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糖 分 を 細 胞 内 に 輸 送 する 膜 たんぱく 質 の 立 体 構 造 と 動 きを 解 明 ~ 肥 満 やがんの 抑 制 策 に 役 立 つ 新 たな 知 見 ~ ポイント 抗 体 を 用 いる 独 自 の 結 晶 化 技 術 により ヒト 哺 乳 類 において 糖 分 子 を 細 胞 内 に 輸 送 す る 膜 たんぱく 質 の 立 体 構 造 を 解 明 した 膜 たんぱく 質 が 柔 軟 に 立 体 構 造 を 変 化 させて 特 定 の 糖 分 子 を 選 択 的 に 細 胞 内 に 取 り 込 む 仕 組 みが 分 かった 肥 満 やがんを 抑 制 する 薬 剤 の 分 子 設 計 などにつながる 基 盤 情 報 が 得 られた 京 都 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 野 村 紀 通 助 教 岩 田 想 教 授 らは ヒト 哺 乳 類 にお いて 細 胞 内 に 果 糖 を 選 択 的 に 輸 送 するGLUT5(グルットファイブ) 注 1) という 膜 たん ぱく 質 の 立 体 構 造 を 解 析 し GLUT5が 細 胞 膜 において 細 胞 の 外 側 に 向 けて 開 いた 状 態 ( 以 下 外 開 き )と 内 側 に 向 けて 開 いた 状 態 ( 以 下 内 開 き )の2つの 立 体 構 造 を 介 して 果 糖 を 細 胞 内 に 輸 送 していることを 明 らかにしました ブドウ 糖 や 果 糖 などの 糖 分 子 は 生 命 維 持 に 必 須 ですが 食 物 中 の 糖 分 子 は 糖 輸 送 体 とい う 膜 たんぱく 質 を 介 して 細 胞 内 に 取 り 込 まれてエネルギーなどへ 変 換 されます この 糖 輸 送 体 のうち 促 進 拡 散 によって 糖 分 子 を 輸 送 する 膜 たんぱく 質 (GLUT)は 肥 満 や 糖 尿 病 だけでなく がんの 細 胞 増 殖 制 御 にも 関 与 していることが 知 られています 本 研 究 グループでは 抗 体 フラグメント 注 2) を 結 晶 化 の 促 進 因 子 として 用 いる 独 自 技 術 により ヒトのGLUT5とよく 似 ているラットのGLUT5を 結 晶 化 することに 成 功 し その 立 体 構 造 を 原 子 レベルで 解 明 しました 得 られた 立 体 構 造 は GLUT5が 外 開 きの 状 態 であり 細 胞 の 外 からの 果 糖 の 流 入 結 合 を 待 ち 受 けている 構 造 と 考 えられます また ウシのGLUT5を 結 晶 化 し 立 体 構 造 を 解 明 することにも 成 功 しました この 立 体 構 造 は 内 開 きの 状 態 で GLUT5が 細 胞 内 に 果 糖 を 放 出 して 輸 送 を 終 えた 瞬 間 の 構 造 と 考 えられます さらに これらの 立 体 構 造 を 比 較 したところ GLUT5を 構 成 する2 つの 大 きな 部 位 が 開 閉 するだけでなく それらの 部 位 の 内 部 でも 局 所 的 な 構 造 変 化 が 起 こ ることで 一 度 結 合 した 果 糖 を 細 胞 外 に 逃 さずに 効 率 良 く 細 胞 内 に 送 り 込 むためのゲート が 形 成 されることが 明 らかになりました これらの 立 体 構 造 の 情 報 は GLUT5の 輸 送 活 性 を 阻 害 するための 薬 剤 の 分 子 設 計 に 重 要 な 指 針 を 与 えるものであり 今 後 肥 満 や 生 活 習 慣 病 の 予 防 治 療 薬 やがん 細 胞 のマ ーカーなどの 開 発 につながることが 期 待 されます 今 回 の 研 究 開 発 は JST 戦 略 的 創 造 研 究 推 進 事 業 による 支 援 を 受 けています また 本 研 究 はスウェーデン 王 国 ストックホルム 大 学 のDavid Drew(デイビット ドリュー) 博 士 らとの 国 際 共 同 研 究 チームで 行 ったものです 本 研 究 成 果 は 2015 年 9 月 30 日 ( 英 国 時 間 )に 英 国 科 学 誌 Nature のオンライン 速 報 版 で 公 開 されま す 1

< 研 究 の 背 景 と 経 緯 > 清 涼 飲 料 水 や 菓 子 類 加 工 食 品 ファーストフード 化 学 調 味 料 などに 多 く 含 まれる 果 糖 (フルクトース)の 過 剰 摂 取 は 肥 満 メタボリックシンドローム( 内 臓 脂 肪 症 候 群 ) や 脂 肪 肝 など 多 くの 生 活 習 慣 病 につながる 隠 れた 危 険 因 子 です このことは 高 果 糖 のコー ンシロップ( 高 果 糖 ブドウ 糖 液 糖 )を 大 量 に 消 費 する 米 国 ではすでに 大 きな 問 題 になって おり 果 糖 の 摂 り 過 ぎの 注 意 を 促 す 臨 床 研 究 が 相 次 いで 報 告 されています 生 体 内 に 果 糖 が 取 り 込 まれる 際 の 関 門 になっているのが GLUT5という 膜 たんぱく 質 です GLUT5は 腸 管 上 皮 細 胞 の 頭 頂 面 に 局 在 し 摂 取 した 食 物 から 果 糖 を 選 択 的 に 吸 収 する 働 きを 持 っています また 最 近 の 研 究 結 果 から GLUT5は 乳 がん 細 胞 で 過 剰 発 現 していることも 明 らかになり がん 細 胞 の 増 殖 に 深 く 関 与 することも 知 られていま す GLUT5を 含 むGLUTの 分 子 機 構 ( 動 く 仕 組 み)や 基 質 認 識 の 特 異 性 を 明 らかに することにより 細 胞 内 の 糖 濃 度 の 調 節 ひいては 糖 尿 病 生 活 習 慣 病 やがんの 予 防 改 善 に 役 立 つ 新 たな 知 見 が 得 られると 期 待 されており その 基 盤 情 報 となる 立 体 構 造 の 解 析 が 望 まれています 20 年 以 上 にわたり 世 界 中 の 多 数 の 研 究 グループがGLUTの 立 体 構 造 解 析 に 挑 戦 し 昨 年 初 めてブドウ 糖 (グルコース)を 選 択 的 に 輸 送 するヒトGLUT1の 内 開 き 状 態 の 立 体 構 造 が 解 明 されました しかし たった1つの 立 体 構 造 からでは GLUTがどのよ うに 糖 分 子 と 結 合 し 細 胞 内 に 糖 分 子 を 輸 送 させるのか 糖 分 子 を 輸 送 するためにGLUT がどのように 構 造 を 変 化 させるのかという 仕 組 みは 明 らかにできませんでした 本 研 究 グループでは ヒトのGLUT5とほぼ 同 じ 配 列 を 持 つ 哺 乳 類 GLUT5の 立 体 構 造 解 析 に 平 成 19 年 度 から 取 り 組 んできましたが 哺 乳 類 の 膜 たんぱく 質 の 立 体 構 造 解 析 は 結 晶 化 が 非 常 に 難 しく 解 析 に 成 功 していませんでした しかし 本 研 究 グループは5 年 前 に 抗 体 フラグメント(Fv)を 膜 たんぱく 質 の 結 晶 化 を 促 進 する 因 子 として 用 いる 独 自 技 術 を 開 発 することに 成 功 し GLUT5の 結 晶 化 およびX 線 構 造 解 析 に 成 功 しまし た < 研 究 の 内 容 > 本 研 究 グループは JST 戦 略 的 創 造 研 究 推 進 事 業 ERATO 岩 田 ヒト 膜 受 容 体 プ ロジェクト ( 平 成 17~22 年 度 )にて 開 発 した 抗 体 を 用 いた 結 晶 化 促 進 技 術 により ラ ットのGLUT5と 抗 体 フラグメントの 複 合 体 の 結 晶 化 に 成 功 し 立 体 構 造 を 原 子 レベル で 解 明 しました 得 られた 立 体 構 造 は GLUT5が 細 胞 外 側 に 向 けて 開 いた 状 態 ( 以 下 外 開 き )であり 細 胞 外 からの 果 糖 の 流 入 結 合 を 待 ち 受 けている 糖 分 子 の 輸 送 直 前 注 の 瞬 間 の 構 造 と 考 えられます( 図 1a) また 変 異 導 入 3) により 細 胞 の 内 側 に 向 けて 開 いた 状 態 ( 以 下 内 開 き )で 安 定 化 したウシのGLUT5の 結 晶 化 にも 成 功 し その 立 体 構 造 も 原 子 レベルで 解 明 しました この 立 体 構 造 は GLUT5が 細 胞 内 に 果 糖 分 子 を 輸 送 し 終 えた 瞬 間 の 構 造 と 考 えられます( 図 1b) 昨 年 解 明 されたヒトGLUT1の 立 体 構 造 とこれらの 構 造 を 比 較 したところ ラットのGLUT5の 外 開 き 状 態 の 構 造 は 新 規 の 知 見 であることが 明 らかになりました 注 今 回 解 析 したGLUT5の 立 体 構 造 は 細 胞 膜 を 貫 通 する6 本 のヘリックス 4) の 束 が 2 組 V 字 型 のように 配 置 されて 基 質 分 子 の 透 過 経 路 となる 深 く 大 きな 空 洞 を 形 成 2

していました 基 質 である 果 糖 は 結 合 していませんでしたが この 空 洞 の 最 深 部 に 露 出 し 注 5) ているアミノ 酸 残 基 を 生 化 学 実 験 により 詳 しく 調 べたところ GLUT5の 基 質 であ る 果 糖 が 結 合 する 部 位 が 明 らかになりました また この 部 位 にあるアミノ 酸 残 基 を1つ 変 更 することで GLUT5が 果 糖 ではなく ヒトのGLUT1のようにブドウ 糖 に 結 合 しやすくなることが 分 かりました これらの 結 果 は 空 洞 の 最 深 部 周 辺 のアミノ 酸 残 基 が 結 合 する 糖 の 種 類 を 決 める 役 割 を 担 っていることを 示 しています さらに 外 開 き 状 態 と 内 開 き 状 態 のGLUT5 立 体 構 造 を 重 ね 合 わせて 比 較 したところ 2 組 の 膜 貫 通 ヘリックスの 束 が 大 規 模 に 動 いて 輸 送 経 路 の 空 洞 を 外 開 きから 内 開 きに 変 換 する 仕 組 みがあること それに 加 えていくつかのヘリックスでは 局 所 的 に 構 造 が 変 化 し いったん 結 合 した 果 糖 を 細 胞 外 に 逃 さず 効 率 的 に 細 胞 内 に 送 り 込 むために 2つの ゲ ート が 形 成 される 仕 組 みが 明 らかになりました( 図 2) また 外 開 き 状 態 の 構 造 ではV 注 6) 字 型 の 全 体 構 造 の 根 元 部 分 に 複 数 の 塩 橋 が 形 成 されているのに 対 し 内 開 き 状 態 の 構 造 ではこれらの 塩 橋 が 切 断 されていました この 塩 橋 の 形 成 に 関 与 しているアミノ 酸 残 基 を 変 えると 果 糖 のGLUT5への 結 合 が 弱 まることから この 塩 橋 は 外 開 き 状 態 の 構 造 を 安 定 化 させるだけでなく 果 糖 の 結 合 にも 重 要 な 役 割 を 担 っていることが 示 唆 されまし た これらの 立 体 構 造 の 詳 細 な 分 析 と 生 化 学 的 な 実 験 結 果 から GLUT5は 果 糖 を 細 胞 内 に 取 り 入 れるために 果 糖 を 輸 送 するための 空 洞 を 外 開 きから 内 開 きへと 単 純 に 開 閉 する 注 ロッカースイッチ 機 構 7) ではなく 果 糖 が 結 合 しやすいように 細 胞 の 外 側 ゲートが 開 い た 状 態 を 維 持 し 果 糖 が 結 合 したらそのゲートを 閉 じ 局 所 的 な 構 造 を 変 化 させた 後 に 細 胞 の 内 側 ゲートを 開 けて 果 糖 を 細 胞 内 に 放 出 する ゲートポア 機 構 を 持 っていると 考 え られます( 図 3 動 画 1) 親 水 性 の 低 分 子 化 合 物 を 受 動 的 に 輸 送 する 促 進 拡 散 型 の 膜 た んぱく 質 は GLUT5と 同 じような 機 構 により 細 胞 外 の 分 子 を 細 胞 内 に 輸 送 している 可 能 性 が 示 唆 されます < 今 後 の 展 開 > GLUT5において 果 糖 が 結 合 する 部 位 の 立 体 構 造 情 報 と 果 糖 を 輸 送 する 仕 組 みが 明 らかになったことで GLUT5の 輸 送 活 性 を 阻 害 する あるいは 調 節 できる 薬 剤 の 探 索 や 分 子 設 計 が 可 能 になると 考 えられます また 今 回 明 らかになった 立 体 構 造 をもとに 基 質 輸 送 に 伴 う 輸 送 体 の 構 造 変 化 を 計 算 機 上 でシミュレーションおよび 再 現 することによ り 輸 送 体 の 機 能 や 分 子 機 構 をより 深 く 理 解 できるようになると 考 えられます 本 研 究 グ ループが 開 発 した 抗 体 フラグメント 作 製 技 術 により これまで 立 体 構 造 解 析 が 難 しかった 多 くの 膜 たんぱく 質 の 結 晶 化 および 構 造 解 析 をより 迅 速 に 実 施 できるものと 期 待 されます 3

< 参 考 図 > 図 1 GLUT5の 立 体 構 造 (a) 外 開 き 状 態 と(b) 内 開 き 状 態 のGLUT5の 全 体 構 造 (リボン 図 ) 6 本 の 膜 貫 通 ヘリックスの 束 ( 赤 色 橙 色 濃 青 色 淡 青 色 のリボン)が2つ 組 み 合 わさってV 字 の 空 洞 ( 黒 色 破 線 )を 形 成 している 外 開 き 状 態 も 内 開 き 状 態 も 細 胞 膜 の 中 間 地 点 ( 赤 色 破 線 )までしか 開 かないことが 分 かる (c) 外 開 き 状 態 と(d) 内 開 き 状 態 のGLUT5の 果 糖 を 輸 送 する 経 路 の 空 洞 細 胞 に 垂 直 な 面 で 切 断 した 切 断 面 から 外 開 き 状 態 では 果 糖 が 結 合 しやすいように 大 きな 親 水 性 ( 青 色 )の 空 洞 が 細 胞 外 側 に 向 けて 大 きく 開 いているのに 対 して 内 開 き 状 態 で は 果 糖 が 細 胞 内 に 放 出 されやすいように 空 洞 が 細 胞 内 側 に 向 けて 大 きく 開 いている 4

図 2 外 開 き 状 態 と 内 開 き 状 態 のGLUT5の 立 体 構 造 の 比 較 外 開 き 状 態 での 各 ヘリックスの 位 置 (1 7 4 10)と 内 開 き 状 態 での 各 ヘリッ クスの 位 置 (1* 7* 4* 10*)が 異 なることが 分 かる 外 開 き 状 態 から 内 開 き 状 態 に 移 行 するときに ヘリックス7の 上 半 分 とヘリックス10の 下 半 分 が 局 所 的 に 構 造 変 化 を 起 こして 細 胞 外 側 ゲートと 細 胞 内 側 ゲートを 形 成 するのに 大 きく 寄 与 することが 示 唆 される 中 央 に 示 した 低 分 子 化 合 物 は 果 糖 で 生 化 学 実 験 から 予 想 される 結 合 部 位 の 位 置 を 表 している 5

図 3 基 質 輸 送 に 伴 うGLUT5の 構 造 変 化 モデル 1 果 糖 ( 五 角 形 緑 色 )が 結 合 しやすい 外 開 き 状 態 の 構 造 は 2 組 のヘリックスの 束 の 下 端 部 分 に 形 成 される 複 数 の 塩 橋 により 安 定 化 されている また 細 胞 内 のへリックス(I CH1-4 ICH5)もまとまっている 2 果 糖 が 結 合 することによって へリックス7の 上 半 分 とへリックス10の 下 半 分 が 動 い て 果 糖 を 取 り 囲 む このとき へリックス4とへリックス10の 下 端 は 近 い 位 置 にあり 細 胞 内 側 のゲートが 形 成 されている 32 組 のヘリックスの 束 が 剛 体 回 転 により 大 きく 動 いた 結 果 へリックス1とへリックス 7の 上 端 が 近 づいて 細 胞 の 外 側 のゲートが 形 成 され 果 糖 が 細 胞 外 に 散 逸 しない 状 態 に なる その 際 に 細 胞 内 へリックス(ICH5)は ICH1-4のまとまりから 離 れた 位 置 に 大 きく 動 く 4 へリックス10の 下 半 分 が 動 いて 細 胞 内 側 ゲートが 開 く その 結 果 果 糖 が 細 胞 の 内 側 に 放 出 される このような 輸 送 の 仕 組 みを ゲートポア 機 構 という < 動 画 1> 6

< 用 語 解 説 > 注 1)GLUT5(グルットファイブ) ヒト 哺 乳 類 細 胞 における 細 胞 膜 を 介 した 糖 分 子 の 輸 送 は ナトリウムイオン(Na + ) -ブドウ 糖 共 輸 送 体 (SGLT)による 能 動 的 な 輸 送 と Na + に 依 存 しない 促 進 拡 散 によ る 糖 輸 送 体 (GLUT)による 受 動 的 な 輸 送 により 行 われることが 知 られている GLU Tといわれる 糖 輸 送 体 は 14 種 類 の 類 縁 体 (GLUT1~14)が 存 在 し そのそれぞ れの 類 縁 体 は 特 定 の 組 織 への 局 在 性 や 輸 送 する 糖 の 種 類 ( 基 質 )が 異 なる 例 えば G LUT1は 細 胞 内 にブドウ 糖 (グルコース)を 輸 送 する GLUT5は 腸 絨 毛 の 腸 管 上 皮 細 胞 頭 頂 面 に 局 在 し 小 腸 において 摂 取 した 食 物 から 果 糖 (フルクトース)を 吸 収 するた めに 必 須 の 膜 たんぱく 質 である なお 腸 絨 毛 の 頭 頂 部 に 局 在 し 小 腸 において 摂 取 した 食 物 からのブドウ 糖 (グルコース)の 吸 収 に 必 須 の 膜 たんぱく 質 はSGLT1である 注 2) 抗 体 フラグメント(Fv) 抗 体 を 酵 素 処 理 や 遺 伝 子 工 学 的 手 法 を 用 いて 発 現 させて 抗 原 に 結 合 できる 最 小 単 位 にしたもの 注 3) 変 異 導 入 人 為 的 に 現 状 のアミノ 酸 配 列 を 異 なる 配 列 に 置 き 換 えること 注 4)ヘリックス たんぱく 質 の 立 体 構 造 の 一 部 で アミノ 酸 がらせん 状 に 折 りたたまれたモチーフのこと 注 5)アミノ 酸 残 基 たんぱく 質 を 構 成 するアミノ 酸 の 一 部 で 20 種 類 あるアミノ 酸 の 種 類 を 決 定 する た んぱく 質 と 基 質 と 結 合 するなどの 機 能 を 持 つ 注 6) 塩 橋 たんぱく 質 の 中 で 塩 基 性 のアミノ 酸 残 基 (アルギニンやリジン)と 酸 性 のアミノ 酸 残 基 (アスパラギン 酸 グルタミン 酸 )の 間 に 働 く 弱 いイオン 性 相 互 作 用 のこと たんぱく 質 の 立 体 構 造 を 安 定 させる 注 7)ロッカースイッチ 機 構 2 組 の 膜 貫 通 ヘリックスの 束 が 剛 体 として 可 動 して 内 開 きと 外 開 きの 構 造 を 行 き 来 する ことにより 基 質 を 輸 送 する 仕 組 みのこと < 論 文 タイトル> Structure and mechanism of the mammalian fructose transporter GLUT5 ( 哺 乳 類 の 果 糖 輸 送 体 GLUT5の 構 造 と 分 子 機 構 ) 7