糖 質 のUPLC-MS 分 析 Kenneth J. Fountain, Chris Hudella, Doug McCabe, Damian Morrison 緒 言 糖 質 は 自 然 界 に 最 も 豊 富 に 存 在 する 有 機 化 合 物 で 多 くの 生 物 学 的 プロセスにおいて 重 要 な 役 割 を 果 たします 植 物 および 動 物 体 の 構 成 成 分 としてだけでなく 多 くの 生 物 体 細 胞 へのエネルギーの 貯 蔵 と 運 搬 にも 使 用 されます ESI-MSにアミドカラムを 用 いたHILICモードを 組 み 合 わせることで 食 品 中 のアミノ 酸 ペプチド 複 合 糖 質 有 機 酸 を 誘 導 体 化 なしに 十 分 に 分 析 することができています 5 これらの 分 離 は 比 較 的 大 きい 粒 子 径 5μmのカラムを 用 いて 行 われており 分 析 時 間 は100 分 以 上 かかっています 糖 質 という 用 語 は 単 糖 類 二 糖 類 オリゴ 糖 類 (3-10の 単 糖 が 結 合 ) 多 糖 類 ( 何 千 もの 単 糖 が 結 合 したものにまで 及 ぶ)を 指 してい ます 各 単 糖 ( 例 えばフルクトース グルコース ガラクトース)の 異 性 体 の 数 は 炭 素 数 に 従 って 多 くなります オリゴ 糖 類 と 多 糖 類 など 複 雑 な 糖 質 では 異 性 体 の 分 離 はより 困 難 になります 本 アプリケーションノートでは 様 々なサンプルマトリックス 中 の 単 糖 類 および 複 雑 な 糖 質 をUPLC-MSを 用 いて 誘 導 体 化 なしに 迅 速 に 分 析 しています ACQUITY UPLC BEH Amideカラムの 耐 久 性 により 誘 導 体 化 金 属 錯 化 剤 ポストカラム 添 加 なしにクロマトグラフィー 分 離 を 向 上 しMSシグナルを 増 強 する 高 ph 移 動 相 を 使 用 できます 糖 質 は 通 常 アミノまたはポリアミンカラムをHILICモードで 使 用 して 分 離 し UV 吸 収 が 弱 いため 示 差 屈 折 計 (RI)で 検 出 します しかしながら これらの 技 術 には 塩 による 妨 害 アノマー 変 旋 光 やグラジエント 分 離 を 行 えないなどの 問 題 があります さらに アミノカラムやポリアミンカラムで は 還 元 糖 (グルコース マルトース ラクトース)はシッフ 塩 基 やエナミンを 形 成 しカラムに 吸 着 するため 結 果 としてカラム 寿 命 が 低 減 します また イオン 交 換 クロマトグラフィーを 用 いた 技 術 は 高 塩 濃 度 のバッファを 使 用 するためMS 検 出 には 適 していません 質 量 分 析 法 は 蒸 発 光 散 乱 (ELS) 検 出 の 約 10 倍 RI 検 出 の 約 100 倍 の 感 度 があるため 糖 質 を 検 出 するのに 適 した 技 術 です プロテオミクスと バイオ 医 薬 品 の 分 野 以 外 では 糖 質 の 分 析 にMS 検 出 を 使 用 した 報 告 は 少 ししかありません 2 件 はフローインジェクション(FIA)を 用 いて MS 装 置 に 注 入 した 報 告 1,2 で 1 件 はNMRとESI-MSの 錯 化 剤 として 移 動 相 にルビジウムを 用 いた 報 告 3 です ICP-MSとESI-MSもグルコース スクロース フルクトースのフラグメンテー MSもグルコ スクロ ス スのフラグメンテ ションの 研 究 に 使 用 されています 4 FIAではクロマトグラフィー 分 離 が ないためマトリックスの 妨 害 により 異 性 体 の 分 離 や 正 確 な 定 量 ができま せん 移 動 相 への 金 属 錯 化 剤 の 使 用 またはMS 検 出 前 のポストカラム でのイオン 化 剤 添 加 も 分 析 を 複 雑 にしMSのイオン 源 を 汚 染 します 実 験 方 法 装 置 データシステム カラム 弱 洗 浄 溶 媒 強 洗 浄 溶 媒 シール 洗 浄 注 入 モード : Waters ACQUITY UPLC systems with ACQUITY SQD : MassLynx version 4.1 : ACQUITY UPLC BEH Amide, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm (P/N 186004800), 2.1 x 100 mm, 1.7 μm (P/N 186004801), or 2.1 x 150 mm, 1.7 μm (P/N 186004802) : 75/25 CAN/H 2 O (500 μl) : 20/30 CAN/H 2 O (800 μl) : 50/50 ACN/H 2 O : Partial loop with needle overfill (PLNO) 移 動 相 流 速 グラジエント 条 件 カラム 温 度 注 入 量 は 図 の 説 明 に 記 載 した 通 りです 1
MS 条 件 イオン 化 モード キャピラリー 電 圧 コーン 電 圧 ソース 温 度 脱 溶 媒 温 度 脱 溶 媒 ガス コーンガス デュエルタイム SIR m/z :ES- : 2.8 kv : 25 V : 120 : 350 : 500 L/hr : 50 L/hr : 40 or 80 ms : 179.2 (fructose, glucose) 341.3 (sucrose, maltose, lactose) 503.4, 665.5, 827.6, 989.7, 1151.8 (maltooligosaccharides n=1 to 5) 121.1 (erythritol), 803.8 (stevioside), 950.1 (rebaudioside C), 966.1 (rebaudioside A) 塩 基 性 移 動 相 モディファイアを 使 用 すると アノマーが 分 離 せずに 1つのピークに 溶 出 して 糖 質 のイオン 化 効 率 が 向 上 します この 条 件 ではよりシンプルなクロマトが 得 られるためより 正 確 な 糖 質 の 同 定 と 定 量 が 可 能 になります また ph 上 昇 により 全 ての 糖 の 保 持 が 向 上 します サンプル 前 処 理 食 品 糖 のスタンダード(フルクトース グルコース スクロース マルトース ラクトース)は50/50 ACN/ H 2 O 溶 液 に 溶 かして10μg/mLに 調 製 し ました その 他 スタンダードは50/50 ACN/ H 2 O 溶 液 に 溶 かして 指 定 の 濃 度 に 調 製 しました ビールサンプルは50/50 ACN/ H 2 Oで1:1に 希 釈 して 調 製 しました 天 然 甘 味 料 の 粉 末 は50/50 ACN/ H 2 Oに 溶 解 し メープルシロップサンプルは50/50 ACN/ H 2 Oに 溶 解 して 濃 度 0.5から 1mg/mLに 調 製 しました 全 てのサンプルは0.45μm PVDFシリンジ フィルターを 用 いてろ 過 しました 結 果 と 考 察 溶 液 中 で 還 元 糖 は 環 状 糖 がαおよびβアノマー 構 造 で 平 衡 状 態 に 達 し 変 旋 光 を 示 します 糖 によっては 一 定 の 条 件 下 でこれらアノマーが 分 離 するため 1つの 糖 質 に 対 して2つのピークが 存 在 し 同 定 および 定 量 が 難 しくなります 図 1では 酸 性 条 件 下 および 添 加 剤 を 使 用 しない 条 件 下 ではスタンダード 混 合 物 中 還 元 糖 のアノマーが 明 らかに 存 在 し 5 種 類 の 食 品 糖 のベースライン 分 離 が 達 成 できていません 図 1 ギ 酸 添 加 モディファイア 無 添 加 アンモニア 添 加 の75/25 ACN/H 2 O 移 動 相 を 用 いた 糖 質 のUPLC-MS 分 析 流 速 :0.13mL/min カラム 温 度 :35 注 入 量 :0.7μL 各 分 析 種 の 濃 度 は10μg/mL in 50/50 ACN/H 2 O カラムサイズは2.1 50mm, 1.7μm ピーク:(1) fructose (2) glucose (3) sucrose (4) maltose (5) lactose アセトニトリルの 代 わりにアセトンを 有 機 溶 媒 として 使 用 した 場 合 にも 同 じ 糖 質 のスタンダード 混 合 物 で 同 様 の 分 離 が 達 成 されました( 図 2) 予 測 どおりカラムが 長 くなると 分 離 度 も 向 上 しました 代 替 溶 媒 が 使 用 できることは2008 年 度 末 からのアセトニトリルの 不 足 のような 事 態 の 際 に も 重 要 で UPLC-MSによる 糖 質 の 分 析 においての 代 替 案 となります アミノベースのカラムとは 異 なりシッフ 塩 基 を 形 成 しないため 温 度 を 上 昇 させることでアノマーを1つのピークに 溶 出 しかつ 全 体 の 分 離 向 上 を 促 進 することが 可 能 です 図 2に 示 した 高 温 高 ph 条 件 下 でも ACQUITY UPLC BEH Amideカラムは 耐 久 性 が 高 く 糖 質 の 保 持 時 間 の 低 減 は 最 小 限 で2000 回 以 上 ( 連 続 的 な 試 験 で8 日 間 )のイン ジェクションが 可 能 です(データは 記 載 していません) 2
図 2 有 機 溶 媒 としてアセトンを 使 用 した 糖 質 のUPLC-MS 分 析 アイソクラティック 移 動 相 : 77/23 アセトン/H 2 O with 0.05% NH 4 OH 流 速 :0.13mL/min カラム 温 度 :85 カラムサイズおよび 注 入 量 は 図 に 記 載 サンプルおよびピーク 溶 出 順 序 は 図 1と 同 じ 図 3 単 糖 二 糖 オリゴ 糖 類 のUPLC-MS 分 離 移 動 相 A:80/20 ACN/H 2 O with 0.1% NH 4 OH 移 動 相 B: 30/70 ACN/H 2 O with 0.1% NH 4 OH グラジエント:0-60%B (5 分 間 ) 0%に 戻 して10 分 間 平 衡 化 流 速 :0.17mL/min カラム 温 度 :35 図 3には マルトオリゴ 糖 を 含 むより 複 雑 な 糖 質 混 合 物 の 分 離 を 示 しています 複 雑 な 糖 質 分 析 にはグラジエント 分 析 が 必 要 で この 分 析 はグラジエント 条 件 下 で 行 われました この 条 件 下 では グラジエントを 通 じて 顕 著 なベースラインの 上 昇 は 見 られません でした これはアミノカラムやポリアミンカラムで 頻 繁 におこる 問 題 であるMSブリードがBEH Amideカラムでは 見 られないことを 示 唆 しています このメソッドの 主 要 なアプリケーションの1つは 市 販 食 品 および 飲 料 製 品 中 の 糖 質 分 析 です これは 原 料 受 け 入 れ 試 験 工 程 内 サンプル 分 析 最 終 製 品 の 品 質 管 理 に 適 応 できます 例 えば ビールは 原 料 の1つとして 大 麦 麦 芽 を 使 用 して 製 造 されますが 大 麦 麦 芽 には 多 くの 単 糖 類 二 糖 類 より 複 雑 な 多 糖 類 が 含 まれ ます 発 酵 過 程 で 酵 母 は 糖 質 を 消 費 してアルコールと 炭 酸 ガスに 変 換 するため 最 終 製 品 にはマルトースやその 他 単 糖 類 は ほとんどまたは 全 く 含 まれません 図 4は 市 販 ビールサンプルの 食 品 糖 スタンダードに 対 する 比 較 分 析 結 果 を 示 しています 図 4 ビール 中 糖 質 のUPLC-MS 分 析 移 動 相 は 図 3と 同 じ グラジエント:10-70%B (10 分 間 ) 10%に 戻 して25 分 間 平 衡 化 流 速 :0.13mL/min カラム 温 度 :35 注 入 量 :2μL 各 分 析 種 および 標 準 品 の 濃 度 は10μg/mL in 50/50 ACN/H 2 O カラムサイズは2.1 100 mm 1.7μm ピーク:(1) fructose (2) glucose (3) sucrose (4) maltose (5)maltotriose 3
単 糖 類 だけでなく 複 雑 な 多 糖 類 も 含 まれるためこの 分 離 はグラジ エント 条 件 下 で 行 われました ビールサンプルのUPLC-MS 分 析 から 数 多 くの 二 糖 類 および 三 糖 類 の 異 性 体 が 顕 著 なレベルで 存 在 することが 示 されました 多 くの 単 糖 ( 例 えばグルコースおよ びフルクトース)は 検 出 されませんでしたが フルクトースは 微 量 に 検 出 されました この 例 では 最 終 飲 料 製 品 中 での 糖 同 定 に 対 するUPLC-MSの 適 性 を 示 しています 同 じメソッドを 原 料 受 け 入 れ 検 査 や 発 酵 飲 料 の 工 程 内 サンプル 分 析 にも 使 用 すること ができます 多 くの 市 販 メープルシロップの 比 較 にもUPLC-MSを 使 用 しました 最 終 製 品 の 糖 質 含 量 に 影 響 する 多 くの 加 工 技 術 があります 現 在 メープルシロップは 不 足 しており 純 メープルシロップの 供 給 不 足 を 補 うために 製 造 業 者 は でんぷん のシロップを 添 加 する 可 能 性 があります 5 種 類 の 異 なるシロップの 比 較 を 図 5に 示 しました 図 に 示 すように 本 物 のメープルシロップの 主 要 成 分 は スクロースです しかしながら UPLC-MS 分 析 の 結 果 から 全 ての 市 販 のシロップが 純 メープルシロップというわけではなく 甘 味 を 増 強 し 純 メープルシロップ 供 給 不 足 を 補 うためにコーンシロップ 等 の でんぷん を 使 用 している 可 能 性 を 示 唆 しています Light syrup と 他 のブランドの 差 異 も 検 出 でき 特 にオリゴ 糖 類 を 含 む 領 域 で 差 が 見 られました(>4 分 ) 最 後 に UPLC-MSを 用 いて 天 然 甘 味 料 中 のステビア 関 連 化 合 物 およびエリスリトール( 糖 アルコール)の 分 析 を 行 いました ステビアは 南 アメリカおよび 中 央 アメリカ 原 産 の 多 年 生 キク 科 の 植 物 です ステビアの 葉 の 抽 出 物 は 砂 糖 の 甘 味 度 の 約 300 倍 で 低 炭 水 化 物 かつ 低 糖 甘 味 料 の 砂 糖 の 代 替 品 として 多 くの 国 で 使 用 されています ステビアの 甘 味 はステビア 植 物 中 のステビ オールグリコシドによるものです 最 近 まで US FDA( 米 国 食 品 医 薬 品 局 )はステビア 化 合 物 の 甘 味 料 としての 使 用 を 禁 止 していました しかし 現 在 その 使 用 禁 止 措 置 は 撤 廃 され 多 くのステビア 関 連 甘 味 料 が 市 販 されるように なっています 図 6には2 種 類 の 市 販 ステビア 関 連 甘 味 料 の 比 較 を 示 しています UPLC-MS 分 析 の 結 果 市 販 甘 味 料 (ブランドY) には 予 測 されるステビオールグリコシドが 含 まれていました 一 方 のブランドXは 主 に 糖 アルコールのエリスリトール( 同 様 に 天 然 甘 味 料 として 使 用 される)により 構 成 されていました ベース ラインの 精 査 によりブランドX 製 品 には ステビア 植 物 に 由 来 する レバウディオシド A(Reb-A)が 少 量 (<1%) 含 まれていることが 示 唆 されました 図 6 2 種 類 の 市 販 ステビア 関 連 甘 味 料 のUPLC-MS 分 析 アイソクラティック 移 動 相 : 77.5/22.5 ACN/H 2 O with 0.1% NH 4 OH 流 速 :0.2mL/min カラム 温 度 :35 注 入 量 : 1.3μL ブランドY 製 品 の 濃 度 は50μg/mL in 50/50 ACN/H 2 O ブランドX 製 品 の 濃 度 は10μg/mL in 50/50 ACN/H 2 O カラムサイズは2.1 100 mm 1.7μm 図 5 様 々なメープルシロップ 中 糖 質 のUPLC-MS 分 析 条 件 は 図 3と 同 じ ピーク:(1) fructose (2) glucose (3) sucrose (4) maltose (5)maltotriose 4
結 論 参 考 文 献 ACQUITY UPLC BEH Amideカラムを 市 販 食 品 飲 料 製 品 中 の 単 糖 および 複 雑 な 糖 質 の 分 離 に 使 用 しました 移 動 相 中 の 高 phモディファイア(アンモニア)の 存 在 によりアノマーが1つ のピークに 溶 出 して クロマトグラフィーがシンプルになりより 正 確 な 糖 質 の 定 量 が 可 能 になります BEH Amideカラムに 高 ph 移 動 相 を 使 用 することで 糖 質 のイオン 化 効 率 を 向 上 でき エレクトロスプレーイオン 化 質 量 分 析 計 で 誘 導 体 化 なしに 糖 質 をそのまま 検 出 可 能 になります 1. C.R. CR Taormina, JT J.T. Baca, S.A. SA Asher, J.J. JJ Grabowski, D.N. DN Finegold, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2007) 332-336. 2. P. Mauri, M. Minoggio, P. Simonetti, C. Gardana, P. Pietta, Rapid Commun. Mass Spectrom. 16 (2002) 743-748. 3. T. Fujimoto, S. Sakuri, A. Tsutsui, K. Furihata, T. Machinami, M. Tashiro, Anal. Sci. 21 (2005) 1245-1247. 4. V.F. Taylor, R.E. March, H.P. Longerich, C.J. Stadey, Int. J. Mass Spetrom. 243 (2005) 71-84. 5. H. Schlichtherle-Cerny, M. Affolter, C. Cerny, Anal. Chem. 75 (2003) 2349-2354. 分 離 の 選 択 性 を 変 更 せずにアセトニトリルの 代 替 としてアセトンを 使 用 できます 市 販 食 品 の 工 程 の 差 異 特 定 や 市 販 飲 料 中 の 異 なる 糖 質 の 分 子 量 確 認 をUPLC-MSで 十 分 に 達 成 します BEH Amideカラムは 天 然 甘 味 料 の 定 性 をするためのステビオール グリコシドと 糖 アルコールの 分 離 にも 使 用 できます 2010 Waters Corporation. Waters The Science of What s Possible ACQUITY UPLC ACQUITY Q Y および MassLynx は Waters Corporationの 商 標 です その 他 すべての 登 録 商 標 はそれぞれの 所 有 者 に 帰 属 します 5