Microsoft Word - 報告書（シ-10櫛泰典）.doc

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1 研 究 成 果 報 告 書 事 業 名 ( 補 助 金 名 ) : 基 盤 的 研 究 開 発 育 成 事 業 ( 研 究 開 発 シーズ 育 成 補 助 金 ) 研 究 開 発 テーマ 名 : エノキ 水 溶 性 画 分 からのβ グルカンを 中 心 とした 医 薬 品 素 材 の 生 産 開 発 研 究 代 表 者 名 : 櫛 泰 典 帯 広 畜 産 大 学 / 教 授 共 同 研 究 者 名 : 石 井 達 帯 広 畜 産 大 学 / 教 授 大 庭 潔 戝 団 法 人 十 勝 圏 振 興 機 構 食 品 技 術 センター/ 課 長 小 林 洋 一 コスモ 食 品 株 式 会 社 / 部 長 外 部 協 力 者 名 : 杉 田 睦 海 滋 賀 大 学 教 育 学 部 / 教 授 糸 乗 前 滋 賀 大 学 教 育 学 部 / 助 教 授 1. 背 景 目 的 十 勝 圏 では 茸 類 の 栽 培 が 比 較 的 大 規 模 に 行 われ 食 用 にする 以 外 に 石 附 部 と 呼 ばれる 柄 の 部 分 が 大 量 に 生 じ そのまま 廃 棄 されているのが 現 状 であった 私 達 帯 広 畜 産 大 学 等 が 中 心 となり 茸 類 の 大 量 に 廃 棄 されている 未 利 用 資 源 から 極 めて 高 い 付 加 価 値 を 生 み 出 す 機 能 性 食 品 或 いは 医 薬 品 素 材 の 原 料 を 一 貫 して 生 産 する 拠 点 を 生 み 出 し 残 さを 全 て 有 効 活 用 する 多 品 種 請 高 付 加 価 値 の 研 究 開 発 に2 年 前 から 取 組 んでいる その 結 果 有 効 活 用 の 大 筋 の 目 処 において 目 的 が 達 成 された 更 に 企 業 レベルでの 生 産 開 発 を 目 的 として その 現 実 的 な 対 応 を 迫 られている 本 研 究 では エノキに 絞 り 水 溶 性 画 分 を 用 いて β グルカンをカラムで 精 製 を 進 め 化 学 構 造 の 詳 細 を 明 らかにし 今 まで 確 認 されている 生 理 作 用 の 検 証 を 行 ない その 生 産 開 発 を 企 業 レベルで 開 発 でき る 段 階 にすることを 目 的 とする 2. 内 容 方 法 本 研 究 ではエノキ 由 来 の 水 溶 性 画 分 に 的 を 絞 って 以 下 の 研 究 開 発 を 押 し 進 める 大 きく 分 けて2つの 点 で 検 討 を 行 なう 1; 今 まで 開 発 研 究 で 確 立 されたβ グルカンの 生 理 作 用 を 最 大 限 引 き 出 すための 化 学 構 造 の 解 析 を 徹 底 して 行 なう その 強 化 のための 誘 導 体 化 も 含 む 2; 企 業 レベルでの 事 業 化 を 視 野 に 入 れ コスト 製 品 化 のプロセスを 詳 細 に 検 討 する 1についての 研 究 開 発 1 エノキからの 水 溶 性 画 分 の 化 学 構 造 ;エノキ 水 溶 液 画 分 のβ グルカンの 含 量 及 び 回 収 率 は 既 に 把 握 しているので この 画 分 からイオン 交 換 クロマトグラフィーにより 結 合 しなかった 多 糖 画 分 を 精 製 す る これを 用 いて 更 にゲルろ 過 を 行 ない β グルカン 画 分 を4つに 分 画 する これらの4つの 分 画 の 詳 細 な 化 学 構 造 をMS,NMR,メチル 化 分 析 により 把 握 する β 位 の 位 置 の 割 合 数 を 求 め 分 岐 度 を 求 め 分 子 量 毎 の 詳 細 な 化 学 構 造 を 把 握 する 21の 化 学 構 造 に 基 づく 生 理 作 用 の 検 証 ; 既 にマウスマクロファージ 系 細 胞 株 (RAW-264)を 用 いてその 効 果 をサイトカインの 一 種 TNF-αの 分 泌 量 を 指 標 にin vitro 系 で 確 立 しているので 基 本 的 にはこの 系 で 化 学 構 造 と 生 理 作 用 の 相 関 関 係 の 確 立 を 目 指 す また マウスによるin vivo の 効 果 も サルコーマ180による 腫 瘍 細 胞 の 増 殖 に 対 する 抗 腫 瘍 効 果 を 適 時 導 入 し 化 学 構 造 と の 差 を 検 討 する 3 水 溶 性 画 分 はβ グルカン 以 外 に 有 用 なペプチド 核 酸 も 多 量 に 含 まれているので イオン 交 換 クロマトグラフィーにより 結 合 した 画 分 についても 新 たな 生 理 作 用 血 圧 低 下 血 糖 低 下 及 び 抗 アレルギー 性 のアッセイの 検 討 を 行 なう 2についての 研 究 開 発 β グルカンの 各 画 分 と 生 理 作 用 と 化 学 構 造 の 相 関 性 が 合 致 したものについて その 後 の 製 品 化 につ なげた 場 合 の 効 率 コストの 計 算 を 含 めて 企 業 レベルで 事 業 価 値 を 充 分 に 検 討 する

2 3. 結 果 成 果 3 1; 今 までの 成 果 (in vivo の 抗 腫 瘍 性 と 細 胞 を 用 いた in vitro 系 のアッセイ) マウスマクロファージ 系 細 胞 株 (RAW 264 )を 用 いて 食 用 茸 類 から 得 られた 水 溶 性 画 分 (β グル カンを 約 10% 含 む )を 用 いて 細 胞 と 共 培 養 する 系 で 72 時 間 培 養 後 培 地 中 に 分 泌 される TNFαをサンドイッチ 法 の ELISA を 用 いることにより このサイトカインが 有 意 に 上 昇 することを 再 現 性 を 持 って 確 認 できることを 確 立 している また 同 時 に ICR マウスに 同 系 統 由 来 の 乳 癌 細 胞 株 (ザルコーマ 180)を 移 植 し この 系 に 同 様 に 食 用 茸 類 から 得 られた 水 溶 性 画 分 (β グルカン)を 用 いることにより in vivo の 抗 腫 瘍 性 の 系 を 確 立 している これらの 系 を 用 いて 更 に 茸 特 にエノキ 由 来 のβ グルカン 画 分 の 構 造 と 活 性 の 相 関 性 を 解 析 するためには β グルカンの 詳 細 な 構 造 解 析 が 必 要 である そこでこの 画 分 を 更 にクロマトグラフィーで 分 離 することにより 解 析 を 行 った β グルカンの 大 まかな 構 造 とその 他 の 高 分 子 多 糖 の 構 造 比 較 は 図 1に 示 されている また RAW 264 細 胞 を 用 いた 場 合 のβ グルカン TNF-α 分 泌 と 関 連 細 胞 の 関 わりを 図 2に 示 す 図 1 β グルカンの 構 造 図 2 β グルカンの 抗 腫 瘍 作 用 機 構 3 2;ゲルクロマトグラフィー エノキ 水 溶 性 画 分 をイオン 交 換 クロマトグラフィーで 核 酸 アミノ 酸 系 の 物 質 を 除 いた 後 セファロー ス4B のゲルクロマトグラフィーに 供 した 横 軸 は 分 画 したフラクションの 偶 数 番 号 一 方 縦 軸 は 各 試 験 管 の 糖 含 量 をフェノール 硫 酸 法 で 測 定 し 其 の 結 果 を 図 -3に 示 した 番 に 大 きなピークが 検 出 された 他 は なだらかな 溶 出 が 観 察 された この 分 離 された 各 フラクションを10 本 ずつ 一 緒 にして 透 析 及 び 凍 結 乾 燥 を 行 い その 後 の in vivo の 抗 腫 瘍 性 と 細 胞 を 用 いた in vitro 系 のアッセイに 供 した

3 グルコース 含 有 量 (フェノール 硫 酸 法 )50μ g/ml フラクション 番 号 図 -3 エノキ 水 溶 性 画 分 由 来 β-グルカンのゲル 濾 過 クロマトグラフィー 3 3;マウスよる 抗 腫 瘍 性 の 検 討 ゲルクロマトグラフィーで 分 離 された 各 フラクションを 画 分 1 5とした これをマウス1 匹 あたり2 0ug を 投 与 した マウスは 予 め ザルコーマ 180 細 胞 を 移 植 しておき その 系 において 抗 腫 瘍 効 果 が 得 られるか 検 討 を 行 った 其 の 結 果 を 表 1に 示 す コント ルとして 用 いた 生 理 食 塩 水 では 腫 瘍 重 量 が 平 均 4 20g であったのに 対 し ゲルクロマトで 分 離 する 前 の 画 分 では0 26g と 有 意 に 抗 腫 瘍 活 性 がこ とを 確 認 できている この 画 分 を 更 に 画 分 1から5に 分 離 し その 各 々を 同 様 に 投 与 すると 画 分 によ り 差 が 観 察 された 即 ち 画 分 2と3では 顕 著 に 抗 腫 瘍 効 果 が 観 察 され 完 全 縮 退 率 もかなりの 割 合 で 観 察 できた 表 1 エノキタケのゲルクロマト 画 分 のザルコーマ 180 に 対 する 抗 腫 瘍 効 果 処 置 腫 瘍 重 量 (g) 抗 腫 瘍 効 果 (%) 完 全 退 縮 率 ( 匹 ) 生 理 食 塩 水 コントロール 4.20 ± /6 クロマト 前 の 水 溶 性 画 分 0.26 ± /6 画 分 ± /5 画 分 ± /6 画 分 ± /6 画 分 ± /6 画 分 ± /6 抗 腫 瘍 効 果 は(コントロール 腫 瘍 平 均 重 量 - 検 体 投 与 腫 瘍 平 均 重 量 ) コントロール 腫 瘍 平 均 重 量 100 という 式 から 求 めた 完 全 退 縮 率 は 腫 瘍 がまったくなくなってしまったマウスの 数 を 指 している 使 用 したマウスは 各 群 6 匹 を 用 いた

4 3 4; 細 胞 を 用 いた in vitro 系 のアッセイ この 画 分 を 用 いて 細 胞 を 用 いた in vitro 系 のアッセイを 行 った 細 胞 はマウスマクロファージ 系 由 来 の 細 胞 株 を 用 いてその 活 性 化 能 を 各 画 分 を 細 胞 と24 時 間 共 培 養 行 うことにより サイトカインの1 種 である TNF-αが 培 地 中 に 分 泌 される 量 をこのサイトカインに 対 する 抗 体 を 結 合 させたサンドイッチの ELISA 法 を 用 いることにより 測 定 した この 方 法 の 概 略 は 図 4で 示 した 図 5に in vitro 系 のアッセ イの 結 果 を 示 した クロマト 前 の 水 溶 性 画 分 では 添 加 量 1 10ug で TNF-αの 分 泌 量 が5ng/ml であ ったのに 対 して 画 分 2 3では 約 30ng/ml の 値 を 示 し マクロファージ 系 細 胞 の 活 性 化 がより 多 く 生 じていることを 示 している 更 に 添 加 量 を 増 やすと 培 地 中 へのサイトカインの 分 泌 量 は 上 昇 し 添 加 量 5 0ug では 初 期 の 数 倍 の 分 泌 量 を 示 した このことは 画 分 2 3は 他 の 画 分 に 比 べて in vitro 及 び in vivo の 両 方 で 他 の 画 分 と 比 べて β グルカンの 活 性 が 高 いことを 示 唆 している また 図 6に 平 成 16 年 度 の 地 域 コンソの 際 得 られた 結 果 を 同 様 に 示 すが 図 の 中 に 示 されたエノキタケ 生 成 物 が 今 回 のイオ ン 交 換 カラムに 供 する 前 の 試 料 である ほぼ 同 程 度 の 量 で TNF-α 分 泌 が 検 出 できる 図 4 TNF α 産 生 によるマクロファージ 活 性 化 能 の 測 定 60 培 養 液 中 のTNF-α 濃 度 (ng/nl) 未 分 画 分 画 1 分 画 2 分 画 添 加 重 量 (μg) 図 5 各 画 分 の TNF α 産 生 の 比 較

5 図 6 精 製 高 分 子 糖 質 画 分 と 熱 水 抽 出 物 との 比 較 ( 平 成 16 年 度 地 域 コンソ 報 告 書 より) 3 5; 画 分 による 構 造 の 違 いについて 表 1と 図 5で 示 された 画 分 毎 の 活 性 の 差 が 何 に 起 因 するのか 興 味 深 い そこで 各 画 分 をフェノ ル 硫 酸 法 を 用 いて 糖 含 量 を 測 定 した グルコース 含 量 として 測 定 すると 各 画 分 で 殆 ど 差 は 見 られず 65 76%のグルコース 含 量 であった また 塩 酸 メタノ ルによる 処 理 を 行 い 更 に TMS 化 を 行 い 各 分 画 に 含 まれる 糖 組 成 の 違 いをガクロマトグラフィーで 分 析 した 表 2にその 結 果 を 示 した 画 分 2で 若 干 キシロースの 量 が 他 の 画 分 と 比 べて 少 ない 以 外 は 差 が 検 出 できなかった 更 にこれらの 画 分 をメチル 化 アルジトールアセテートとして 同 様 に GC 分 析 あるいは GC/MS 分 析 を 行 うと 若 干 の 違 いを 検 出 することができた 即 ち in vivo の 抗 腫 瘍 性 と in vitro のアッセイで 共 通 に 活 性 を 有 した 画 分 2と3では 水 溶 性 画 分 と 同 様 グルコ スの 含 量 が 他 の 画 分 に 比 べて 高 く 糖 鎖 の 結 合 様 式 では1 3グルコース 1 6グルコースが 比 較 的 高 く 活 性 の 本 体 とされている1 3 結 合 1 6 結 合 の 割 合 が 高 いと 考 えられた しかしながらガラクトースやマンノースを 含 有 する 割 合 に 差 があるが 共 通 して 含 まれることから 活 性 本 体 とマンナン ガラクタンがどのように 影 響 するかはここでは 明 らか にできなかった 現 在 画 分 2と3について NMR 測 定 を 行 っている 表 2 構 成 糖 分 析 (エノキ) 水 溶 性 画 分 画 分 1 画 分 2 画 分 3 画 分 4 画 分 5 糖 含 量 (%as Glc) Fuc Xyl Glc Man Gal *Fuc,フユース;Xyl,キシロース;Glc,グルコース;Man,マンノース;Gal,ガラクトース

6 表 3 糖 鎖 結 合 様 式 水 溶 性 画 分 画 分 1 画 分 2 画 分 3 画 分 4 画 分 5 1,4Xyl Glc ,3Glc ,4Glc;1,3Man;1,4Gal ,6Glc:1,6Man:1,3Gal ,6Gal ,3,6Hex ,2,6Hex *Hex,ヘキソース 3 6 企 業 化 についての 研 究 開 発 ゲルクロマトグラフィーで 他 の 画 分 と 比 較 して in vivo の 抗 腫 瘍 性 と in vitro 系 のアッセイで 共 通 に 活 性 を 有 した 画 分 2と3を 精 製 するための コスト 及 び 企 業 レベルでの 事 業 価 値 について 検 討 を 進 め ている 現 在 の 段 階 では コスト 面 からカラムを 用 いた 精 製 を 加 えることで そうでない 場 合 とでは 約 2 5 倍 の 費 用 がかかることが 明 らかになった 4. 今 後 の 展 開 (250 字 程 度 ) エノキ 水 溶 性 画 分 をイオン 交 換 クロマトグラフィーでアミノ 酸 及 び 核 酸 関 連 の 物 質 をほぼ 完 全 に 除 く ことにより 高 分 子 グルコース 画 分 をえることができた 更 にこの 画 分 をゲルクロマトにより 分 子 量 毎 に 分 離 することにより 活 性 ( in vivo の 抗 腫 瘍 性 と in vitro 系 )で 差 があることが 明 らかにな った この 差 は 糖 鎖 の 構 造 と 分 岐 度 の 程 度 に 由 来 していると 思 われるが 完 全 な 解 析 までにはまだ 至 っ ていない しかしながら ゲルクロマトを 用 いることで 活 性 を 有 する 物 質 と 比 較 的 有 しない 物 質 を 大 ま かに 分 離 できたことは 今 後 の 研 究 開 発 に 大 きな 力 になると 考 えられる また 今 回 の 研 究 開 発 ではエノキ 以 外 の 詳 細 なβ グルカンについては 検 討 できなかったが 茸 の 種 類 により 特 有 な 構 造 を 有 すること が 示 唆 され 今 後 の 研 究 開 発 が 望 まれる また 水 溶 性 画 分 はβ グルカン 以 外 に 有 用 なペプチド 核 酸 も 多 量 に 含 まれているので イオン 交 換 クロマトグラフィーにより 結 合 した 画 分 についても 新 たな 生 理 作 用 血 圧 低 下 血 糖 低 下 及 び 抗 アレルギー 性 のアッセイの 検 討 を 行 なうことも 茸 の 活 用 として 今 後 有 望 である 本 事 業 においては 茸 類 特 にその 廃 棄 物 の 有 効 利 用 ということで そのリサイクルシステムの 構 築 が ベースになっている 今 後 十 勝 圏 における 様 々な 一 次 産 品 の 廃 棄 物 を 有 効 利 用 する 上 で この 技 術 シーズは 新 たな 地 域 ニーズの 掘 り 起 こしに 役 立 つばかりでなく 様 々な 産 業 界 に 貢 献 することが 可 能 と なると 考 えられる 5.その 他 なし