実 践 的 な 免 疫 組 織 染 色 の 方 法 ~ 特 に 酵 素 抗 体 法 を 中 心 に~ 病 理 診 断 学 常 山 幸 一 野 本 一 博 林 伸 一 三 輪 重 治 西 田 健 志 八 田 秀 樹
免 疫 染 色 組 織 標 本 の 中 にある 或 る タンパク 質 の 場 所 を 目 で 見 えるようにするための 方 法 目 的 とするタンパク 質 ' 抗 原 (にだけくっつく 事 ができる 物 質 ' 抗 体 (を 使 う 抗 原 =タンパク 質 抗 体 = 抗 原 とくっつく
簡 単 な 原 理 1(まず 抗 原 に 抗 体 ' 一 次 抗 体 (がくっつく 2(くっついた 一 次 抗 体 に 特 異 的 にくっつく 二 次 抗 体 を applyする 抗 原 二 次 抗 体 が 蛍 光 標 識 され いれば 蛍 光 で 光 っている 場 所 に 抗 原 が 存 在 二 次 抗 体 に 酵 素 が 付 いて いれば 基 質 で 様 々な 色 に 発 色 ' 酵 素 抗 体 法 (
酵 素 抗 体 法 の 場 合 酵 素 と 基 質 の 組 み 合 わせを 変 えれば 見 たいものを 何 色 にすることもできる Peroxidase Alkaline Phosphatase DABで 茶 色 AECで 赤 色 アセトニトリルで 黒 青 色 など Fast Redで 赤 色 Fast blueで 青 色 など
Peroxidase'PO)の 基 質 Alkaline Phosphatase'AP) の 基 質
酵 素 と 基 質 の 組 み 合 わせを 変 える 事 で 何 重 染 色 も 可 能 に! ~ 特 に 異 なる 細 胞 にそれぞれ 標 的 とする 抗 原 が 存 在 する 場 合 に 有 用 ~ ' 但 し 一 つの 染 色 を 終 えるたびに それまでにapplyした 抗 体 を wash outしたり 変 性 させたりする 必 要 あり(
しかし 実 際 にはうまくいかない 事 も 多 い.. 原 因 ( 抗 原 が 壊 れてしまっている 抗 原 がマスクされてしまっている 抗 体 が 免 疫 染 色 に 不 適 である 抗 体 の 結 合 性 が 弱 い 修 復 不 能 抗 原 賦 活 ができる 事 も どうしようもない' 事 が 多 い( 感 度 を 上 げてみる
抗 原 賦 活 の 方 法 熱 をかける オートクレーブ 圧 力 釜 電 気 ポット 抗 原 賦 活 液 クエン 酸 バッファー TRS 溶 液 Immunosaver L.A.B. Solution など 酵 素 処 理 を 行 う Pepsin 処 理 Protease K 処 理 Hyarulonidase 処 理 ' 室 温 ~37 3-30 分 (
Immunosaverのホームページより 引 用
DAKO のPascal
電 子 レンジ 用 のPressure cooker
蛍 光 抗 体 法 << 酵 素 抗 体 法 ABC 法 LSAB 法 ポリマー 法 iaep 法 感 度 を 上 げる 工 夫 抗 原 抗 体 反 応 の 強 化 時 間 短 縮 'マイクロウエーブ 超 音 波 など(
ABC 法 (avidin-biotinylated peroxidase complex) 一 次 抗 体 を 反 応 した 後 にビオチン 標 識 二 次 抗 体 を 作 用 させ 引 き 続 き 標 識 酵 素 を 反 応 させる3ステップ 法 直 接 法 に 比 べて 感 度 が 高 いが LSABやポリマー 法 には 敵 わ ない 注 意 ( 熱 による 抗 原 賦 活 化 処 理 で 内 因 性 ビオチンの 非 特 異 的 反 応 が 起 こる
LSAB 法 (labeled streptavidin biotinyated antibody) 基 本 的 にはABC 法 と 同 様 であるが ビオチンと 酵 素 標 識 ストレプ トアビジンの 両 者 はきわめて 親 和 性 が 高 く 非 可 逆 的 な 結 合 性 を 示 し 更 なる 高 感 度 が 得 られる キット 商 品 も 多 数 市 販 されている 注 意 ( ABC 法 同 様 熱 による 抗 原 賦 活 化 処 理 で 内 因 性 ビオチン の 非 特 異 的 反 応 が 起 こる
標 識 酵 素 ポリマー 法 従 来 の 間 接 法 と 比 較 して 著 しく 高 感 度 で 汎 用 性 が 高 い 2ステッ プ 法 なので 短 時 間 に 反 応 が 終 了 できる アビジンビオチン 反 応 とは 無 関 係 なので 内 因 性 ビオチンによる 非 特 異 的 反 応 がない
Envision method (DAKO) (hyper-sensitive polymer method) 1.Apply primary antibody 2.Apply peroxidase-envision 3.Apply substrate for color (DAB) Quick (three steps) & Sensible Standard method for the routine immunostaining!
DAKO Envision マウス 一 次 抗 体 用 Peroxidase 標 識 ラビット 一 次 抗 体 用 Peroxidase 標 識 マウス&ラビット 用 Peroxidase 標 識 マウス&ラビット Alkaline Phosphatase 標 識
ニチレイ ヤギ 一 次 抗 体 用 Peroxidase 標 識 ラット 一 次 抗 体 用 Peroxidase 標 識
iaep 法
iaep 法 DAKO 社 のホームページより 自 験 例
抗 原 抗 体 反 応 をマイクロウエーブを 用 いて 迅 速 化 する 方 法
Standard immunostaining procedure Specimens are placed in a 60 oven beforehand. 1 Deparaffinization (5 min) 2 Antigen retrieval (microwave; 10 min; enzyme; 6 minutes) 3 Rinsed in running water 4 100% methanol with 3% H 2 O 2 (5 min) 5 Rinsed with running water, distilled water, and TBS-Tween 6 Soaked in TBS with 5% BSA (5min) 7 Exposure to the primary antibody ( 60 min-over night) 8 Rinsed in TBS with shaking (5min) 9 Application of the secondary antibody (Envision or Simple Stein) ( 60 min-over night) 10 Rinsed in TBS with shaking (5 min) 11 Immersed in DAB/H2O2 solution (5-15 min) 12 Rinsed in TBS and running water 13 Counterstaining Dehydration, mounting and cover slipping It takes more than 3 hours (~one day!)
One-hour immunostaining procedure Specimens are placed in a 60 oven beforehand. 1 Deparaffinization (5 min) 2 Antigen retrieval (microwave; 10 min; enzyme; 6 minutes) 3 Rinsed in running water 4 100% methanol with 3% H 2 O 2 (5 min) 5 Rinsed with running water, distilled water, and TBS-Tween 6 Soaked in TBS with 5% BSA (1 min) 7 Exposure to the primary antibody with intermittent irradiation (10 min) 8 Rinsed in TBS with Tween with shaking (1 min) 9 Application of the secondary antibody (Envision or Simple Stein) with intermittent irradiation (10 min) 10 Rinsed in TBS with shaking (1 min) 11 Immersed in DAB/H2O2 solution with intermittent irradiation (5 min) 12 Rinsed in TBS and running water 13 Counterstaining Dehydration, mounting and cover slipping
Comparison between standard procedure and ours Step 7 Standard procedure Exposure to the primary antibody ( 60 min-over night) Our procedure Exposure to the primary antibody with intermittent irradiation (10 min)
Special microwave equipment (MI-77, Azumaya, Tokyo, JAPAN) Variable Power (100W-500W) Irradiation time Intermittent irradiation mode
Microwave has voltex effect.
Apply red dye on the oil, calmly No MW irradiation (still standing) MW irradiation, 5min Not mixed Mixed
Caution! Antibodies are protein, which is easily denatured by high-temperature. Try to decide the best condition for the microwave irradiation
50ml water on the bottom of moist chamber 200μPBS+5%BSA
35 MW: power 250W, 300W, 350W (continuous irradiation) 50ml water on the bottom of moist chamber Temperature of the 200μliquid on the slide 30 25 20 15 250w 300w 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 350W; BSA was denatured within 5 minutes.
degree 35 MW: power 250W 50ml water on the bottom of moist chamber Temperature of the 200μliquid on the slide 30 25 20 15 10 continuous 5sec-on, 1sec-off 4sec-on, 2sec-off 4sec-on, 3sec-off 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Duration
Most suitable condition of irradiation to avoid excessive temperature increase 250W 4-seconds-on and 3-seconds-off
Immunostaining of cytokeratin (CK) 5/6 with intermittent microwave irradiation 5min 10min 30min Evaluation of specific positive reaction could be performed correctly in the specimen with 10 min irradiation
Advantage of microwave irradiation for antibodies incubation Incubation time: very short '10 min) Background: clear Non-specific reaction (NS) increase in proportion to incubation period (I.P.) NS=αxI.P.
Immunostaining of CD79a(Lymphnode) Low magnif. High magnif. 10min without MW 10 min with MW 60 min without MW
Immunostaining of cancer cells MIB-1 p53 10min without MW 10 min with MW 60 min without MW
同 じ 事 が 超 音 波 を 用 いてできないか? 抗 原 抗 体 反 応 を 超 音 波 を 用 いて 迅 速 化 する 方 法
複 数 の 抗 体 で 使 用 可 能
ホルマリン 固 定 パラフィン 包 埋 標 本 で 免 疫 染 色 がうまくいかない 時 1. 抗 体 のinformation sheetを 確 認 2. 抗 原 賦 活 法 を 変 えてみる 3. より 感 度 の 高 い 方 法 を 検 討 する 4. 抗 原 と 抗 体 のインキュベーションにマイクロウエーブや 超 音 波 を 試 す それでもダメなら 標 本 の 固 定 法 を 変 える'ホルマリン 4%PFA,アセトンなど( 抗 原 維 持 に 優 れた 各 種 固 定 法 を 試 す'AMEX HOPEなど( それでもダメなら 凍 結 標 本 でtry
皆 さんのご 研 究 で 免 疫 染 色 が 必 要 になった 場 合 は 遠 慮 なく 相 談 してください 診 断 用 研 究 用 の 各 種 抗 体 を 所 有 しています 試 し 染 色 が 必 要 な 場 合 はご 相 談 ください 病 理 診 断 用 の 免 疫 染 色 は 随 時 行 っています 見 学 等 が 必 要 な 場 合 はご 連 絡 ください 常 山 or 八 田 まで