作 用 の 検 討 (プログラム 操 作 ) 50 相 互 作 用 のプログラム 50,82 装 置 の 配 置 1 ソフトウエアの 起 動 2 [た] チオールカップリング 18,183 低 分 子 物 質 の 固 定 化 20 データの 管 理 62 電 源 の 立 ち 上 げ 1 [な] ノーマライズ 10 濃 度 測 定 (Wizard) 166 [は] パイオニアセンサーチップ 4

193 ファイルの 保 存 19 ファイルの 保 存 様 式 53 フローパス 46,72 プライム 5,56 フラッシュ 56 プレコンセントレーション 21,89 プレラン 28 プログラムの 実 行 30 プログラムの 終 了 32 プログラムの 説 明 64 プログラムによる 相 互 作 用 の 検 討 50 ベースラインの 取 り 方 15,71 ペプチドの 固 定 化 20 [ま] マニュアルインジェクト 35 メインボックス 64 メソッドの 編 集 28 メンテナンス 56 [ら] ラックベース 7,8 リガンド 18 リガンド 希 釈 液 20 リガンドチオールカップリング 18,183 リガンドの 固 定 化 18,24,96,107 リファレンスライン 14 リンス 56 レポートポイント 14,68 流 路 の 設 定 41,46 流 路 の 詰 まりのある 時 58

194 INDEX [A] Aim for immobilization level(wizard) 98,99 Application Wizard 87 Aprog ボックス 65 [B] BIGINJECT 42 Binding Analysis 87,122 B1 チップ 4 [C] Close 54 CM5 チップ 4 COINJECT 42 Command Queue 49 Control Experiments(Wizard) 88 Customized Application Wizard 88,145 C1 チップ 4 [D] Desorb 56 DETECTION の 設 定 51,72 DNA の 固 定 化 19 Dock 3 [E] Extra Cleanup 48 [F] F1 チップ 4 FLOWPATH 46,72 FLUSH 56 [H] HPA チップ 4 HPA センサーチップカップリング 法 178

195 [I] If/Then(Wizard) 162 Immobilizatin(Wizard) 87,96 Immobilization ph scouting(wizard) 87,89 INJECT 11,42,48 [K] Kinetics analysis(wizard) 88,128 KINJECT 42 [L] Linked Reaction(Wizard) 88,140 L1 チップ 4 [M] Main ボックス 4 Mass Transfer Control(Wizard) 88,135 Method の 編 集 28 [N] Normalize 10 NTA チップ 4 [P] Prerun Method 28 PRIME 5,56 [Q] QUICKINJECT 42 [R] Regeneration Scouting(Wiazard) 87,111 Rinse 56 [S] SA チップ 4 Sanitize 57 Specify Flow Rate and Injection Time(Wizard) 98,107

196 Standby 54 Surface Preparation(Wizard) 87,89 Surface Performance Test(Wizard) 87,117 [U] Unclogging 58 Undock 55 [W] Wizard Template 172

197 60

198 OFF TEL : : : 30

199 Web 2009 GE