基本的な細胞培養の概説

基 本 的 な 細 胞 培 養 の 概 説 哺 乳 類 動 物 細 胞 の 培 養 における 基 本 の 紹 介

2 はじめに 1900 年 代 初 頭 に 樹 立 された ウィルス 学 研 究 を 支 援 するために1940 年 代 に 確 立 され さらにワク チン 用 のウィルスを 得 るために1950 年 代 に 開 発 が 進 みました 今 日 では 多 種 多 様 な 研 究 に 利 用 されています モデルシステム( 系 ) 疾 患 の 状 態 を 理 解 する パーキンソン 病 糖 尿 病 多 発 性 硬 化 症 組 織 や 臓 器 の 開 発 研 究

3 必 要 なもの ( 通 常 研 究 室 にある 機 器 消 耗 品 に 加 えて) 細 胞! クリーンベンチ( 安 全 キャビネット) CO2 インキュベーター(ほとんどの 哺 乳 類 細 胞 に 必 要 ) 細 胞 増 殖 用 のプラスティック 容 器 (ケース) 滅 菌 フィルター(0.2μm) 培 地 顕 微 鏡 細 胞 計 数 用 の 道 具 血 球 計 算 盤 もしくは 機 器 培 地 添 加 物 その 他 :ピペット 吸 引 ポンプ(アスピレーション) 遠 心 機 恒 温 器 フリーザー 冷 蔵 庫

4 クリーンベンチ 滅 菌 作 業 エリアを 維 持 水 平 もしくは 垂 直 のエアフロー 隔 離 されたクリーンルームの 場 合 にはフード 付 き 作 業 エリアは 丌 要 垂 直 気 流 方 式 のクリーンベンチまたは 安 全 キャビネット 通 常 は 使 用 前 使 用 後 に 作 業 スペース 表 面 を 滅 菌 のためUVライ トを 照 射 クリーンベンチは 保 管 場 所 ではありません

5 インキュベーター( 孵 卵 器 ) すべての 哺 乳 動 物 細 胞 はCO2インキュベーターを 必 要 とします 多 くの 哺 乳 動 物 細 胞 は 以 下 が 必 要 です 温 度 = 37 湿 度 = 95% CO 2 = 5% ウォータジャケット 付 きもある

6 主 要 な 細 胞 種 類 不 死 化 ( 樹 立 された) 細 胞 株 (Cell lines) ATCC(American Type Culture Collection) とECACC(European Collection of Cell Cultures) が 主 な 供 給 源 です それらでは80 種 類 以 上 の 種 から 3,400 以 上 の 細 胞 株 がラインナップされていいます 細 胞 は 安 定 していて 凍 結 保 存 可 能 ( 液 体 窒 素 )です また 規 定 の 継 代 数 培 養 可 能 です 一 般 的 な 細 胞 株 の 例 : 3T3,293,CHO,COS,HeLa 初 代 培 養 細 胞 (Primary cells) 組 織 や 器 官 から 直 接 取 り 出 して 培 養 する ほとんどは 限 られた 寿 命 を 持 ち 有 限 回 数 の 細 胞 分 裂 の 後 に 増 殖 が 停 止 する 以 下 のようないくつかの 方 法 によって 培 養 のために 組 織 から 単 離 される 血 液 からの 精 製 :PBMCs コラーゲナーゼ トリプシン プロネーゼのような 酵 素 によって 軟 組 織 から 分 離

細 胞 株 と 初 代 培 養 細 胞 の 比 較 細 胞 株 広 く 使 用 されている しかし 細 胞 株 を 用 い て 得 られる 情 報 は 初 代 培 養 細 胞 を 用 いて 得 られる 情 報 より 生 物 学 的 に 正 確 でない 可 能 性 もある 簡 単 に 増 殖 無 限 に 増 殖 する 凍 結 保 存 することができる 細 胞 の 性 質 が 変 わっている ( 例 : 多 くががん 組 織 に 由 来 している) 由 来 した 組 織 細 胞 の 性 質 は 失 われている 遺 伝 的 に 同 一 である(ATCC 以 外 から 入 手 し た 場 合 には 注 意 が 必 要 です ちゃんとした 細 胞 株 ではないかもしれません) 初 代 培 養 細 胞 医 学 的 もしくは 生 理 学 的 により 正 確 である ( 元 の 器 官 組 織 の 細 胞 の 性 質 を 反 映 して いる) 時 に 増 殖 が 困 難 : 培 養 しても 限 られた 細 胞 寿 命 である 元 の 組 織 器 官 の 細 胞 から 性 質 的 変 更 が ない 動 物 もしくは 組 織 から 得 られる 目 的 の 細 胞 以 外 が 混 入 している 可 能 性 が ある

組 織 からの 一 般 的 な 細 胞 株 動 物 の 組 織 は 以 下 の 大 きく4つの 種 類 に 分 類 される 組 織 名 Tissue name 細 胞 株 例 上 皮 組 織 Epithelial tissue CHO(Chinese hamster ovary) HeLa Hep-2 MCF-7,U373 結 合 組 織 Connective tissue 293,3T3,COS 筋 組 織 Muscle tissue 血 液 平 滑 筋 細 胞 神 経 組 織 Nervous tissue Neuro 2A, PC12, C6 多 くの 細 胞 株 は 癌 の 腫 瘍 由 来 です これらの 細 胞 は 表 面 に 付 着 して 増 殖 するため 付 着 細 胞 として 知 られています CHO 細 胞 reprint Filckr マウス 胚 線 維 芽 細 胞 (MEF) reprint Wiki 平 滑 心 筋 細 胞 reprint Wiki

9 血 液 細 胞 ( 血 球 細 胞 ) Hemocytoblast 血 球 母 細 胞 Proerythroblast 前 赤 芽 球 Myeloblast 骨 髄 球 Lymphoblast リンパ 芽 球 Monoblast 単 芽 球 Megakaryoblast 前 巨 大 核 球 Polychromatic erythroblast 多 染 性 赤 芽 球 Progranulocyte 前 顆 粒 球 Megakaryocyte 巨 核 球 Lymphocyte リンパ 球 Monocyte 単 球 Erythrocytes 赤 血 球 Basophil 好 塩 基 球 Eosinophil 好 酸 球 Neutrophil 好 中 球 Thrombocytes 血 小 板 Granulocytes 顆 粒 球 Agranulocytes 無 顆 粒 白 血 球 Leukocytes 白 血 球 これらの 細 胞 は 懸 濁 液 中 だけで 増 殖 する ; リンパ 球 は 良 く 研 究 に 用 いられている リンパ 球 もしくはリンパ 芽 球 の 例 :HL-60,Jurkat

10 一 般 的 な 培 地 最 も 良 く 使 われる 培 地 D-MEM / F12 培 地 D-グルコース(ブドウ 糖 ) L-グルタミン HEPES 緩 衝 液 ヒポキサンチンナトリウム 塩 リノール 酸 α-リポ 酸 プトレシ ン 二 塩 酸 塩 フェノールレッド 指 示 薬 ピルビン 酸 ナトリウム チミジン アミノ 酸 ビタミンが 含 まれています グルタミン 添 加 RPMI 1640 L-グルタミン HEPES 緩 衝 液 フェノールレッド 指 示 薬 が 含 ま れています 細 胞 培 養 用 培 地 一 般 的 な 追 加 試 薬 HEPES 緩 衝 液 EDTA L-グルタミン 抗 生 物 質 :ペニシリン ゲンタマイシン ストレプトマイシン/ペニ シリン 抗 真 菌 剤 :ファンギゾール(Fungizole) ウシ 胎 児 /ウシ 血 清 (Fetal calf/bovine serum) 多 くの 培 地 はpH7.2-7.5です その 多 くはpH 変 化 を 色 で 知 らせる 色 素 が 培 地 に 含 まれています

11 細 胞 培 養 用 容 器 付 着 細 胞 * もしくは 浮 遊 細 胞 * 容 器 等 表 面 に 付 着 して 増 殖 します 浮 遊 細 胞 のみ T-フラスコ (T-25, T-74, T-150; 数 値 は 培 養 面 積 cm2) スピナーフラスコ 典 型 的 な 細 胞 濃 度 : 5 x 10 4 1 x 10 7 /ml 供 給 メーカー:コーニング ヌンク BD Wheaton

12 細 胞 計 数 (セルカウンティング) 細 胞 は 血 球 計 算 盤 ( 15,000-35,000)でカウントされるのが 一 般 的 です 少 量 の 細 胞 懸 濁 液 を 血 球 計 算 盤 上 に 滴 下 して 上 からカバーガラスをおき ます 血 球 計 算 盤 を 顕 微 鏡 にセットして 指 定 領 域 内 ( 例 : 上 左 図 の 黒 塗 り 部 分 )の 細 胞 数 を 数 えます 細 胞 の 希 釈 率 に 基 いて 細 胞 数 計 算 し 継 代 培 養 に 必 要 な 細 胞 濃 度 を 算 出 します 自 動 計 測 できるセルカウンター 機 器 が 入 手 可 能 です

13 細 胞 培 養 ワークフロー 1 日 目 - 凍 結 状 態 の 細 胞 を 得 る (これは 細 胞 株 の 場 合 だけです 初 代 培 養 細 胞 の 場 合 には 新 鮮 な 状 態 [ 凍 結 していない]から 始 めます ) - 37 のウォーターバスに 凍 結 したバイアルを 入 れ 細 胞 を 解 凍 します そ の 後 新 鮮 な 培 地 で 一 度 洗 浄 します ( 遠 心 して 細 胞 を 集 めます) - 適 切 な 容 器 に 移 し 一 晩 インキュベートします - ( 注 意 : 細 胞 の 生 存 率 は 約 1 時 間 後 にチェックすることができます ) 1 日 目 2-4 日 目 - 低 倍 率 の 顕 微 鏡 を 用 いて 組 織 培 養 フラスコに 付 着 した 細 胞 を 観 察 しま す 細 胞 が 十 分 間 隔 をおいて 容 器 表 面 に 単 層 (モノレイヤー)を 形 成 して いる 必 要 があります - 2-3 回 / 週 の 間 隔 で 培 地 を 除 去 して 新 鮮 な 培 地 に 交 換 する 6-9 日 目 - 細 胞 がコンフルエントになる( 非 常 に 接 近 し 密 集 した 状 態 ) その 状 態 から 二 次 培 養 株 分 け 継 代 される 必 要 があります 6-8 日 目 コンフルエント 状 態 の 細 胞

14 細 胞 の 株 分 け 付 着 細 胞 培 養 フラスコから 培 地 を 取 り 除 く PBSもしくは 培 地 にトリプシンを 混 ぜた 溶 液 を 少 量 (1-2ml)に 加 え 細 胞 を 溶 液 で 覆 う ( 時 々 EDTAがトリプシンの 代 わりに 用 いられます ;もしくは 代 わりにス パチュラを 用 いて 細 胞 を 物 理 的 に 剥 がします) 37 で2-5 分 インキュベートします 細 胞 を 剥 がすために フラスコをタップします トリプシンを 阻 害 するために 培 地 を3-5ml 加 えます 丌 要 な 細 胞 を 除 去 して 一 定 量 の 細 胞 を 希 釈 / 細 胞 計 数 を 行 う 一 定 量 の 細 胞 懸 濁 液 を 新 しい 培 養 に 使 う 浮 遊 細 胞 細 胞 懸 濁 液 から 一 定 量 の 細 胞 を 細 胞 計 数 する 新 しい 細 胞 を 適 切 な 分 量 取 り 新 規 培 養 を 始 める

15 リソース ATCC(American Type Culture Collection)- www.atcc.org/ ECACC(European Collection of Cell Cultures) www.hpacultures.or.uk/collections/eacc.jsp/ DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell ccultures) www.dsmz.de/ Gene Transfer Protocol Library www.bio-rad.com/genetransferprotocols/

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