リアルタイムPCRでの 解 析 は 年 々 増 加 ここ 数 年 はRNAi microrna DNAアレイ 解 析 等 での 報 告 が 多 い R

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1 リアルタイムPCRによる 遺 伝 子 発 現 解 析 の 基 本 から 応 用 アプライドバイオシステムズジャパン 株 式 会 社

2 リアルタイムPCRでの 解 析 は 年 々 増 加 ここ 数 年 はRNAi microrna DNAアレイ 解 析 等 での 報 告 が 多 い Real Time PCR microrna 年 年 年 年 年 ( 各 年 間 におけるPubMed でのキーワードサーチの 結 果 ) 年 年 年 年 年 年 1 0 年 ( 月 ) Applied Biosystems

3 リアルタイムPCRで 可 能 なアプリケーション 例 相 対 定 量 : 試 料 間 のターゲットの 発 現 量 の 差 ( 何 倍 )を 比 較 ( 例 ) 目 的 遺 伝 子 の 発 現 変 動 ( 時 間 経 過 ごとでの 変 動 測 定 ) ( 例 ) 薬 剤 投 与 時 の 挙 動 ( 薬 剤 濃 度 に 依 存 した 変 動 の 測 定 ) 絶 対 定 量 : 試 料 中 のターゲットの 絶 対 量 (コピー 数 )を 測 定 ( 例 ) ウイルスなどのコピー 数 の 定 量 ( 例 ) バクテリアや 病 原 微 生 物 の 変 動 測 定 定 性 的 測 定 ( 例 ) SNPs タイピング( 薬 物 代 謝 酵 素 変 異 による 副 作 用 予 測 ) Applied Biosystems

4 リアルタイムPCRによる 遺 伝 子 発 現 の 比 較 とSNPタイピング 目 的 遺 伝 子 の 発 現 変 動 測 定 Day 0Day 1Day 2Day 3Day 4Day 5Day 6Day 7Day 8Day 9Day 10 A IL-4 遺 伝 子 A BB TGFβ 遺 伝 子 目 的 の 遺 伝 子 に 対 しての サンプル 間 での 発 現 比 較 薬 物 代 謝 酵 素 のSNPタイピングP450 (CYP2C9*3 ) Applied Biosystems

5 相 対 定 量 法 の 例 : 各 遺 伝 子 の 時 間 毎 の 経 過 を 観 察 横 軸 : 遺 伝 子 の 種 類 (IL-8 & TGF-β 遺 伝 子 ) 縦 軸 : 発 現 量 比 較 (Logスケールで 表 示 ) 60h 36h 48h 24h 48h 36h 60h 12h 24h 0h 12h 0h 縦 軸 スケール Log 相 対 表 記 Applied Biosystems

6 RNAiでの 遺 伝 子 発 現 抑 制 64 種 類 の 遺 伝 子 に 対 して 356 種 類 の RNAi を 作 成 して 測 定 80% 以 上 の ノックダウンを リアルタイムPCRで 確 認 (Celera Genomics & Applied Biosystems, USA) Applied Biosystems

7 microrna 検 出 定 量 のデータ mirna profiles classify embryoid bodies ES EBs) cells, and ( differen tissues 一 定 量 発 現 しているmicroRNA (Ct 値 =35 未 満 の)は ES EC 各 組 織 で100 種 類 以 上 ある Data from: Caifu Chen, Applied Biosystems and William M. Strauss, University of Colorado Applied Biosystems

8 microrna 検 出 定 量 のデータ mirna Expression signature in ) Human tumorsgliobl Data Ridzon from:, Applied Biosystems and 8 Ambros, Dartmouth Medical 2006 School Applied Biosystems Center and the

9 サンプルの抽出 30分 1時間 サンプルと試薬の混合 リアルタイムPCRでの 分析 時間 データの解析 検出 Applied Biosystems

10 遺 伝 子 の 発 現 量 比 較 の 手 技 ノザン 解 析 からリアルタイムPCR 定 量 へ ノザン 解 析 リアルタイムPCR 定 量 p GAPDH 5 日 間 バンドの 濃 淡 で 遺 伝 子 発 現 量 の 比 較 PCRの 増 幅 曲 線 で 遺 伝 子 発 現 量 の 比 較 (2 倍 差 の 検 出 & 広 いダイナミックレンジ) Applied Biosystems

11 遺 伝 子 の 発 現 量 の 手 技 の 比 較 所 要 時 間 必 要 なRNA 量 特 徴 ノザンハイブリ RNA 電 気 泳 動 (8 時 間 ) ブロット(8 時 間 ) ハイブリ(2 時 間 ) 洗 い(2 時 間 ) 検 出 解 析 ( 合 計 24 時 間 以 上 ) Total RNA = 10~20μg 程 度 /Well デンシトメーターでの 画 像 解 析 クロスハイブリの 問 題 Total RNA リアルタイムPCR RNA 逆 転 写 (1 時 間 半 ) リアルタイムPCR(1 時 間 半 ) 解 析 解 析 ( 合 計 3 時 間 程 度 ) = 10~100ng 程 度 /Well 2 倍 の 正 確 な 発 現 比 較 が 可 能 大 量 サンプルの 解 析 も 可 能 50 万 種 以 上 のProbe を 提 供 Applied Biosystems

12 リアルタイムPCRによる 遺 伝 子 の 発 現 比 較 検 体 からのTotal 回 収 RNA ( 培 養 細 胞 組 織 血 液 等 ) Ambion P/N 1912 RNAqueous Kit 50 purifications 31,000 ( 操 作 時 間 :30 分 程 度 ) cdna 合 成 (mrnaの 逆 転 写 反 応 ) ( 反 応 時 間 :1 時 間 ) リアルタイムPCR 実 験 AppliedBiosystems, P/N N TaqMan Reverse Transcription Reagents ランダムヘキサマーでの 逆 転 写 を 推 奨 ( 反 応 時 間 :30 分 ~1.5 時 間 ) AppliedBiosystems, P/N TaqMan Universal PCR Master Mix 解 析 結 果 AppliedBiosystems, P/N Power SYBR Green Master Mix Applied Biosystems

13 理 想 的 なPCR 反 応 は1 回 のサイクルで ターゲットのDNAが2 倍 に 増 幅 する (n 回 PCR 反 応 終 了 時 の)PCR 産 物 量 =テンプレートの 初 期 濃 度 x 2 n L og ( 表 示 ) 増 幅 産 物 量 増 幅 回 数 (サイクル 数 n) Applied Biosystems

14 実 際 のPCR 反 応 では1 回 のサイクルで DNAが2 倍 に 増 幅 する 領 域 は 限 られる PCR 反 応 の 初 期 は 検 出 限 界 以 下 である PCR 反 応 の 後 期 はプラトー 状 態 になる プラトー L og ( 表 示 ) 検 出 量 増 幅 回 数 (サイクル 数 n) プラトーを 引 き 起 こす 原 因 PCR 産 物 の 基 質 (dntp やフ ライマー )の 枯 渇 酵 素 の 失 活 PCR 阻 害 物 の 蓄 積 など Applied Biosystems

15 PCRの 各 サイクルで 蛍 光 強 度 から 目 的 遺 伝 子 の 検 出 を 行 う 初 期 濃 度 が2 倍 違 うと 1サイクルずれて 増 幅 曲 線 が 立 ち 上 がる L og ( 表 示 ) 検 出 量 サイクル 数 PCR 終 了 後 にゲル 電 気 泳 動 を 行 っても 定 量 することはできない! Applied Biosystems

16 各 サイクル 毎 に 蛍 光 を 検 出 すると 増 幅 曲 線 を 作 成 することができる 1サイクルの 差 が2 倍 の 濃 度 の 差 に 相 当 する L og ( 表 示 ) 検 出 量 交 点 (Ct 値 ) サイクル 数 補 助 線 (Threshold )と 増 幅 曲 Line 線 の 交 点 (Ct 値 )をみると 2 倍 の 初 期 濃 度 の 差 は 1サイクルの 差 になる Applied Biosystems

17 値 ) 交 点 の 値 (Ct 値 )と 濃 度 の 関 係 をプロットすると 検 量 線 を 作 成 することができる ( 交 点 のサイクル 数 :C t ,250 2,500 5,000 (Copy 数 ) 10, ( 希 1釈 率 ) ( 相 対 値 %) 1 2 ( 相 4 対 値 ) 複 数 の 未 知 濃 度 のサンプルも 検 量 線 から 算 出 比 較 検 討 ができる Applied Biosystems

18 例 )ガン 細 胞 と 正 常 細 胞 の 比 較 の 場 合 L og ( 表 示 ) 検 出 量 Ct=21 (ガン 細 胞 由 来 cdna 検 体 ) サイクル 数 Ct=23 ( 正 常 細 胞 由 来 cdna 検 体 ) 検 体 における 遺 伝 子 の 発 現 量 の 違 いを サイクル 数 (Ct 値 )で 示 す 事 が 出 来 る Applied Biosystems

19 例 )ガン 細 胞 と 正 常 細 胞 の 比 較 の 場 合 サイクル 数 (Ct 値 ) 正 常 細 胞 由 来 cdna23 22 ガン 細 胞 由 来 cdna ( 相 対 値 ) 以 上 の 検 量 線 の 比 較 から 目 的 遺 伝 子 は ガン 細 胞 の 相 対 値 :16, 正 常 細 胞 の 相 対 値 : となり 4 ガン 細 胞 では4 倍 の 発 現 量 がある 事 がわかる Applied Biosystems

20 増 幅 効 率 遺 伝 子 発 現 定 量 に 関 して 重 要 な 要 因 PCR 産 物 の 増 幅 効 率 は 以 下 の 式 で 算 出 できる 増 幅 効 率 e = 10-1/slop 1 例 えば slopの 値 が 3.366の 場 合 e = 10-1/ = = =0.98 おおよそ 0.98の 割 合 で 増 幅 していることがわかる Applied Biosystems

21 検 量 線 をかくためのスタンダードカーブ 作 成 用 サンプル 絶 対 定 量 を 行 うとき(ウイルスの 定 量 等 の 場 合 ) 絶 対 値 (コピー 数 )が 既 知 のものを 利 用 PCR 産 物 やVector 等 で 塩 基 数 のサイズや 質 量 がわかっているもの 相 対 定 量 を 行 うとき( 通 常 の 発 現 解 析 の 場 合 ) 数 サンプル 間 での 比 較 を 行 いたい 場 合 目 的 遺 伝 子 が 強 く 発 現 するcDNA 溶 液 を1とし その 段 階 希 釈 をとり それ 以 外 のサンプルが どこに 検 出 されるかによって 判 定 する ( 一 般 的 ) Applied Biosystems

22 定 量 PCR( 絶 対 定 量 ) コピー 数 への 変 換 ステップ1: 分 子 量 (mw)の 計 算 二 重 鎖 DNAプロダクトの 長 さ(bp) 330 (6630 bp) (330dal 2nt/bp) = dal (g/mole) daltons 2 nt/bp=x daltons (g/mole) ステップ2: 分 子 量 からコピー 数 への 変 換 X g/mole アボガドロ 定 数 ( molecules/mole )=Y moleclue g/ Y:1 分 子 (コピー)あたりのサンプルDNAの 重 量 ( g/mole) ( molecules/mole)= g/molecul プラスミド(6630 bp)dna1 分 子 あたり g すなわち 1pgのプラスミドで 約 13 万 コピーに 相 当 ( 詳 細 はアプライドバイオシステムズのホームページにて) Applied Biosystems

23 ( 例 )ノロウイルスG1 領 域 の 増 幅 曲 線 (1 0 ~10 7 copy の10 倍 希 釈 サンプル) 04copy o py 02cop p y 03c y p y 7 copy 1 06c 0 1 o py 1 05co 1 copy 1 00co Applied Biosystems

24 ノロウイルスG1 領 域 の 検 量 線 1 0 copy 10 1 copy 10 2 copy 10 3 copy 10 4 copy 10 5 copy (1 0 ~10 7 copy の10 倍 希 釈 サンプル) 10 6 copy 10 7 copy Applied Biosystems

25 検 量 線 を 用 いた 測 定 方 法 1 0 copy 10 1 copy 既 知 濃 度 サンプルのThreshold Li との 交 点 (Ct 値 )から 作 成 した 検 量 線 から サンプルの 交 点 (Ct 値 )を 比 較 10 2 copy copy Ct 値 10 4 copy 10 5 copy 10 6 copy copy 240 copy 3,800,000 copy 濃 度 (copy 数 ) Applied Biosystems

26 リアルタイムPCRでの 蛍 光 検 出 方 法 PCR 産 物 を 各 サイクルで 検 出 するために TaqMan 法 (5 -Nuclease ) Assay SYBR Green 法 Applied Biosystems

27 TaqMan フ ローブとPrimer の 設 計 のバックグランド 目 的 の 配 列 をはさむ 特 異 性 の 高 い 領 域 でPrimer を 設 計 し TaqMan Probe をその 中 心 に 設 計 する 5 3 Forward Primer R TaqMan Probe Q MGB Reverse Primer Applied Biosystems

28 Primer とTaqMan フ ローブの 設 計 のガイドライン PCR primer 目 的 配 列 を 含 む150bp 程 度 の 領 域 を 増 幅 するように 設 計 (Tm=58 ~60 ) TaqMan フ ローブ PCR 産 物 のほぼ 中 央 にくるような Oligo の 配 列 を 設 計 (Tm=68 ~70 ) 5 末 端 側 にレポーター 蛍 光 色 素 3 末 端 側 にクエンチャー 蛍 光 色 素 を 付 加 5 R Forward Primer 5 Reverse Primer Q MGB Applied Biosystems

29 ゲノムのコンタミを 検 出 しないようにTaqMan フ ローブとPrimer を 設 計 する Primer は 可 能 であればIntron を 挟 み 異 なるExon 上 にPrimer を 設 計 する また TaqMan Probe をジャンクション 部 位 に 設 計 する (ゲノムDNAの 誤 検 出 を 防 ぐため) ゲノムDNA Forward Primer Exon1 Reverse Primer Exon2 mrna Forward Primer R Exon1 TaqMan Probe Q MGB Exon2 Reverse Primer Applied Biosystems

30 単 体 のレポーター 色 素 青 色 光 により 励 起 エネルギーを 蓄 え 発 光 する 特 徴 をもつ R TaqMan Probe の 特 徴 R Q 蛍 光 共 鳴 エネルギー 転 移 現 象 MGB レポーター 色 素 Fluorescein 系 の 蛍 光 色 素 (FAMもしくはVIC) 5 3 クェンチャー レポーター 色 素 の 蛍 光 エネルギーを 消 去 Applied Biosystems

31 特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 PCR 反 応 時 には TaqMan フ ローブが 先 に 特 異 性 の 高 い 遺 伝 子 領 域 に 結 合 する(68-70 付 近 ) 5 3 Forward Primer TaqMan Probe R Q Reverse Primer Applied Biosystems

32 特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 次 に 目 的 遺 伝 子 特 異 的 なPrimer が 結 合 する(58-60 付 近 ) Forward Primer TaqMan Probe R Q Reverse Primer Applied Biosystems

33 特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 Primer 部 位 にDNAホ リメラーセ が 結 合 して 伸 長 反 応 が 進 む 5 3 Forward Primer R TaqMan プローブが 分 解 され 始 める Q Reverse Primer Applied Biosystems

34 特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 DNAホ リメラーセ の 伸 長 方 向 にDNAがあると TaqMan プローブが 分 解 される(エクソヌクレアーセ 活 性 ) Q によって 抑 制 されていた Rの 蛍 光 が 生 じる R TaqMan プローブの RとQ の 距 離 が 離 れて Rが 発 光 し 始 める Q Applied Biosystems

35 特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 PCRが 終 了 し 伸 長 反 応 が 終 了 するとTaqMan フ ローブは 分 解 され Rの 蛍 光 が 検 出 を 検 出 することができる R Q Applied Biosystems

36 PCRが 進 むと TaqMan フ ローブは 分 解 され レポーターの 蛍 光 強 度 が 増 加 する TaqMan -MGBプローブでは レポーターの 蛍 光 色 素 のみを 検 出 できる 蛍 光 強 度 PCRサイクル 数 Applied Biosystems

37 R TaqMan アッセイでの 反 応 組 成 逆 転 写 試 薬 AppliedBiosystems, P/N TaqMan Reverse Transcri マスターミックス AppliedBiosystems, P/N4 TaqMan Universal PCR Ma DNA Template はcDNA を Total での RNA 質 量 を 元 に 利 用 反 応 組 成 の 一 例 /well Final TaqMan Universal PCR Master Mix (2x) 25μL 1x 10μM Forward Primer 4.5μL 900nM 10μM Reverse Primer 4.5μL 900nM 10μM TaqMan Probe 1.25μL 250nM Template (cdna 10ng/μL) 5μL 50ng d3w 12.75μL Total 50μL Applied Biosystems

38 リアルタイムPCRTaqMan ケミストリの 特 徴 TaqMan プローブが 分 解 されることによって 生 じる 蛍 光 を 検 出 するので 蛍 光 量 がPCR 増 幅 を 反 映 する Primer ペアだけの 設 定 よりも 配 列 特 異 性 を 高 める 事 ができる 2 種 類 の 蛍 光 を 用 いて2Probe アッセイを 行 え サンプルの 有 効 利 用 やコストダウンが 可 能 である SNPタイピングが 可 能 である 低 発 現 遺 伝 子 測 定 の 際 のバラツキを 低 減 できる Applied Biosystems

39 SYBR Green アッセイ I 特 徴 DNAにインターカレートして 蛍 光 を 発 する 蛍 光 物 質 SYBR Green の I 存 在 下 でPCRを 行 い すべての2 本 鎖 DNAを 検 出 する PCR 産 物 の 定 性 的 な 検 知 が 可 能 注 意 PCRPrimer の 配 列 には 充 分 な 注 意 が 必 要 Primer の 濃 度 に 注 意 が 必 要 プライマーダイマー 由 来 の 蛍 光 が 生 じる non-specific アニーリング 由 来 の 蛍 光 が 生 じる 蛍 光 量 と 反 応 産 物 量 の 比 が 必 ずしも1:1ではない Applied Biosystems

40 PCR 反 応 が 進 み 増 幅 産 物 が 増 えると SYBR Green の 蛍 光 量 も 増 加 する PCR 反 応 スタート PCR 反 応 終 了 Applied Biosystems

41 SYBR Green ケミストリ 使 用 時 には Primerの 設 計 に 注 意 が 必 要 である ATATATAT 互 いに 結 合 ATATATAT TATATATA 120bp DNAPolimeraseが 認 識 PCR 反 応 で 増 幅 1 目 的 バンド 2Primerダイマー 3スメアー 4 非 特 異 的 バンド Primer の 設 計 での 注 意 や 反 応 条 件 の 最 適 化 が 必 ず 必 要 Applied Biosystems

42 SYBR Green 反 応 液 組 成 SYBR Green アッセイでの 反 応 組 成 逆 転 写 試 薬 AppliedBiosystems, P/N N80 TaqMan Reverse Transcripti マスターミックス AppliedBiosystems, P/N 436 Power SYBR Green Master Mi DNA Template はcDNA を Total での RNA 質 量 を 元 に 利 用 反 応 組 成 の 一 例 /well Final SYBR Green PCR Master Mix (2x) 25μL 1x 10μM Forward Primer xxμl nM 10μM Reverse Primer xxμl nM Template (cdna 10ng/μL) 5μL 50ng d3w xx μl Total 50μL No template control で プライマーダイマーができない 条 件 等 を 複 数 検 討 することが 必 要 です Applied Biosystems

43 SYBR Green PCR 正 確 Assay な 定 量 結 果 を 得 る 為 に 非 特 異 的 産 物 の 生 成 の 確 認 (Dissociation の 作 成 ) Curve 一 見 高 コピー 領 域 で 定 量 できているように 見 受 けられるが 全 てのサンプルにおいて 非 特 異 的 産 物 が 生 成 している 定 量 性 に 非 常 に 大 きな 疑 問 4 倍 希 釈 (8 段 階 ) 非 特 異 的 産 物? プライマーダイマー? NTC Applied Biosystems

44 リアルタイム 定 量 PCRの 解 析 法 内 在 性 コントロールによるサンプル 間 の 補 正 検 量 線 を 用 いない 新 しい 比 較 定 量 方 法 Applied Biosystems

45 リアルタイムPCRによる 定 量 法 の 例 ( 内 在 性 コントロールで 相 対 値 で 比 較 ) 希 釈 率 で 検 量 線 を 作 成 して 比 較 する 方 法 サンプル 0 hrs 標 的 遺 伝 子 発 現 量 (p53) 0.2 内 在 性 コントロール 標 準 化 比 較 結 果 遺 伝 子 発 現 量 (GAPDH ) (p53/gapdh) (0hrsを1として) hrs hrs hrs p53の 発 現 量 p53の 発 現 量 hrs 12 hrs 24 hrs 36 hrs Applied Biosystems

46 リアルタイムPCRによる 定 量 法 の 例 ( 比 較 定 量 法 ) 検 量 線 を 作 成 せずに 比 較 定 量 する 方 法 Comparative T 法 C 1サイクルの 検 出 の 違 いで 2 倍 量 の 差 であるという 理 論 を 活 用 して 算 出 する 方 法 2 - CT * 検 量 線 作 成 が 不 要 なので 多 サンプルを 処 理 できる* C T 法 の 成 立 する 条 件 1 ターゲット 遺 伝 子 と 内 在 性 コントロール 遺 伝 子 のPCR 効 率 がほぼ 等 しい 希 釈 によって C T 値 が 変 動 しない= 検 量 線 を 描 いた 時 の 傾 きが 同 じ 2 PCR 効 率 が1に 近 い 設 計 のガイドラインに 基 づくとPCR 効 率 の 良 い 短 いPCR 産 物 のサイズで 設 計 ができる Applied Biosystems

47 GAPDH 遺 伝 子 を 内 部 標 準 として 用 い Brain でのc-myc 遺 伝 子 の 発 現 量 を 1とした 場 合 の 各 臓 器 におけるc-myc 遺 伝 子 の 発 現 量 を 比 較 標 的 遺 伝 子 参 照 遺 伝 子 Ct 値 Ct 2 - Ct 相 対 比 組 織 Brain ( 脳 ) Kidney =5.6 ( 腎 臓 ) Liver ( 肝 臓 ) Lung ( 肺 ) c-mycの 平 均 Ct 値 GAPDHの 平 均 Ct 値 (c-myc)ct 値 =1 =6.86 =4.37 = -2.5 =1.60= * Ct 値 は 一 定 の 蛍 光 強 度 に 達 したサイクル 数 * 指 数 の 割 り 算 は 乗 数 項 の 引 き 算 - (GAPDH)Ct 値 ( 各 臓 器 の Ct 値 ) =2.81= =37 =16.5 c-mycの 発 現 比 較 (GAPDH で 補 正 ) Applied Biosystems - (Brain の Ct 値 ) =0 乗 数 項 に 代 入 1 37

48 Brain でのc-myc 遺 伝 子 の 発 現 量 を1とした 場 合 Kidney では5.6 倍 Liver では37 倍 Lung では16.5 倍 の 発 現 量 があった 組 織 相 対 比 cmyc の 発 現 量 Brain ( 脳 ) Kidney ( 腎 臓 ) Liver ( 肝 臓 ) cmyc の 発 現 量 Lung ( 肺 ) Brain Kidney Liver Lung Applied Biosystems

49 内 在 性 コントロール 遺 伝 子 とは? 組 織 や 細 胞 の 個 数 をそろえ 反 応 系 へのcDNA 持 込 量 やRT 効 率 の 差 を 補 正 刺 激 などに 対 して 発 現 量 が 変 化 せず 常 に 一 定 量 発 現 している 遺 伝 子 が 望 ましい 歴 史 的 には ハウスキーピング 遺 伝 子 (GAPDH, β-actin,etc) 18s rrna などが 利 用 されてきた しかし Applied Biosystems

50 PO IPC (Positive Control) 18S ribosomal RNA PO 複 数 の 臓 器 での 内 在 性 コントロール 検 討 beta-actin CYC GAPDH 18srRNA やβ-Actin GUS TBP 遺 伝 子 は 各 臓 器 間 での 変 動 が 少 なく 各 サンプル 間 での 増 幅 曲 線 が 隣 接 している また GAPDH TfR 遺 伝 子 は 変 動 が 大 きく 各 臓 器 での 増 幅 曲 線 に 変 動 が 見 られる なお 当 実 験 の 結 果 がすべての 実 験 系 に 当 てはまるわけではないので 個 々の 実 験 系 に 応 じて 検 討 する 必 要 がある ß 2 -Microglobulin PGK GUS HPRT TBP TfR Applied Biosystems

51 異 なる 内 在 性 コントロール 遺 伝 子 を 用 いた 解 析 結 果 の 比 較 Bone Marrow を 基 準 としたIL-10 の 相 対 定 量 結 果 s Normalized IL-10 GAPDH Normalized IL Bone Marrow Spleen Thymus Lung Applied Biosystems

52 リアルタイムPCRのアッセイ 選 択 Applied Biosystems

53 TaqMan Gene Expression Assays 遺 伝 子 発 現 解 析 用 のTaqMan Gene Expression Assays 条 件 検 討 不 要 論 文 にもそのまま 採 択 高 品 質 なデータを 提 供 Webから 検 索 & 発 注 ( 検 索 のみは 登 録 不 要 ) TaqMan Gene Expression Assays Inventoried Assay: Pre-made デザイン 済 み 在 庫 あり 100 反 応 (50μL 反 応 時 ) 250 反 応 (20μL 反 応 時 ) 28,000- Non-Inventoried Assay: Made-to-Order デザイン 済 み 在 庫 なし 140 反 応 (50μL 反 応 時 ) 360 反 応 (20μL 反 応 時 ) 45, Applied Biosystems

54 TaqMan Gene Expression Assays Applied Biosystems

55 TaqMan Gene Expression 検 索 方 法 Assays Applied Biosystems

56 TaqMan Gene Expression 検 索 方 法 Assays Applied Biosystems

57 TaqMan Gene Expression 検 索 方 法 Assays 遺 伝 子 名 やRefSeq 入 力 動 物 種 入 力 検 索 ID Applied Biosystems

58 TaqMan Gene Expression 検 索 方 法 Assays 検 索 オプションあり Applied Biosystems

59 Pre-madeとMade to Orderの 違 い 価 格 Pre-made : 28,000-/100 反 応 分 Made to Order : 45,000-/150 反 応 分 納 期 Pre-made : 約 1 週 間 Made to Order : 約 2 週 間 QCチェック(humanのみ) Pre-made : humanのcdnaサンプルを 用 いて 増 幅 確 認 済 み Made to Order : 増 幅 は 未 確 認 特 に 設 計 位 置 の 指 定 がないときにはPre-madeアッセイを 推 奨 します Applied Biosystems

60 Assay に 含 まれる ID 情 報 Hs _m 生 物 種 : 学 名 の 頭 文 字 の 組 み 合 わせ Hs: H. Sapience Mm: M. musculus Rn: R. norvegicus At: A. thaliana Dm: D. melanogaster 2 プライマー プローブセット 固 有 の 番 号 設 計 した 順 番 に 割 り 当 てられ 数 が 大 きいほど 新 規 に 設 計 3 Genomic 由 来 の DNA 増 幅 m: genomic が 混 入 していても DNA 増 幅 しません s: 同 一 のエキソン 上 にプライマー プローブが 設 計 されているので genomic が 混 入 DNA していたら 増 幅 します g: 染 色 体 上 に 相 同 性 の 高 い 配 列 が 存 在 するため genomic DNA から 増 幅 する 恐 れがあります u: 挟 んであるイントロンサイズが 短 いため genomic から 増 DNA 幅 する 恐 れがあります 3 配 列 の 特 異 性 1: ターゲット 遺 伝 子 特 異 的 に 検 出 することができます H: 相 同 性 が 高 いmRNAからも 若 干 (10-15cycle のずれで) 増 幅 する 可 能 性 あり Applied Biosystems

61 複 数 のアッセイから 選 択 するときのポイント ~Assay IDでの 判 断 ~ 右 から2 番 目 のアルファベットが m のものを 選 択 genomic DNAからの 増 幅 を 考 慮 する 必 要 がありません 一 番 右 が 1 のものを 選 択 特 異 性 の 高 いセットを 選 択 番 号 が 大 きいものを 選 択 最 新 のデータベース 上 の 転 写 産 物 配 列 情 報 を 元 に 設 計 されているものを 選 択 注 記 : 上 記 は 目 安 です ターゲットとなる 配 列 情 報 も 併 せてご 判 断 いただくことをお 勧 めします Applied Biosystems

62 Pre-madeアッセイが 沢 山 ある 時 の 例 1 Assay IDの 数 字 が 一 番 大 きい 最 新 のアッセイ 対 象 となる 配 列 数 が 最 も 多 い 網 羅 的 に 検 出 することが 可 能 Applied Biosystems

63 Pre-madeアッセイが 沢 山 ある 時 の 例 2-a Assay IDの 数 字 が 一 番 大 きい 最 新 のアッセイ 対 象 となる 配 列 数 が 最 も 多 い 網 羅 的 に 検 出 することが 可 能 このように 最 新 のアッセイの 対 象 とする 配 列 数 が 多 くない 場 合 全 てのバリアントを 検 出 することができない 可 能 性 が 高 い Map Viewにて 対 象 となるExon 位 置 の 確 認 が 必 要 です Applied Biosystems

64 Pre-madeアッセイが 沢 山 ある 時 の 例 2-b Map View Hs _m1 : NM_016724のみ 検 出 可 能 Hs _m1 Hs _g1 Hs _g1 : 全 てのSplicing Variantの 検 出 可 能 しかし g なので genomic DNA 由 来 の 増 幅 の 可 能 性 あり Hs _m1 : HM_ 及 び NM_016730の2つのValiant のみ 検 出 可 能 Applied Biosystems

65 PreAmp Master Mix Applied Biosystems

66 TaqMan PreAmp Master Mix リアルタイムPCRに 用 いるcDNAを 増 幅 させる 試 薬 TaqMan Gene Expression Assays と 共 に 利 用 SYBRや 自 家 設 計 のPrimerは 非 対 応 最 大 100 遺 伝 子 までをマルチプッレクスPCRで 増 幅 その 後 希 釈 してリアルタイムPCRを 実 施 cdna 足 りていますか? 解 析 するべき 遺 伝 子 が 多 数 あるが cdnaが 足 りない 場 合 に 最 適 臨 床 検 体 レーザーマイクロダイセクションサンプル から 大 量 の 遺 伝 子 解 析 が 可 能 発 現 量 が 少 ない 遺 伝 子 の 増 幅 をさせるものではない Applied Biosystems

67 通 常 のリアルタイムPCR PreAmpを 用 いたリアルタイムPCR サンプル( 組 織 細 胞 ) RNA 抽 出 RNA 逆 転 写 反 応 (RT) cdna リアルタイムPCR(10ng/tube) 発 現 解 析 結 果 (1 遺 伝 子 ) サンプル( 組 織 細 胞 ) RNA 抽 出 RNA 逆 転 写 反 応 (RT) cdna PreAmp(10もしくは14サイクル (10ng/tube) 希 釈 (5 倍 もしくは20 倍 ) リアルタイムPCR 発 現 解 析 結 果 (50 遺 伝 子 もしくは200 遺 伝 子 解 析 ) Applied Biosystems

68 TaqMan PreAmp Master Mix 商 品 構 成 (1キットに2 種 類 の 試 薬 を 含 みます) Pre-PCRを 行 いマルチプレックスで 遺 伝 子 増 幅 増 幅 後 に 個 別 のリアルタイムPCRで 検 出 増 幅 させるサンプル 数 :40 検 体 通 常 のTaqMan Universal PCR Master Mix 付 属» 20μLの 反 応 系 (96Wellプレート)で500 反 応 分» 50μLの 反 応 系 (384Wellプレート)で200 反 応 分 Applied Biosystems

69 TaqMan PreAmp Master Mix cdna 足 りていますか? リアルタイムPCRの 場 合 は1サンプルあたり ngのcdnaが 必 要 サンプルが 微 量 な 場 合 は 解 析 できる 遺 伝 子 が 数 種 類 しか 出 来 ない cdnaが 少 ないので 2 遺 伝 子 しか 研 究 できない cdnaをpreampしたので 20 遺 伝 子 を 研 究 できる! Applied Biosystems

70 TaqMan PreAmp Master Mix 均 一 にバイアスをかけることなくマルチプレックスPCRを 行 う 最 大 100Plex までPre -PCR 反 応 する 事 ができる 10サイクル:およそ1,000 倍 50 反 応 14サイクル:およそ10,000 倍 200 反 応 RIN9.0 もRIN7.4 も 同 様 の 結 果 を 得 る デグラしたRNAでも 可 能 18s rrna を 含 むPrimer セットではマルチプレックス 不 可 3ng/well cdna で 測 定 時 にCtが35より 早 い 遺 伝 子 に 対 応 CDKN1B 遺 伝 子 をコントロールに 推 奨 Applied Biosystems

71 リアルタイムPCRに 用 いる 目 的 のサンプル 数 にあわせてPreAmp 試 薬 での 増 幅 サイクルを10サイクル もしくは14サイクルに 設 定 することにより 必 要 とする サンプル 数 に 対 応 した 溶 液 を 得 ることができます ( 下 図 参 照 ) スタート 時 の cdna 量 PreAmp 試 薬 での 増 幅 サイクル 数 PreAmp 後 の 希 釈 割 合 リアルタイムPCRに 利 用 できるサンプル 数 1-250ng 10 1: : 通 常 は10サイクルでのPre -PCRを 推 奨 Applied Biosystems

72 PreAmp 試 薬 を 用 いたサイトカイン 関 連 遺 伝 子 の 発 現 解 析 使 用 したサイトカイン 関 連 遺 伝 子 Assay 24 種 類 ( 右 表 参 照 ラボにあるストックを 利 用 ) 15 種 類 : 評 価 可 能 な 発 現 量 あり 9 種 類 : 今 回 用 いたサンプルでは 発 現 なし (Ctが35 以 降 で PreAmpの 評 価 の 対 象 外 ) 内 在 性 コントロール:CDKN1B 使 用 したサンプル(ラボにストックのあるcDNAを 利 用 ) Raji cdna (B-lymphocyte; Burkitt's lymphoma) Universal Human Reference cdna as Control. Total cdna amount: 810ng for No PreAmp Total cdna amount: 125ng for PreAmp Gene Expression CCR1 OK CCR2 OK CCR4 OK CCR5 OK CDK4 OK MDC OK TGF beta OK IFN ganma Not Expressed TNF alfa OK TNF beta Not Expressed MCP-1 OK CD23 OK CD25 Not Expressed CD69 OK IL-2 Not Expressed IL-3 Not Expressed IL-4 OK IL-5 Not Expressed IL-7 OK IL-10 OK IL-13 Not Expressed IL-17 Not Expressed IL-18 Not Expressed CDKN1B OK Applied Biosystems

73 PreAmp 試 薬 を 用 いたサイトカイン 関 連 遺 伝 子 の 発 現 解 析 (まとめ) PreAmp 前 PreAmp 後 平 均 Ct 値 平 均 Ct 値 平 均 Ct 値 の 差 分 遺 伝 子 No PreAmp PreAmp(No PreAmp) - (PreAm Applied Biosystems

74 PreAmp 試 薬 を 用 いたサイトカイン 関 連 遺 伝 子 の 発 現 解 析 (まとめ) y = x R 2 = Applied Biosystems

75 リアルタイムPCRでの RNAi 効 果 の 検 証 Applied Biosystems

76 リアルタイムPCRでのsiRNA 効 果 測 定 HPRT 遺 伝 子 の 発 現 量 未 処 理 sirna -HPRT s rrna 遺 伝 子 の 発 現 量 0.00 NC#1 sirna-hprt 未 処 理 sirna -HPRT sirna 処 理 でおよそ2サイクルの 変 化 あり 18s rrna で 発 現 比 較 を 行 ったところ およそ80%のKnock を 確 down 認 Applied Biosystems

77 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. TaqMan MicroRNA Assay: NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE A license to perform the 5' nuclease process for research requires the use of a Licensed 5' Nuclease Kit (containing Licensed Probe), or the combination of an Authorized 5' Nuclease Core Kit plus Licensed Probe, or license rights that may be purchased from Applied Biosystems. This product contains Licensed Probe. Its purchase price includes a limited, non-transferable immunity from suit under U.S. Patents Nos. 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930, 6,030,787, and 6,258,569, and corresponding patent claims outside the United States, owned by the Applera Corporation, and U.S. Patent No. 5,804,375 (claims 1-12 only) and corresponding patent claims outside the United States, owned by Roche Molecular Systems, Inc. or F. Hoffmann-La Roche Ltd ( Roche ), for using only this amount of probe in the practice of the 5 nuclease process solely for the purchaser s own internal research. This product is also a Licensed Probe for use with service sublicenses available from Applied Biosystems. This product conveys no rights under U.S. Patents Nos. 5,210,015 and 5,487,972, or corresponding patent claims outside the United States, which claim 5 nuclease processes, or under U.S. Patents Nos. 5,476,774 and 5,219,727, or corresponding patent claims outside the United States, which claim quantification methodology, expressly, by implication, or by estoppel. No right under any other patent claims (such as apparatus or system claims) and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is hereby granted expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses require a separate license from Roche. Notice to Purchaser: Disclaimer of License The TaqMan MicroRNA Assay is optimized for use in the polymerase chain reaction (PCR) covered by patents owned by Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffmann-La Roche Ltd. No license under these patents to use the PCR Process is conveyed expressly or by implication to the purchaser by the purchase of these products. A license to use the PCR Process for the purchaser's own internal research accompanies the purchase of certain Applied Biosystems reagents when used in conjunction with an authorized thermal cycler, or is available from Applied Biosystems. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Dr., Foster City, California 94404, USA. The SYBR Green dye is sold pursuant to a limited license from Molecular Probes, Inc. Applied Biosystems is a registered trademark and AB (Design) and Applera are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries. AmpliTaq Gold and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. SYBR is a register trademark of Molecular Probes, Inc. Copyright Applied Biosystems. All rights reserved Applied Biosystems