Microsoft Word - C0100221生研遺伝子組換え実験プロトコール（H21年度

第 7 回 実 験 研 修 会 報 告 (2) 大 阪 府 高 等 学 校 生 物 教 育 研 究 会 誌,37,2009. 大 腸 菌 プラスミドベクターへの 遺 伝 子 導 入 実 験 プロトコール 1. 培 地 作 製 及 び 試 薬 の 調 整 実 験 に 先 立 ち 以 下 の 培 地 を 用 意 する 基 本 的 にはオートクレーブ 滅 菌 をし 抗 生 物 質 を 添 加 する 場 合 は 培 地 の 温 度 が 60 以 下 に 下 が ってから 入 れる (1) LB/アンピシリン 液 体 培 地 程 度 作 成 し 使 用 時 に 4mL ずつに 分 注 ( 容 器 は corning 社 の 10mL 滅 菌 遠 沈 管 を 使 用 ) 表 1 LB 及 び LB/アンピシリン 培 地 の 組 成 Bacto Tryptone Ampicilin(50mg/mL) 1mL (LB 培 地 では Ampicilin を 添 加 しない) (2) LB/アンピシリン 寒 天 培 地 程 度 作 成 し 10cm の 滅 菌 プラスチックシャ ーレに 約 20mL ずつ 分 注 する 室 温 で 水 平 に 静 置 して 培 地 が 寒 天 状 に 固 まるの を 待 つ 表 2 LB/アンピシリン 寒 天 培 地 の 組 成 Bacto Tryptone Ampicilin(50mg/mL) 1mL (3) SOC 液 体 培 地 100mL 程 度 作 成 する 60 以 下 に 冷 えた 滅 菌 済 み LB 液 体 培 地 に 対 して 1mol/L のグルコース を 20mL 加 えて 作 製 大 腸 菌 (Competent cell)への 形 質 転 換 溶 液 作 製 の 際 に 用 いる 表 3 SOC 液 体 培 地 の 組 成 Bacto Tryptone 1mol/L グルコース 20mL (4) 形 質 転 換 溶 液 Competent cell への Transformation 直 前 に 作 製 する 表 4 形 質 転 換 溶 液 の 組 成 1mol/LのMgCl 2 溶 液 100μL 1mol/LのMgSO 4 溶 液 100μL SOC 培 地 10mL (5) TE バッファー 溶 液 DNA 濃 度 を 測 定 する 際 に 用 いる 1mol/L の Tris-HCl と 0.5mol/L の EDTA 溶 液 を 作 り 混 合 後 希 釈 して 用 いる 250mL 程 度 作 製 する また 市 販 品 を 用 いても よい 表 5 1mol/LのTris-HCl 溶 液 の 組 成 30.3gトリス 30.3g 35% HCl 10mL 250mL トリス:トリスヒドロキシアミノメタン 表 6 TEバッファー 溶 液 の 組 成 1mol/L Tris-HCl 2mL 0.5mol/L EDTA 0.4mL 200mL (6) 50 倍 濃 度 TAE バッファー 溶 液 電 気 泳 動 とエチジウムブロマイド 染 色 の 際 に 50 倍 に 希 釈 して 使 用 する 50 倍 希 釈 の TAE バッファー 溶 液 は2L 程 度 作 製 ( 電 気 泳 動 槽 1 台 あたり 500mL エチジウムブロマ イド 染 色 に 500mL 必 要 ) 市 販 品 を 用 いてもよい 1

表 7 50 倍 濃 度 TAEバッファー 溶 液 の 組 成 トリスヒドロキシアミノメタン 60.5g 氷 酢 酸 14.3mL 0.5mol/L EDTA 25mL 200mL (7) 電 気 泳 動 用 0.7%アガロースゲル 電 気 泳 動 の 際 にTAEバッファーを 用 いて0.7% 濃 度 のアガロースゲルを 作 製 する 表 8 0.7%アガロースゲルの 組 成 アガロース 1.4g 50 倍 希 釈 TAEバッファー 200mL (8) 10μg/mL エチジウムブロマイド 溶 液 電 気 泳 動 後 のアガロースゲルを 染 色 する 際 に 用 いる 使 用 の 際 は 300mL の TAE バッファー 溶 液 に 対 して 30μL 添 加 する 発 癌 性 があるので マスクとゴム 手 袋 などを 用 意 して 取 り 扱 いには 注 意 する 表 9 10μg/mLエチジウムブロマイド 溶 液 エチジウムブロマイド 2g 50 倍 希 釈 TAEバッファー 200mL (9) その 他 (エタノール 沈 殿 用 ) 試 薬 類 100%エタノール 10mL 70%エタノール 10mL 3mol/L 酢 酸 ナトリウム 10mL 10mg/mL グリコーゲン 10mL 2. 購 入 すべきベクターや 酵 素 類 キット (1) ベクターと 大 腸 菌 (Conpetent cell) PcDNA3.1(+) Invitrogen V79020 E. coli DH5α Competent Cells タカラバイオ TKR9057 DNA Loading Buffer 和 光 純 薬 ニッポンジーン 313-90111 10mL TAE Buffer ( 50X ) コスモバイオ DCB 423499 500mL TE Buffer (100X) コスモバイオ NDS EC862 25mL 3. 装 置 と 器 具 類 振 盪 培 養 器 ウオーターバス エッペンドルフチューブ 用 冷 却 超 遠 心 機 小 型 卓 上 紫 外 線 照 射 装 置 (UV イルミネーター) 電 気 泳 動 装 置 Mupid-2puls ADVANCE M-2P 電 気 泳 動 ゲルメーカーセット-HR ADVANCE GM-HR 可 視 紫 外 分 光 光 度 計 ピペットマン 0.1~2.0 L GILSON 社 P-2 ピペットマン ~200 L GILSON 社 P-200 ピペットマン ~1000 L GILSON 社 P-1000 ダイヤモンドチップ ~10 L 用 DIAMOND D10 ダイヤモンドチップ~200 L 用 DIAMOND D200 ダイヤモンドチップ 1000 L 用 DIAMOND D1000 ボルテックス ミキサー VORTEX-GENIE 2 Mixer 1.5mL エッペンドルフチューブ 15mL Corning プラスチック 遠 心 チューブ 50mL Corning プラスチック 遠 心 チューブ 20mL プラスチックピペット エタノール 消 毒 用 霧 吹 き 紫 外 線 保 護 メガネ アルミホイル エッペンドルフチューブ 立 て( 水 に 浮 くもの) 遠 心 チューブ 立 て つまようじ 又 はループ スプレッダー ディスポーザブル 手 袋 (2) 制 限 酵 素 EcoR I タカラバイオ TKR1040A 10,000U BamH I タカラバイオ TKR1010A 10,000U (3) キット 類 調 製 済 み 試 薬 類 DNA Ligation kit Ver2.1 タカラバイオ TKR6022 QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106 500 bp Molecular Ruler BioRad 170-8203 2

4. 実 験 プロトコール <1 日 目 > (1) pcdna3.1 の 制 限 酵 素 EcoR I による 処 理 pcdna3.1 1μL EcoR I 0.3μL BamH1 0.3μL 10 制 限 酵 素 (KBuffer) 1μL 滅 菌 7.4μL (total 10μL) 37 で 2 時 間 反 応 させる エタノール 沈 殿 DNA 溶 液 (10μL) 100%エタノール(25μL) 3M 酢 酸 ナトリウム(4μL) 10mg/mL グリコーゲン(1 μl)を 加 える これらをボルテックス 攪 拌 機 で 強 く 混 ぜ た 後 室 温 で 10 分 静 置 し た 後 10,000rpm 10 分 間 遠 心 し 液 体 を 捨 てる その 後 70%エタノールを 1mL 加 え 軽 く 容 器 を 振 り 10,000rpm 2 分 間 遠 心 容 器 を 逆 さまに して 十 分 に 水 分 を 取 り 除 く (2) 制 限 酵 素 で 切 断 したプラスミドに 目 的 の DNA を Ligation プラスミド: 導 入 遺 伝 子 溶 液 (EGFP 190μg/μL) 3 μl (プラスミドと 導 入 遺 伝 子 のグラム 比 が 1:3~ 10 になるようにする ) Ligation bufferdna 液 と 同 量 3 μl (Takara DNA ligation Kit ver2.1) 16 で 30 分 間 反 応 (3) Competent cell へ の プ ラ ス ミ ド の Transformation SOC 培 地 を 37 に 加 熱 する 約 100μL に 分 注 され-80 で 凍 結 保 存 された Competent cell を 氷 上 で 溶 かす 溶 けたCompetent cell をプラスミドDNA に 加 え ゆっくりピペットで 混 合 する 15 分 間 氷 上 で 静 置 する 42 の 恒 温 槽 で 45 秒 間 プラスミド DNA を 加 え た Competent cell を 軽 く 振 りながら 加 熱 する(ヒ ートショック) 氷 上 に 2 分 間 Competent cell を 静 置 する この 間 に SOC 培 地 に 10ml あたり 1M MgCl 2 100 μl 1M MgSO 4 100μL を 加 える SOC 培 地 を 1ml Competent cell に 加 えチュー ブを 振 って 混 ぜる (4) Competent cell の LB 培 地 シャーレへの 塗 布 ガスバーナーの 炎 の 下 で スプレッダーを 用 い て 抗 生 物 質 の 入 った LB プレートに Competent cell を 均 等 になるように 塗 り 付 ける (5) 培 養 37 にて 8~16 時 間 培 養 する <2 日 目 > (1) 大 腸 菌 コロニーの 採 取 LB 培 地 シャーレから 大 腸 菌 コロニーを 滅 菌 し た 爪 楊 枝 で 採 取 し LB 培 養 液 に 入 れる (2) LB 培 養 液 で 大 腸 菌 を 振 盪 培 養 遠 沈 管 のふたをはずし パラフィルムで 管 口 を おおう ガス 交 換 ができるように パラフィルム に 爪 楊 枝 で5~6 箇 所 穴 をあけておく 37 8~16 時 間 振 盪 培 養 する <3 日 目 > (1) アガロースゲル(0.7%)の 作 成 TAE 溶 液 (Tris-Acetate-EDTA 溶 液 )200ml を 三 角 フラスコに 入 れ アガロース 1.4 g を 加 える サランラップで 三 角 フラスコの 入 り 口 を 覆 い 電 子 レンジで 軽 く 沸 騰 させる 手 で 触 れる 程 度 に 温 度 が 下 がったら ゲル 作 成 器 に 流 し 込 み コームを 立 てる (2) 大 腸 菌 からプラスミドを 精 製 (QIAGEN 社 QIAprep Spin Miniprep kit を 使 用 ) 15ml チューブ 内 の 大 腸 菌 を 培 養 した LB 培 養 液 4ml のうち 1ml を 1.5ml 遠 心 チューブに 移 す 4 5000rpm で 5 分 間 遠 心 する(この 遠 心 分 離 により 大 腸 菌 が 沈 殿 する) 上 清 の 液 体 を 1000μL マイクロピペットで 吸 引 3

し 捨 てる プラスミド 精 製 キットの P1 液 250μL を 加 え 沈 殿 した 大 腸 菌 を 溶 解 する プラスミド 精 製 キットの P2 液 250μL を 加 え チューブを 5~6 回 反 転 させ 混 ぜる プラスミド 精 製 キットの P3 液 350μL マイク ロピペットで 十 分 に 混 ぜ さらにチューブを 5~6 回 反 転 させる 白 濁 した 浮 遊 物 を 遠 心 分 離 機 で 4 10,000rpm 10 分 遠 心 し 上 清 をカラムに 通 し プラスミド を 付 着 させる 1000μL マイクロピペットを 用 いて 上 清 の 液 体 を QIA Prep カラムに 移 す QIA Prep カラムの 下 のチューブに 溜 まった 液 体 を 捨 てる 再 度 遠 心 分 離 機 で 4 10,000rpm 1 分 間 遠 心 する プラスミド 精 製 キットの PB 溶 液 500μL を QIA Prep カラムに 加 える 遠 心 分 離 機 で 4 10,000rpm 1 分 間 遠 心 する QIA Prep カラムの 下 のチューブに 溜 まった 液 体 を 捨 てる プラスミド 精 製 キットの PE 溶 液 750μL を QIA Prep カラムに 加 える QIA Prep カラムを 1.5ml 遠 心 チューブの 上 に 置 き プラスミド 精 製 キットの EB 溶 液 100 μl をカ ラムの 中 央 に 加 える 1 分 間 静 置 する エタノール 沈 殿 カラムの 下 の 1.5ml 遠 心 チューブに 3M 酢 酸 ナ トリウム10μL と 100%エタノール250μL を 加 え ボルテックス 攪 拌 機 で 強 く 混 ぜる (10mg/mlグリコーゲンを1μLを 加 えると 沈 殿 が 見 えやすくなる ) 室 温 で 10 分 静 置 した 後 4 10,000rpm 10 分 間 遠 心 し 液 体 を 捨 てる 70%エタノールを 1ml 加 え 軽 く 容 器 を 振 り 10,000rpm 2 分 間 遠 心 する 容 器 を 逆 さまにして 十 分 に 水 分 を 取 り 除 く(10 ~15 分 ) TE 溶 液 30μL で DNA を 溶 かす (3) 採 取 したプラスミドの 制 限 酵 素 EcoR I による 処 理 DNA 液 8.8μL EcoR I 0.2μL 10 制 限 酵 素 Buffer 1μL (total 10μL) 37 で 60 分 間 反 応 させる (4) アガロースゲルで 電 気 泳 動 制 限 酵 素 で 処 理 した DNA 液 10μL を 約 1.5μL の Loading Buffer とピペットで 混 濁 させる 先 に 作 成 したアガロースゲルを 電 気 泳 動 槽 (ミ ューピット)にいれ TAE 溶 液 を 十 分 にいれ ゲ ルの 穴 にLoading Buffer を 添 加 したDNA 液 を 注 入 する 外 側 の 穴 には 分 子 量 マーカーを 注 入 する 30~40 分 電 気 泳 動 する (5) 紫 外 線 でゲルを 観 察 し 目 的 の DNA がプラス ミドに 組 み 込 まれているかを 確 認 エチジウムブロマイド2gをTAE 溶 液 200mlに 加 え 10μg/ml 溶 液 を 作 り そのうち 30μL を TAE 溶 液 300ml に 入 れて 30 分 間 振 盪 し アガロース ゲルを 染 色 する 4

紫 外 線 イルミネーター(312nm)の 上 にサランラ ップを 敷 き ゲルを 載 せ DNA の 発 光 を 観 察 する pcdna3.1 は 約 4,500bp EGFP は 約 700bp である うまく 遺 伝 子 導 入 できていれば 2 本 のバンドが 確 認 される (6) DNA 濃 度 の 測 定 3 日 目 の 実 験 で 大 腸 菌 からプラスミドを 精 製 した 際 などに 調 べてみるとよい 目 的 の DNA 溶 液 1μL を TE 溶 液 (Tris-EDTA 溶 液 )99μL に 加 え 100 倍 に 希 釈 分 光 光 度 計 260nm で 吸 光 度 を 測 定 同 時 に 280nm の 吸 光 度 も 測 定 し DNA の 純 度 を 確 認 する 260nm の 吸 光 度 5 を 計 算 する これが 希 釈 率 100 倍 のときの DNA 濃 度 (μg/μl) 260nm の 吸 光 度 の 値 を 280nm 吸 光 度 で 割 る きち んと DNA が 取 れていれば この 値 が 1.8~2.0 なら ば DNA の 純 度 は 正 常 それ 以 下 ならタンパク 質 が 混 入 している 可 能 性 がある のコンタミネーションの 有 無 などを 考 えて 適 切 に 処 理 するか 処 理 が 困 難 な 場 合 は 業 者 委 託 まで 保 管 する 大 腸 菌 プラスミドベクターへの 遺 伝 子 導 入 実 験 プロトコール は 東 京 大 学 環 境 安 全 研 究 セン ターの 刈 間 理 介 先 生 が JST 支 援 の 理 数 系 教 員 指 導 力 向 上 研 修 のために 作 成 されました このプロトコールを 大 阪 府 高 等 学 校 生 物 教 育 研 究 会 会 誌 原 稿 用 に 一 部 改 変 して 掲 載 させて 頂 きま した 5. 実 習 を 安 全 に 行 うために (1) 試 薬 が 肌 に 接 触 したり 眼 に 入 らないように 保 護 メガネを 着 用! 手 袋 を 着 用! 実 験 着 を 着 用! が 原 則 特 に 水 酸 化 ナトリウム(QIAprep Spin Miniprep kit の P1 液 ) 今 回 は 使 わなかったがタンパク 質 を 変 性 させる フェノール クロロフォルム 溶 液 は 危 険 であるので 保 護 メガネを 着 用 する (2) 紫 外 線 は 眼 の 炎 症 を 起 こすため 紫 外 線 イル ミネーターを 使 用 する 際 は 紫 外 線 カットの 保 護 メガネを 着 用! (3) 実 習 に 用 いる 大 腸 菌 ベクターなどは 安 全 な ものであるが 微 生 物 実 験 の 基 本 である 感 染 防 止 の 観 点 から マスクの 着 用! 手 洗 いの 励 行 と 消 毒! 飲 食 厳 禁! (4) 化 学 物 質 には 未 知 の 危 険 性 があると 考 え 試 薬 の 取 り 扱 いは 慎 重 に 特 にエチジウムブロマイ ドのように 発 癌 性 が 指 摘 されている 試 薬 は 細 心 の 注 意 を 持 って 取 り 扱 うこと (5) 実 験 終 了 後 の 組 換 え 体 などは 自 然 界 への 拡 散 防 止 の 観 点 から オートクレーブ 滅 菌 (121 15 分 間 )が 原 則 実 験 器 具 等 でオートクレーブ 滅 菌 が 困 難 なものは 70%エタノールや 塩 素 剤 ( 次 亜 塩 素 酸 ナトリウム 溶 液 )で 滅 菌 する (6) 実 験 に 用 いた 試 薬 類 は 試 薬 の 性 質 微 生 物 5