Comparison among treponema pallidum antibody assays Table 1 Test name RAIDIA Auto T LASAY auto TAb Accuras Auto TAb Mediace TLA Distributor FUJI Seike

技術論文 ラテックス凝集法によるリコンビナント抗原を用いた 梅毒 T 抗体試薬の検討 小林 一三 1) 和久井 萌 1) 1) 大阪赤十字病院臨床検査科部 53-8555 要 山本 裕之 1) 田崎亜矢子 1) 大阪府大阪市天王寺区筆ヶ崎町 5-30 旨 当院では ラテックス凝集法のメディエース TLA 極東製薬 を使用してきたが 偽陽性率が高く 乳びや溶血の影 響があった 3 社 富士レビオ デンカ生研 シノテスト のリコンビナント抗原を用いた T 抗体試薬を用いて測定を 行った結果 再現性 プロゾーン試験などで良好な結果であった 感度 特異度が高く 法に匹敵する特異度 を持っていた 菌体精製抗原を用いた T 抗体試薬にかわって リコンビナント抗原を用いた T 抗体試薬が使用される ことによって T 抗体中和試験や他法で確認する機会が減ることが期待される キーワード ラテックス凝集法 偽陽性率 リコンビナント抗原 菌体精製抗原 梅毒 T Treponema pallidum 抗体試薬は 原理 や使用する抗原が異なるものが多数発売されている まれている可能性がある 今回我々は リコンビナント抗原を用いた汎用機 1990 年に自動分析装置で測定可能なラテックス凝集 器用の T 抗体試薬を用いて測定を行い その有用 法による試薬の開発が報告され 最近では化学発 性について検討したので報告する 1) 光酵素免疫測定法やイムノクロマト法による試薬も 使用されている 2), 3) I 対象及び方法 当院では 2002 年よりラテックス凝集法のメディ エース TLA 極東製薬 以下極東 を使用してき 1 対象 たが 2011 年 9 月から 2012 年 11 月までの 1 年 3 ヶ 2012 年 2 月から 9 月の間に当院の梅毒検査で T 月間に提出された検体 18,690 件を調査した結果 T 抗体又は RR が判定保留もしくは陽性になった 128 抗体陽性率 2.% 偽陽性率 0.6%となり これは陽 例 無作為抽出検体 111 例 乳び検体 107 例 特異 性検体全体の 19.%が偽陽性を示すこととなり 中 性の検討のために自己免疫疾患検体など 9 例 関節 和試験が他の測定方法と不一致になる例も認められ リウマチ 19 例 全身性エリテマトーデス 6 例 原発 た さらに他施設の報告でも T 抗体陽性率 1.1 性胆汁性肝硬変 17 例 免疫グロブリン異常症など 7 1.% 偽陽性率 0.22%という報告もなされている 例 を対象とした これらについては ルーチン検 メディエース TLA は菌体成分を抽出精製した抗 査後に 80 で凍結保存した検体を融解し測定した ) 原を使用しており 菌体の様々な分子量の蛋白が含 まれている 菌体培養抗原を使用した場合に比べて 2 測定機器および試薬 機器は自動分析装置 BM800 日本電子 を用い リコンビナント抗原を使用した場合の方が特異性の た 評価対象の T 抗体測定試薬には ラテックス 高い反応になっているという報告があり 使用す 凝集法の A ラピディアオート T 富士レビオ 以 る培養抗原によっては T に特異的でない蛋白が含 下レビオ B LASAY オート TAb デンカ生研 5) 平成 25 年 10 月 7 日受付 平成 26 年 7 月 28 日受理 75 81

Comparison among treponema pallidum antibody assays Table 1 Test name RAIDIA Auto T LASAY auto TAb Accuras Auto TAb Mediace TLA Distributor FUJI Seiken -TEST Manufacturer SHIMA Laboratories SHIMA Laboratories -TEST SEKISUI MEDICAL recombinant antigens recombinant antigens recombinant antigens antigens prepared from purified bacterial cells TpN7, TpN15 17 TpN7, TpN15 17 TpN7, TpN17 T.U. less than 5 less than 10 less than 0.5 less than 10 T.U. Indeterminant less than 10 but 5 or more less than 20 but 10 or more less than 1.0 but 0.5 or more less than 20 T.U. but 10 T.U. or more 10 or more 20 or more 1.0 or more 20 T.U. or more Neutralization test 80% or more 70% or more 50% or more 10/2010 11/2010 8/2006 6/1993 Antigen Criteria Launch date T 抗体試薬の抗原や単位 判定基準などを比較したものを表にした Table 2 Within-run precision test (n = 20) Sample A Mean SD CV (%) Sample B 53.0 1.51 2.85 67.3 1.0 1.55 3.68 0.07 1.87 Between-run precision test (n = 5) Sample A Mean SD CV (%) Mean SD CV (%) 185.3 2.3 1.26 266.0 3.95 1.9 8.93 0.09 0.97 182.2 1.21 0.66 251.6.1 1.6 9.0 0.0 0.2 Sample B 50.6 1.2 2.81 60.2 2.10 3.8 3.73 0.0 0.99 Mean SD CV (%) 2 種類のプール血清を使って同時再現性と日差再現性を示した 以下デンカ C アキュラスオート T 抗体 シノ た 各社の測定単位は異なり 判定基準は添付文書 テスト 以下シノ と比較対照試薬として D メディ 通りとした なお極東は 極東推奨の判定保留域を エース TLA 極東 を用いた 梅毒検査陽性検体 設けたが 本検討ではすべての試薬について判定保 については ① 法 日本凍結乾燥研究 留を陽性として一致率を求めた Table 1 また 所 イムノクロマト法の② エスプライン T レ プロゾーンチェックは 各社推奨のパラメータを使 ビオ 粒子凝集法の③ セロディア-T A レビ 用した オ 以下 T-A 化学発光酵素免疫法の④ ルミパ ルスプレスト T レビオ 以下 L- T ⑤ ウ II 結 果 エスタンブロッティング法 MIKROGEN 以下 WB 法 ⑥ 極東 ⑦ デンカ ⑧ シノの中和試験及 1 同時再現性 び⑨ メディエース RR 極東 ⑩ ラピディア 2 濃度のプール血清を用いて 評価対象 3 試薬で オート RR レビオ ⑪ LASAY オート RR デ 20 回測定した 変動係数は 3%以内で良好であっ ンカ ⑫ RR テスト三光 エーディア を用い た Table 2 82 76

2 日差再現性 0.0 転倒混和及びキャリブレーションを行わず 5 日間測 定 し た 変 動 係 数 は % 以 内 で 良 好 で あ っ た Table 2 3 希釈直線性 直線性試料や陽性患者血清を生理食塩液で 1/10 倍から原液まで 1/10 倍きざみで希釈系列を作り測定 した Measured value 2 濃度のプール血清を用いて 評価対象 3 試薬で 30.0 first time second 20.0 10.0 レビオは 500 デンカは 500 まで直線 性が得られた シノは理論値 15 を超える濃度 0.0 から許容範囲より 10%以上はずれ 標準液の最高濃 0/10 2/10 度 20 まで直線性が得られなかった Figure 1 プロゾーン試験 /10 6/10 8/10 10/10 Dilution Ratio Figure 1 Lineality test 極東での測定値が 32,000 T.U.の検体を原液で測定 したところ レビオとデンカは若干の測定値の減少 シノの直線性を図示し 理論値 15 を超える濃度から許容範 囲より 10%を超え 標準液の最高濃度 20 まで直線性が得ら れなかったことを示した と は二重測定 が確認されたが 測定範囲である 500 以下ま で測定値が減少することはなかった シノは理論値 ビ リ ル ビ ン F 19. mg/ml ビ リ ル ビ ン C 20.3 20 30 を超える濃度からフック現象が生じた mg/ml 溶血ヘモグロビン 91 mg/ml 乳び 1,10 が 常にプロゾーンチェック機能により判別するこ FTU リウマトイド因子 110.0 I 自製溶血ヘモ とができた Figure 2 なお基準とした極東での本 グロビン 500 mg/ml まで検討した 3 試薬ともに検 試料の測定値は 29.9 T.U.を示し プロゾーンチェッ 討した濃度では影響がみられなかった なお基準とした極東は自製溶血ヘモグロビン 500 クが機能しなかった mg/ml で 59%の正誤差となった 干渉チェック A プラス及び干渉チェック RF シスメックス と自製溶血ヘモグロビンを用いて first second 0/10 1/10 2/10 3/10 /10 5/10 6/10 7/10 8/10 9/10 10/10-0.01 9.72 15.7 3.29 15.7 13.83 12.76 12.1 11.3 11.13 10.69-0.02 9.82 15.13 28.10 1.9 13.8 12.82 11.79 11.59 10.96 10.80 Error theoretical reduced value value 0.00 10.00 97.70 20.00 76.50 30.00 103.98 0.00 38.35 50.00 27.67 60.00 21.32 17.09 70.00 80.00 1.39 90.00 12.27 10.75 100.00 6 検出限界 2.6SD 法で 10 回測定し 0 濃度と区別できる調製 0.0 Measured value 5 共存物質の影響 30.0 20.0 10.0 rozone 0.0 0/10 2/10 /10 6/10 Dilution Ratio 8/10 10/10 Figure 2 rozone phenomenon シノはフック現象が生じたが 常にプロゾーンチェック機能により判別することができた プロゾーンチェック は 3/10 より機能した と は二重測定 77 83

Table 3 Concordance rate between test and,,, concordance rate 70/7 = 9.6% concordance rate 70 7 8/5 = 88.9% 6 8 5 concordance rate 76 52 128 118/128 = 92.2% concordance rate 72/76 = 9.7% concordance rate 72 76 8/52 = 92.3% 8 52 concordance rate 76 52 128 120/128 = 93.8% concordance rate 75/105 = 71.% concordance rate 75 30 105 22/23 = 95.7% 1 22 23 concordance rate = 5 or more = 0.5 or more = 10 or more = 10 T.U. or more 法とレビオ デンカ シノ 極東の一致率を求めた concordance rate 65/73 = 89.0% concordance rate 65 8 73 /55 = 80.0% 11 55 concordance rate 76 52 128 109/128 = 85.2% 76 128 97/128 = 75.8% 52 Table Concordance rate between and,, concordance rate 75/77 = 97.% concordance rate 75 2 77 176/211 = 83.% 35 176 211 concordance rate 110 178 288 251/288 = 87.2% concordance rate 7/76 = 97.% concordance rate 7 2 76 176/212 = 83.0% 36 176 212 concordance rate 110 178 288 250/288 = 86.8% concordance rate 75/79 = 9.9% concordance rate 75 79 17/209 = 83.3% 35 17 209 concordance rate 110 178 288 29/288 = 86.5% = 5 or more = 0.5 or more = 10 or more = 10 T.U. or more 極東とレビオ デンカ シノの一致率を求めた 試料の理論値を検出限界値とした 検出限界値はレ であり 基準とした極東は 79.7%であった また上 ビオとデンカは 3.0 シノは 0.2 であった 記 128 例に無作為抽出検体と自己免疫疾患検体など 7 法 イムノクロマト法 極東との比較 を加えた 288 例での極東との全体一致率はレビオ T 抗体又は RR が判定保留もしくは陽性になっ 87.2% デンカ 86.8% シノ 86.5%となり 参考まで た 128 例を用いて 法 イムノクロマト に T-A 86.8% L- T 85.1%であった 極東との 法 極東とリコンビナント 3 法を比較した FTA- 比較の表 Table を示す なお無作為抽出検体と ABS 法 と の 全 体 一 致 率 は レ ビ オ 92.2% デ ン カ 自己免疫疾患などの検体の偽陽性率に差は認めな 85.2% シノ 93.8%であった なお基準とした極東は かった 75.8%であった Table 3 イムノクロマト法との全 8 乳び検体の検討 体一致率はレビオ 93.0% デンカ 85.9% シノ 96.1% 8 78 ホルマジン濁度 700 1,130 FTU の中等度乳び 36

Table 5 No. False-positive cases only in diagnosis Anti-T antibody TA L- T Neutralization test result immunoch romato result 1 99.8 0.9 2.2 0.07 2 12.3 2.2 1.6 0.30 3 23.0 2.0 3.6 0.03 20.3 1.5 1.0 0.03 5 10.2 0.8 0.6 0.03 6 9.1 0.0 8. 0.0 7 2.6 2.5 2.2 0.01 8 16.9 0.8 0.7 0.02 9 535.3 1.0 1.3 0 10 19.9 0.5 2. 0.01 11 16.7 1.1 0.7 0.02 NT 12 38.6 0. 0.07 13 12.7 2.7 0.2 6 1 20.5 1. 1.9 0.02 0.2 15 33.3 0.2 1.1 0.03 16 12.9 1.6 0.01 17 13.1 0.3 0.5 0.30 18 19.5 0. 1.9 0.05 (+) 19 96.5 0.3 2 20 1.3 0.6 0.02 NT 21 95.9 3.1 2.9 0.03 10 T.U.or more 5 or more more L- T 1.0 or more NT not tested 極東のみが偽陽性になった 21 例を示した 10 or more 0.5 or 例では 社ともに全例が陰性であった 強乳び検体 これらについては 偽陽性は他法にて陰性である 71 例のうち極東は 30 例 シノは 23 例 デンカは 3 ことを確認し 偽陰性はすべて梅毒の既往であった 例が偽陽性 レビオは全例が陰性であった 極東のみ偽陽性の 21 例 Table 5 とそれ以外の偽 9 偽陽性と偽陰性 陽性と偽陰性の 23 例 Table 6 を示す 臨床症状 法や WB 法の結果等から梅 10 感度 特異度 毒 非梅毒と確定診断が可能であった 128 例につい 梅毒疾患と確定された患者 80 例を含む全対象症 て 各試薬の結果を比較すると 31 例が非梅毒のな 例 288 例を用いての感度 特異度は レビオは感度 かで偽陽性の結果となり 13 例が梅毒のなかで偽陰 92.5% 特異度 98.6% デンカは感度 85.0% 特異度 性の結果となった その内訳は 偽陽性 31 例につい 96.2% シノは感度 92.5% 特異度 98.1%であった ては極東で 30 例 レビオで 3 例 デンカで 7 例 シ Table 7 なお基準とした極東は感度 97.5% 特異 ノで 3 例であった 偽陰性 13 例については極東で 2 度 8.6%であった 例 レビオで 6 例 デンカで 11 例 シノで 例で あった なお偽陽性 偽陰性は重複する場合がある III 考 察 ので 合計数は一致しない また今回検討を行なっ た梅毒検査陰性例を含む全症例である 288 例での検 リコンビナント抗原を用いたラテックス凝集法に 討における偽陽性/陽性率は レビオ 3.9% デンカ よる T 抗体測定試薬であるレビオ デンカ シノ 10.5% シノ 5.1%であり 基準とした極東は 29.1% は シノの希釈直線性に問題はあるが 再現性 プ であった ロゾーン試験など基本性能に問題なく 臨床的にも 79 85

Table 6 False-positive and false-negative cases except for false-positive cases only in No. diagnosis Anti-T antibody WB WB WB immunochromato Neutralization test TA L- T result IgG IgM Tp7 Tp15 17 22 + 23.9.2 5.3 0.68 (+) 1. (+) anamnestic 7, 15, 17 + + + 100.0 23 + 19.0 7.9 6.8 0.35 (+) 1.8 (+) anamnestic 7, 15, 17 + + + 100.0 2 + 15.3 5.7 7.2 0.51 (+) 2.7 (+) anamnestic 7, 15, 17 7(?) + + + + 100.0 25 ± 19.6 15.5 7.5 0.5 1. (+) anamnestic 7 TmpA + + 100.0 26 ± 17.3 7.0 0.0 (+) 0. anamnestic 15 + + 100.0 27 ± 21.0 2.7 1. 0.77 2.2 (+) + + + 98.9 28 ± 8.6 21.1 28.2 1.90.8 (+) anamnestic 7, 15, 17, 257, 53 + + + + 29 ± 26.9 6.0 3.6 0.5 (+) 2.1 (+) + + NT + 100.0 30 ± 35. 6.3 0.9 0.63 1.0 (+) anamnestic 7, 17 + + + NT 31 ± 93.7 2..0 0.6 0.7 nonspecific TmpA, 53 + NT 18.0 32 ± 18.5 1.6 2.5 7 (±) 0.5 anamnestic TmpA, 15 + 100.0 33 ± 51. 7.6 9.3 1.01 2.0 (+) anamnestic 17, 257, 53 + + + 100.0 3 137.5 8.3 68.5 0.06 nonspecific 73 9.7 35 17. 0. 1 0.01 NT + 100.0 36 2.5 2.1 32.0 2.02 6. (+) anamnestic 17 + + + 37 2.3 0.6 22.2 3 NT + 55.2 38 16.2 3.8 6.3 0.5 0.7 anamnestic 15, 17 + + + 100.0 39 2.0 0. 5.2 0.6 negative NT 0 27.3 0.6 28.0 0.02 negative + 59.7 1 21. 296.8 580.3 nonspecific TmpA TmpA 2.8 2 21.7 13.3 8.5 1.76 16.8 3 63.1 6.2 28.2 0.01 negative 7.7 59.3 0.2 30.2 0.00 negative 0.2 :10 T.U. or more :5 or more :10 or more :0.5 or more L- T :1.0 or more WB7:TpN7 NT:not tested 極東のみが偽陽性になった例を除いた偽陽性と偽陰性の 23 例を示した. Table 7 Sensitivity Specificity 7 3 77 6 205 211 80 208 288 Sensitivity 7/80 = 92.5% Specificity 205/208 = 98.6% ostive likelihood ratio 6.13 False-negative rate 7.5% False-positive rate 1.% 68 8 76 12 200 212 80 208 288 Sensitivity 68/80 = 85.0% Specificity 200/208 = 96.2% likelihood ratio 22.10 False-negative rate 15.0% False-positive rate 3.8% 7 78 6 20 210 80 208 288 Sensitivity 7/80 = 92.5% Specificity 20/208 = 98.1% ostive likelihood ratio 8.9 False-negative rate 7.5% False-positive rate 1.9% 78 32 110 2 176 178 80 208 288 Sensitivity 78/80 = 97.5% Specificity 176/208 = 8.6% ostive likelihood ratio 6.3 False-negative rate 2.5% False-positive rate 15.% = :5 or more = :0.5 or more = :10 or more = :10 T.U. or more 各試薬の感度と特異度を示した. (86)750

感度と特異度が高く 日常検査において信頼性の高 陽性率は大幅に改善された い試薬であった 3 試薬を比較するとレビオとシノ 極東で T 抗体が陽性になった検体を中心とした の感度 特異度はデンカに比べて高く 直線性が良 対象例での比較であるので公平さには欠けるが 今 く 乳びの影響がないレビオが 1 番優れた試薬であっ 回の検討から極東の特異度は明らかに低いことが判 た なおリコンビナント抗原を用いた T 抗体試薬 明した に変更する際には 一部の梅毒既往患者が陰性にな ることや Table 6 の No. 36 検体のように TpN17 抗体 IV 結 語 のみ検出される場合は陽性になる場合があることな どを理解しておく必要がある 一方 従来法である極東は 菌体精製抗原を用い た試薬のため T 抗原の精製度合いが良くなければ リコンビナント抗原を用いた T 抗体試薬は 菌 体精製抗原を用いた T 抗体試薬と比べて偽陽性が 少なく 有用な試薬であることを確認した 培養動物由来の非特異反応が発生する可能性があ T 抗体試薬は メーカーごとに使用する抗原が異 り また T 抗体試薬と T 抗体中和試験に同じ抗原 なり リコンビナント抗原を使用した試薬でも使用 を使用した場合には T 抗体中和試験では抗原由来 抗原やその使用割合が異なり 反応条件等も異なる の非特異反応を回避できないという弱点をもつ さ また単位が同じでも判定基準が異なる等の問題があ らにプロゾーンチェックがかからず T 抗体価が低 る 今後は T 抗体試薬の単位を統一し リコンビ 値になっている場合は T 抗体中和試験は偽陰性と ナント抗原の種類や割合を同じにすることでどの試 なる危険性を有している そのため 極東で陽性に 薬を使用しても同じような値が出るように試薬メー なった場合は T 抗体中和試験のみならず イムノ カーの努力を期待したい クロマト法や 法等で確認する必要がある のが現状である そのほか 従来より乳び検体での 影響についても報告されており 6) 本検討でも強乳 び検体は レビオ以外の試薬での影響が認められた 今回の 288 例を用いた検討では極東の偽陽性 陽 性率は 29.1%であった 一方でレビオが 3.9% デン カが 10.5% シノが 5.1%となったことより リコン ビナント抗原を用いた 3 社の T 抗体試薬に変更す ることで T 抗体中和試験や他法で確認する機会が 減ると考える 当院では 現在レビオに試薬変更し たことで 2013 年 月から 201 年 月までの 1 年 1 ヶ月に提出された検体 17,599 件を調査した結果 T 抗体陽性率 1.5% 偽陽性率 0.05% 偽陽性 陽 文献 1) 松本美枝 石川文雄 ラテックス凝集反応による自動分析装 置用梅毒診断試薬 TLA の開発 臨床化学 1990 19 補 冊 2 111B. 2) 桜庭尚哉 他 ルミパルスプレスト T 改良試薬の評価 医 学と薬学 2007 58 785 792. 3) 大里和久 他 イムノクロマトグラフィー法による抗 T 抗 体迅速検出用試薬の基礎検討 医学と薬学 1998 39 1263 1269. ) 糸島浩一 他 自動分析装置用に適用可能な梅毒抗リン脂質 抗体測定用ラテックス試薬 メディエース RR と従来法と の比較について 医学検査 2011 60 112 119. 5) 山本克彦 抗体測定における非特異反応とその除去 臨床化 学 2000 29 補冊 2 55a. 6) 大竹皓子 可野象次郎 免疫学的測定法における干渉 検査 と技術 1997 25 207 213. 性率は 3.%となり 冒頭で述べた極東使用時より偽 751 87

Technical Article Evaluation of anti-treponema pallidum antibody reagents based on recombinant antigens by latex agglutination test Ichizou KOBAYASHI 1) Moe WAKUI 1) Hiroyuki YAMAMOTO 1) Ayako TASAKI 1) 1) Department of Clinical Laboratory, Osaka Red Cross Hospital (5-30, Fudegasaki-cho, Tennouji-ku, Osaka-shi, Osaka 53-8555, Japan) Summary Mediace TLA (Kyokuto harmaceutical Industrial Co., Ltd) has been used at our hospital as a diagnostic reagent for syphilis by the latex agglutination method. However, we often encountered high false-positivity rates owing to the influences of chyle and hemolysis. In this study, we evaluated anti-treponema pallidum antibody reagents based on recombinant antigens from three manufacturers (Fujirebio Inc., Seiken Co., Ltd., and Shino-Test Corporation). Good results were obtained in terms of reproducibility, prozone test, and other types of test. High sensitivity and specificity were obtained; in particular, the specificity was comparable to that obtained by the method. It is expected that the required frequency of confirmatory testing by the T antigen neutralization test and other methods will be reduced with the use of the anti-t. pallidum antibody reagents based on recombinant antigens in place of those based on antigens prepared from purified bacterial cells. Key words: latex agglutination test, false positive rate, recombinant antigen, antigen prepared from purified bacterial cell (Received: October 7, 2013; Accepted: July 28, 201) 88 752