サイト毎に出現する DNA タイプを整理する また ミトコンドリア DNA より変異性が高いとされるマイクロサテライト DNA 遺伝子座を探索し ミトコンドリア DNA とマイクロサテライト DNA を併用することにより 精度の高い在来 非在来集団判別技術を開発する これらを統合して イワナ ヤマメ

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1 遺伝子データベースの構築によるイワナ ヤマメ アマゴ個体群の 在来 非在来判別技術の開発 水産総合研究センター中央水産研究所 要旨全国およびロシアの放流履歴のないイワナ集団 (189 集団 ) と全国および台湾からのサクラマス集団 (49 集団 ) から標本を収集し ミトコンドリア DNA の部分塩基配列を指標とした遺伝子解析を行った その結果 イワナでは 54 種類のハプロタイプが サクラマス類では 53 種類のハプロタイプがそれぞれ確認され DNA データベースとして蓄積した また 日高川水系に生息するアマゴ 15 集団からサンプルを収集し ミトコンドリア DNA とマイクロサテライト DNA を併用した遺伝子解析を実施し それぞれの集団について在来 非在来判別をおこなった 本州各地の飼育施設 ( 養鱒場等 ) で継代飼育されているイワナのミトコンドリア DNA を調べたところ 13 箇所の施設から 14 種類のハプロタイプが確認され 多様な系統が継代飼育に用いられている現状が明らかとされた 緒言イワナ ヤマメ アマゴなどの渓流魚は河川の上流部に生息するという生態特性から 河川間での交流が少なく 河川毎に独自の遺伝的構造をもつ場合が多い このような集団では それぞれ独自の進化プロセスを経ていると考えられ 進化的にも将来の遺伝資源としても貴重な存在といえる これまで イワナについてはミトコンドリア DNA を指標とした遺伝子解析が各地で行われ 河川毎の遺伝的特徴がある程度明らかにされている (Yamamoto et al. 2004; 北野他, 2006; Kubota et al. 2007; Kikko et al. 2008; 山本他, 2008; Sato et al. 2010) 1970 年代以降 本州に生息するイワナ ヤマメ アマゴ集団では 増殖の目的から各地で種苗放流が進み 在来集団のみが生息する河川は年々減少傾向にある 天然集団を保全 管理する目的からは 現存する在来集団の遺伝的構造を科学的な調査に基づき識別し 保全のための適切な地理的単位を急ぎ設定していく必要がある (Allendorf and Luikart 2007) このような保全単位は 今後における保全 管理施策の構築 ( たとえば集団間移殖 種苗放流の可否など ) のための重要な指針になるものと考えられる 本研究課題では イワナ ヤマメ アマゴ個体群の在来 非在来判別技術を開発する この目的のために 聞き取り調査などで放流履歴のない集団からサンプルを収集し ミトコンドリア DNA の塩基配列解析により 河川毎 河川内支流毎 あるいは 1

2 サイト毎に出現する DNA タイプを整理する また ミトコンドリア DNA より変異性が高いとされるマイクロサテライト DNA 遺伝子座を探索し ミトコンドリア DNA とマイクロサテライト DNA を併用することにより 精度の高い在来 非在来集団判別技術を開発する これらを統合して イワナ ヤマメ アマゴ集団について分布域を網羅する遺伝子データベースを構築し 渓流魚の保全 管理技術開発に資する保全の地理的単位を設計する 本年度では 以下の調査 実験をおこなう 1 イワナ サクラマスでは 全国各地から放流履歴のないサンプルを収集し ミトコンドリア DNA を指標とした解析をおこない DNA データベースに蓄積させる 2 アマゴ研究のモデル河川として設定している和歌山県日高川水系からサンプルを収集し マイクロサテライト DNA とミトコンドリア DNA を併用することにより 水系内支流間レベルでの在来 非在来判別技術を開発する 3 養鱒場等で継代飼育されているイワナのミトコンドリア DNA タイプを調べる 材料と方法 Ⅰ ミトコンドリア DNA による遺伝子データベースの構築 (1) イワナ今年度新規に分析をおこなった集団は 北海道二腰川 阿武隈川水系 3 集団 利根川水系湯西川 2 集団 信濃川水系 2 集団 木曽川水系 1 集団 天竜川水系 1 集団 富士川水系 12 集団 相模川水系 3 集団である すでにミトコンドリア DNA による分析がおこなわれている集団を併せると (Yamamoto et al. 2004; Kubota et al. 2007; 山本他, 2008) 本報告で扱った集団はロシアからの 17 集団 北海道からの 57 集団 本州からの 115 集団 合計 189 集団 3113 検体となる ( 表 1) 標本からの DNA は 99% エタノールで固定した供試魚のアブラビレから GenElute Mammalian Genomic DNA kit (Sigma 社, USA) または QIAGEN DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen 社 ) を用いて抽出した PCR 反応には L15285(5 -CCCTAACCCGVTTCTTYGC-3 Inoue et al. 2000) および H15915(5 -ACCTCCGATCTYCGGATTACAAGAC-3 Aoyama et al. 2000) のプライマーセットを使用し ExTaq ポリメラーゼ ( タカラバイオ社 東京 ) または AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Applied Biosystem 社 東京 ) を用いて 50 のアニーリング温度 40 サイクルの条件で増幅した PCR 産物の塩基配列の決定には ABI3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystem 社 USA) を用いた なお 検出された多くのハプロタイプは Yamamoto et al. (2004), Kubota et al. (2007), Kikko et al. (2008), 山本他 (2008) において既に報告されているため それぞれのハプロタイプ名はこれらの文献に準じるようにした 本研究で見出されたハプロタイプおよび既往文献により報告されているハプロタイプ 2

3 とを併せて,Arlequin ソフトウエア (Schneider et al. 2001) により最節約ネットワー クを構築し 日本およびロシア産イワナの遺伝的特徴を解析した 3

4 4

5 5

6 (2) サクラマスサクラマスについては本年度新たに北海道天塩川水系名寄川 1 集団 北海道大釜谷川 1 集団 青森県大畑川 1 集団 宮城県伊里前川 1 集団 鳥取県陸上川の 1 集団をサンプリングし 合計 49 集団 1231 個体を分析した ( 表 2) なお 大畑川産サクラマスと伊里前川産サクラマスは 青森県水産総合研究センターおよび宮城県水産技術総合センター内でそれぞれ継代飼育されている個体である サクラマス類のミトコンドリア DNA 分析では サイトクローム b 領域の部分塩基配列と ND-5 領域の部分塩基配列とを併せて解析をおこなった それぞれのプライマーセットは下記のとおりである Cytochrome-b 領域 cyto-f(5 -RACACGATTTTTCGCCTTTC-3 山本未発表 ) H15915(5 -ACCTCCGATCTYCGGATTACAAGAC-3 Aoyama et al. 2000) ND-5 領域 ND5-1F(5 -TACCCCAATTGCCCTGTACG-3 Kitanishi et al. 2007) ND5-3R(5 -CTAACACGTGGGTTAGGTCG-3 Kitanishi et al. 2007) PCR 反応には ExTaq ポリメラーゼ ( タカラバイオ社 東京 ) を用いて 55 のアニーリング温度 37 サイクルの条件で増幅した 6

7 Ⅱ アマゴモデル河川における在来 非在来判別分析 2008,2009,2010 年に和歌山県日高川水系の 15 集団でサンプルを収集し ミトコンドリア DNA とマイクロサテライト DNA を分析した ミトコンドリア DNA については サイトクローム b 領域の部分塩基配列 557bp を分析し マイクロサテライト DNA では 12 集団について 9 遺伝子座を分析し各個体の遺伝子型を決定した 今回アマゴで使用したマイクロサテライト DNA9 遺伝子座のプライマー配列を表 3 に示す マイクロサテライト DNA のデータについては プログラム Arlequin ver 3.01(Schneider et al. 2001) を用いて 遺伝子座毎 集団毎に対立遺伝子数 ヘテロ接合度 ハーディーワインベルグ平衡の検定結果をまとめた また 個体の遺伝子型の情報に基づくグループ分けをプログラム STRUCTURE ver 2.0 (Prichard et al. 2000) 7

8 を用いて推定した 解析では マイクロサテライト DNA 遺伝子座に基づく対立遺伝子頻度によって特徴づけられる K 個の任意交配集団を仮定し 個体を確率的に集団に割り当てていくとき データセットを最も良く説明する集団数 (K) を求めた K=1-10 に対してそれぞれマルコフ連鎖のモンテカルロシミュレーションを 10 回試行し 分集団 K を与えたときの個体の遺伝子型が生じる対数尤度を求め Evanno et al. (2005) に従い連続する対数尤度の変化量 ΔK が最大となる K を求めた Ⅲ 各地で継代飼育されているイワナのミトコンドリア DNA 分析 Kubota et al. (2007) により報告された各地の飼育施設において継代飼育されているイワナのミトコンドリア DNA タイプを整理するとともに 新たに山形県 兵庫県の飼育施設にて飼育されているイワナをサンプルし ミトコンドリア DNA サイトクローム b 領域の部分塩基配列 557bp を分析した 結果および考察 Ⅰ ミトコンドリア DNA による遺伝子データベースの構築 (1) イワナ収集した 3113 検体のイワナサンプルから 計 54 種類のハプロタイプが検出された これらのハプロタイプは 51 箇所の塩基置換によって識別され 転位型置換が 43 箇所 8

9 転換型置換が 8 箇所であった ( 図 1 表 1) これらのうち 最も高い頻度で出現するハ プロタイプは Hap-3 であり この遺伝子型はロシアから本州南部に至る広域に出現するものであった また ハプロタイプネットワーク全体はこのハプロタイプを中心とする星状樹形を形成した これら 54 種類のハプロタイプのうち北海道集団から見出されたハプロタイプは Hap-1 Hap-2 Hap-3 Hap-4 Hap-5 Hap-7 Hap-37 Hap-38 Hap-42 Hap-43 Hap-44 Hap-45 の 12 種類であった ロシア集団からは Hap-1 Hap-3 Hap-4 Hap-5 Hap-36 Hap-39 Hap-40 Hap-41 Hap-46 Hap-47 Hap-48 Hap-49 Hap-50 の 13 種類のハプロタイプが見出され そのうち北海道集団と共通して出現するハプロタイプは Hap-1 Hap-3 Hap-4 Hap-5 の 4 種類であった 本州の集団から確認されたハプロタイプは 9

10 Hap-1 Hap-3 Hap-5 Hap-6 Hap-7 Hap-8 Hap-9 Hap-10 Hap-11 Hap-12 Hap-13 Hap-14 Hap-15 Hap-16 Hap-17 Hap-18 Hap-19 Hap-20 Hap-21 Hap-22 Hap-23 Hap-24 Hap-25 Hap-26 Hap-27 Hap-28 Hap-29 Hap-30 Hap-35 Hap-45 Hap-51 Hap-52 Hap-55 Hap-new36 Hap-new39 Hap-new40 の 36 種類であり 北海道 ロシアを合わせたハプロタイプ数よりも多くの種類が確認された また 本州集団と北海道集団で共通して出現するハプロタイプは Hap-1 Hap-3 Hap-5 Hap-7 Hap-45 の 5 種類であった ハプロタイプネットワークにおける特徴的な DNA グループを挙げると 琵琶湖集団および琵琶湖周辺河川集団は Hap-17,18,19 を持つことで特徴づけられ 比較的高い遺伝的分化を遂げていた また 熊野川集団 木曽川水系の各集団 矢作川に分布するイワナは Hap を持つことで特徴づけられ やはり大きな遺伝的分化を示した 大井川に生息するイワナは Hap-23 Hap-24 Hap-25 Hap-26 をもち これらのハプロタイプはこれまでのところ他河川から確認されていない また 宮城県相川沢のイワナ集団は Hap-12 をもち このハプロタイプも他所からは確認されていない 今年度 新たに分析をおこなった集団において確認されたハプロタイプは 二腰川から Hap-3,Hap-4,Hap-38 阿武隈川水系 3 集団から Hap-3,Hap-45 富士川水系の 12 集団から Hap-1,Hap-3,Hap-55 相模川水系 2 集団から Hap-55 信濃川水系から Hap-1 木曽川水系から Hap-28 天竜川水系から Hap-22 天神川水系から Hap-20 がそれぞれ確認された (2) サクラマス類収集した 1231 個体のサクラマスサンプルから 計 53 種類のハプロタイプが検出された ( 図 2 表 2) 亜種毎にみていくと サクラマスからは Hap-1 Hap-2 Hap-3 Hap-4 Hap-5 Hap-6 Hap-7 Hap-8 Hap-9 Hap-10 Hap-11 Hap-12 Hap-13 Hap-14 Hap-15 Hap-16 Hap-25 Hap-26 Hap-27 Hap-29 Hap-32 Hap-33 Hap-36 Hap-37 Hap-39 Hap-40 Hap-42 Hap-43 Hap-44 Hap-45 Hap-46 Hap-51 Hap-53 Hap-55 Hap-64 の 35 種類 アマゴからは Hap-1 Hap-2 Hap-7 Hap-11 Hap-22 Hap-27 Hap-28 Hap-30 Hap-31 Hap-34 Hap-35 Hap-38 Hap-29 Hap-47 Hap-49 の 15 種類 ビワマスからは Hap-18 Hap-19 Hap-20 Hap-21 Hap-48 の 5 種類 サラマオマスからは Hap-52 の 1 種類が確認された 亜種間で重複して出現するハプロタイプは サクラマス アマゴ間で Hap-1 Hap-2 Hap-7 Hap-11 Hap-27 Hap-29 の 6 種類が確認された ビワマスから見出された 5 種類のハプロタイプはいずれも比較的近い遺伝的距離でグルーピングされるが 最も遺伝的距離の近いアマゴのハプロタイプ (Hap-33) とは 5 つの塩基置換が存在することから これらのハプロタイプはビワマス固有のハプ 10

11 ロタイプと考えられる サラマオマスから見出されたハプロタイプ (Hap-52) は 現在のところ台湾からのみ認められるが アマゴ サクラマスから見出される Hap-7 とは遺伝的距離が近いものであった 今回新たにサンプルした天塩川水系名寄川からは Hap-2 Hap-7 Hap-9 Hap-11 Hap-17 Hap-53 Hap-55 Hap-64 大釜谷川からは Hap-2 Hap-3 Hap-7 Hap-9 大畑川からは Hap-3 伊里前川からは Hap-7 Hap-36 陸上川からは Hap-2 Hap-27 が確認された これまで Hap-27 Hap-28 Hap-30 Hap-31 Hap-34 Hap-49 を含むグループは 天竜川から紀伊半島 四国に生息するアマゴ集団からのみ確認され これらのハプロタイプは西日本のアマゴを特徴づける DNA タイプであると考えられていた 今回 鳥取県の陸上川に生息するサクラマスから Hap-27 が新たに確認されたことから このハプロタイプはサクラマス アマゴ域に共通して出現するハプロタイプである可能性が示された ただし 現時点では移殖放流の可能性も否定できないため 今後は陸上川近隣の河川集団も分析に加える必要がある 11

12 Ⅱ アマゴモデル河川における集団遺伝解析和歌山県日高川水系の 15 集団において収集した標本を用いて ミトコンドリア DNA サイトクローム b 領域の分析をおこなったところ この水系では Hap-3 Hap-8 Hap-15 Hap-17 Hap-18 Hap-19 Hap-20 Hap-21 Hap-22 Hap-27 Hap-30 の 11 種類のハプロタイプが確認された ( 図 3 表 4) これらのうち 最も優占するハプロタイプは Hap-3 であり 寒川新行谷以外の全ての集団で認められた 調査をおこなった集団のうち 西ノ河では種苗放流がおこなわれた記録が残されており ( 和歌山県農林水産総合技術センター私信 ) ここでは 6 種類のハプロタイプが確認され多型的であった また 西ノ河で確認されたハプロタイプのうち Hap-15 Hap-20 Hap-22 は日高川水系の他の集団からは確認されておらず 他水系由来の個体が移殖された可能性が考えられる 12

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15 マイクロサテライト DNA9 遺伝子座を解析したところ 平均対立遺伝子数の範囲は となり 新行谷で最も低く 西ノ河で最も高かった ( 表 5) ヘテロ接合度の範囲は となり 新行谷で最も低く 立花川で最も高かった 西ノ河で対立遺伝子数が多いとする結果は ミトコンドリア DNA の結果と整合するものである プログラム STRUCTURE を用いて 個体の遺伝情報を基に分集団数を推定したところ 分集団数は K=3 で最も高いΔK が得られた ( 図 4) 各個体を事後確率の最も高いクラスターに割り当てたところ 北又谷では緑色の遺伝的要素をもつ個体が優占し 蟻合谷 新行谷では青色の遺伝要素を持つ個体が優占することが示された これら 3 河川で見出されるミトコンドリア DNA ハプロタイプは 北又谷では Hap-3 Hap-17 の 2 種類 蟻合谷では Hap-3 の単型 新行谷では Hap-21 の単型であり マイクロサテライト DNA の結果と同様に遺伝的変異が少ない したがって 聞き取り調査 ミトコンドリア DNA 15

16 マイクロサテライト DNA の結果を併せて これら 3 集団は放流履歴のない在来集団と判断される 一方 西ノ河集団では 3 つの遺伝的要素が混合するパターンが確認された ミトコンドリア DNA の結果とも併せて解釈すると この集団に放流魚が混じる可能性はきわめて高いと考えられる 同様に 初湯川本流集団および古川本流集団はマイクロサテライト DNA により 3 つの遺伝的要素が確認され これらの 2 集団についても放流魚が含まれる可能性がある Ⅲ 養鱒場などで継代飼育されたイワナのミトコンドリア DNA タイプ本州の渓流魚飼育施設 13 箇所において継代飼育されているイワナのミトコンドリア DNA のタイプを表 6にまとめた ハプロタイプの番号は表 1 図 1 と対応する 13 箇所の飼育施設から Hap-1 Hap-3 Hap-5 Hap-7 Hap-8 Hap-10 Hap-11 Hap-13 Hap-16 Hap-19 Hap-22 Hap-30 Hap-31 Hap-32 の 14 種類のハプロタイプが確認された これらのうち最も出現頻度の高いハプロタイプは Hap-7 であり 調べた 13 箇所の施設のうち 11 箇所で確認された 各飼育施設に多様なハプロタイプが確認され 複数の系統が継代飼育に使用されている現状がうかがえた 16

17 要約イワナに関して 北海道 本州を網羅するサンプリングをおこない 一部ロシアからの集団を加えて遺伝子解析をおこなった ミトコンドリア DNA サイトクローム b 領域の塩基配列を分析した結果 合計 54 種類の DNA タイプ ( ハプロタイプ ) を確認することができた これらのうち本州集団から見出されたハプロタイプは 36 種類であり 琵琶湖集団や熊野川 木曽川集団などいくつか特徴的なハプロタイプをもつ集団が特定された サクラマス類では 北海道 本州 四国 九州 台湾からの 49 集団をミトコンドリア DNA サイトクローム b 領域と ND-5 領域で分析した その結果 合計 53 種類のハプロタイプを確認することができた これらのうち サクラマスとアマゴの 2 亜種間で共通して出現するハプロタイプが 6 種類確認された ビワマスからは 5 種類のハプロタイプが確認されたが いずれの遺伝子型もビワマス特異的なものであった また 西日本太平洋側の河川に生息するアマゴ集団は いくつか特徴的なハプロタイプによってグルーピングされることがわかった 和歌山県日高川水系に生息するアマゴ 15 集団をミトコンドリア DNA と高感度マーカーであるマイクロサテライト DNA を用いて分析し それぞれの集団について在来 非在来の判別をおこなった 本課題でおこなったミトコンドリア DNA とマイクロサテライト DNA を併用する在来 非在来判別手法は 今後 移殖をおこなう際の意志決定や保全管理単位の設定などの遺伝的管理において応用が可能と考えられる 引用文献 Allendorf FW. Luikart G. (2007) Conservation and the genetics of popualations. Blackwell Publishing, USA. Aoyama J. Watanabe S. Ishikawa S. Nishida M. Tsukamoto K. (2000) Are morphological characters distinctive enough to discriminate between two species of freshwater eels, Anguilla celebesensis and A. interior? Ichthyological Research 47: Inoue JG. Miya M. Tsukamoto K. Nishida M. (2000) Complete mitochondrial DNA sequence of the Japanese sardine Sardinops melanostictus. Fisheries Science 66: Kikko T. Kuwahara M. K. Iguchi K. Kurumi S. Yamamoto S. Kai Y. Nakayama (2008) Mitochondrial DNA population structure of white-spotted charr (Salvelinus leucomaenis) in the Lake Biwa water system. Zoological Science 25:

18 Kitanishi S. Edo K. Yamamoto T. Azuma N. Hasegawa O. Higashi S (2007) Genetic structure of masu salmon (Oncorhynchus masou) populations in Hokkaido, northernmost Japan, inferred from mitochondrial DNA variation. Journal of Fish Biology 71 (Supple. C): 北野聡 岸元亮輔 中村慎 (2006) 治山堰堤が設置された東信地域の小渓流における魚類および両生類の生息状況. 長野県環境保全研究所研究報告 2: Kubota H. Doi T. Yamamoto S. Watanabe S. (2007) Genetic identification of native populations of fluvial white-spotted charr Salvelinus leucomaenis in the upper Tone River drainage. Fisheries Science 73: 野口大毅 池田実 中嶋正道 谷口順彦 (2003) サクラマス集団解析のためのマイクロサテライト DNA マーカーの開発とその特性について. 水産増殖 33: 野口大毅 谷口順彦 (2007) マイクロサテライト DNA マーカーによるサクラマスの遺伝的多様性と集団の遺伝的分化. 水産増殖 55: Olsen JB. Wenburg JK. Bentzen P. (1996) Semiautomated multilocus genotyping of Pacific salmon (Oncorhynchus spp.) using microsatellites. Molecular Marine Biology and Biotechnology 5: Olsen J. B. Wilson S. L. Kretschmer E. J. Jones K. C. Seeb J. E. (2000) Characterization of 14 tetranucleotide microsatellite loci derived from sockeye salmon. Molecular Ecology 9: O Reilly PT. Hamilton LC. McConnell SK. Wright JM. (1996) Rapid analysis of genetic variation in Atlantic salmon (Salmo salar) by PCR multiplexing of dinucleotide and tetranucleotide microsatellites. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 53: Palti Y. Fincham R. Rexroad III C. E. (2002) Characterization of 38 polymorphic microsatellite markers for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Molecular Ecology Notes 2: Pritchard JK. Stephens M. Donnelly P. (2000) Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics 155: Sato T. Demise T. Kubota H. Nagoshi M. Watanabe K. (2010) Hybridization, isolation, and low genetic diversity of Kirikuchi char, the southernmost populations of the genus Salvelinus. Transactions of the American Fisheries Society 139: Schneider S. Roessili D. Excoffier L.(2001) A Software for Population Genetics Data Analysis, ver Genetics and Biometry Laboratory, Department of 18

19 Anthropology, University of Geneva, Geneva. Yamamoto S. Morita S. Kitano S. Watanabe K. Koizumi I. Maekawa K. Takamura K. (2004) Phylogeography of white-spotted charr (Salevelinus leucomaenis) inferred from mitochondrial DNA sequences. Zoological Science 21: 山本祥一郎 中村智幸 久保田仁志 土居隆秀 北野聡 長谷川功 (2008) ミトコンドリア DNA 分析に基づく関東地方産イワナの遺伝的集団構造. 日本水産学会誌 74: