(2) 脱 水 一 般 的 な 組 織 標 本 と 同 様 エタノール 系 列 およびキシレンにより 脱 水 する ただし エタノールの 作 用 時 間 の 延 長 は 自 家 蛍 光 の 消 失 を 招 くので 注 意 を 要 する 表 1.ラット 胎 仔 の 脚 をサンプルとする 場 合 の 脱

EFICによる 生 体 組 織 画 像 化 システム 2011/11/2 高 石 EFIC; Episcopic Fluorescence Image Capture Ⅰ.イメージングの 原 理 EFIC では 生 体 組 織 に 特 定 の 波 長 の 光 を 照 射 した 際 に 発 生 する 自 家 蛍 光 を 検 出 して 画 像 化 して いる 自 家 蛍 光 の 由 来 は ピリジンヌクレオチド ピリジン ニコチン 酸 ピリドキシン NADH 生 体 内 に 存 在 するピリジンヌクレオチドは NADH のみ( 単 なるピリジン 誘 導 体 である VB 3 (ニコチン 酸 ) VB 6 (ピリドキシンなど)も 自 家 蛍 光 に 寄 与 していると 思 われる) NADH は ATP 産 生 経 路 における 電 子 伝 達 担 体 であり すべての 細 胞 に 存 在 することから EFIC では 理 論 上 は 全 身 のあらゆる 組 織 を 対 象 とすることが 可 能 LacZ の 発 現 は 自 家 蛍 光 を 抑 制 する ミクロトームによる 薄 切 CCD カメラによる 撮 影 を 繰 り 返 し 得 られた 2D 画 像 の stack から 3D イメージに 再 構 築 Ⅱ. 画 像 を 得 るまでのプロセス ~ 前 処 理 から 撮 像 まで~ (1) 固 定 4%PFA EFIC サンプル 用 の 固 定 液 として 最 も 好 適 とされる 組 織 中 のピリジンヌクレオチドを 安 定 的 に 保 持 できるだけでなく 蛍 光 シグナルの 増 強 作 用 を 有 するため したがって 撮 像 時 の 露 光 時 間 を 短 縮 でき また 低 感 度 のカメラを 用 いた 場 合 でもシグナルを 検 出 しやすい リン 酸 緩 衝 ホルマリン 4%PFA ほど 著 しくはないが 蛍 光 シグナルを 増 強 する ピリジンヌクレオ チドの 保 存 性 にも 優 れる サンプルを 固 定 液 中 に 数 週 間 浸 漬 した 場 合 でも ほとんど 自 家 蛍 光 が 減 弱 しない 1

(2) 脱 水 一 般 的 な 組 織 標 本 と 同 様 エタノール 系 列 およびキシレンにより 脱 水 する ただし エタノールの 作 用 時 間 の 延 長 は 自 家 蛍 光 の 消 失 を 招 くので 注 意 を 要 する 表 1.ラット 胎 仔 の 脚 をサンプルとする 場 合 の 脱 水 包 埋 の 例 系 列 時 間 (min) 系 列 時 間 (min) 1 70%EtOH 20 8 100%EtOH 10 2 80%EtOH 20 9 Xylene-1 10 3 90%EtOH 20 10 Xylene-2 20 4 95%EtOH-1 10 11 Wax-1 20 5 95%EtOH-2 10 12 Wax-2 20 6 99%EtOH-1 10 13 Wax-3 Over night 7 99%EtOH-2 10 A B C D 図 1.ラット 20 日 齢 胎 仔 の 右 脚 の 脱 水 処 理 前 後 A,B: 脱 水 前. C,D: 脱 水 後 (3) 包 埋 一 般 的 に 用 いられるパラフィンを 包 埋 のメディウムとする 場 合 bleed through 現 象 が 問 題 にな る 2

EFIC ではミクロトームによりスライスされた 後 のサンプルブロックに 励 起 光 を 照 射 し 蛍 光 を 検 出 し ているが ブロックの 深 層 にある 組 織 から 発 せられた 蛍 光 シグナルが ブロック 表 面 からのシグナ ルと 同 時 に 検 出 されてしまうと 得 られる 2D 画 像 が 滲 んだように(=bleed through) 見 える これは 単 に 画 像 の 分 解 能 を 低 下 させるだけでなく 正 しい 3D 再 構 築 を 行 うに 当 たって 重 要 な 問 題 とな る 包 埋 メディウムの Wax に 赤 色 アニリン 染 料 である Sudan Ⅳを 添 加 することで bleed through は 効 果 的 に 抑 制 され 検 出 される 蛍 光 シグナルは 純 粋 にブロック 表 面 由 来 のものとなる Sudan Ⅳは 以 下 のような 理 由 で "bleed through"のブロッキング 剤 として 優 れている 1.サンプル 組 織 との 相 互 作 用 がほとんど 起 こらない 自 家 蛍 光 が 維 持 されやすい 2.Sudan Ⅳ 溶 解 Wax は 液 体 の 状 態 ではある 程 度 透 明 性 があるため 包 埋 時 にサンプルのオリ エンテーションを 決 めやすい Sudan Ⅳはパラフィンワックスに 難 溶 であるため 包 埋 用 メディウムに stearin が 添 加 される さら にメディウムと 溶 質 分 子 の 結 合 性 を 高 める 目 的 で vyber が 添 加 され これにより 1 μmのような 非 常 に 薄 い 薄 切 厚 で sectioning する 場 合 においてもブロックから 切 片 をきれいに 切 り 取 ることができる すなわちこれらの 添 加 物 は Z 軸 方 向 に 対 する 分 解 能 の 向 上 に 寄 与 している( 表 2) これらの 溶 質 の 添 加 により EFIC 包 埋 用 メディウムの 融 点 は 通 常 のパラフィンに 比 べ 高 温 となっ ている( 融 点 75 ) その 他 の 包 埋 方 法 として ポリエチレングリコール(PEG)やクリオスタットによる 包 埋 も 可 能 である これらを 使 用 した 場 合 に 得 られる 画 像 は Wax 包 埋 と 比 較 してコントラストが 弱 く 分 解 能 も 低 いが 失 われる 情 報 量 としては 軽 微 であり 要 求 される 包 埋 温 度 が 低 いことから(PEG : 45, クリオスタ ット: -65 ) タンパク 質 や RNA 発 現 についての 分 析 など 回 収 切 片 を 利 用 して 発 展 的 な 解 析 を 実 施 する 場 合 に 効 果 的 であると 思 われる 表 2.EFIC 包 埋 用 ワックスの 組 成 ( 山 田 重 人 先 生 がアメリカで 使 っていた 配 合 法 です) Paraffin 56.6g (70.4%) vyber 20.0g (24.9%) Stearic Acid 3.50g (4.40%) Sudan Ⅳ 0.35g (0.30%) Total 80.45g (100%) この Wax は 凝 固 すると 完 全 に 不 透 明 になるため ブロック 内 にサンプルがどの 位 置 オリエンテ ーションで 存 在 するのかが 外 から 見 てわからない 撮 影 時 に 適 切 なカメラポジションにサンプルを 配 置 することが 困 難 包 埋 皿 の 底 に 目 印 を 付 けた 方 眼 紙 を 敷 くことで 対 処 ( 図 2) 3

A B C D E F G H I 図 2. 包 埋 工 程 方 眼 紙 にサンプルのオリエンテーションが 分 かりやすいように 適 当 な 目 印 を 鉛 筆 で 記 入 し 包 埋 皿 の 底 部 に 敷 く(A) サンプルを 載 せて Wax を 注 ぎ 込 む(B, C) カセットを 包 埋 皿 の 上 に 載 せ さらに Wax を 注 ぐ(D) Wax が 完 全 に 凝 固 後 ブロックを 包 埋 皿 から 取 り 外 し(E, F) 方 眼 紙 を 剥 がす(G) ブロック 表 面 に 方 眼 紙 に 記 入 したマーク 跡 が 写 り(H) これをカメラ 撮 影 時 ポジショ ニングの 目 印 として 活 用 する 方 眼 紙 の 敷 き 方 が 悪 かった 場 合 の 失 敗 例 (I) (4)ミクロトーム 画 像 撮 影 システム ~ 滑 走 型 ミクロトーム Leica SM2500~ 図 3 図 4 4

ステージ( 図 4-d)にサンプルブロックを 固 定 ミクロトームは 滑 走 式 で ステージが 水 平 方 向 に 滑 走 することでブロックが 薄 切 される( 図 2) ステージはミクロスコープ( 図 4-c)の 真 下 で 停 止 し その 直 後 に 励 起 光 が 照 射 される CCD カメラで 撮 影 後 ステージは 再 び 刃 の 手 前 側 へと 戻 る これを ひたすら 繰 り 返 す 薄 切 厚 サンプルブロックの 刃 への 進 入 速 度 ストップポジションでの 停 止 時 間 などは 操 作 板 ( 図 3-1)で 設 定 する ミクロスコープには 光 源 ( 水 銀 ランプ; 図 3-2) フィルタ(GFP2, GFP3, YFP, DSR の 4 種 ; 図 4-b) CCD カメラ( 図 4-a)が 実 装 されている 光 源 からの 光 は 励 起 フィルタ 通 過 時 に 各 種 フィルタの 特 性 に 応 じて 特 定 の 波 長 領 域 の 光 のみが 選 択 的 に 透 過 して サンプルを 励 起 する これにより 自 家 蛍 光 が 発 生 し 自 家 蛍 光 波 長 のみを 選 択 的 に 透 過 させる 吸 収 フィルタを 介 して 蛍 光 シグナルを CCD カメラで 撮 影 する CCD カメラは PC( 図 3-4)と 連 動 しており PC 内 のソフトウェアにより 倍 率 露 光 時 間 ゲイン オ フセット 等 の 撮 影 環 境 を 調 整 する また 1 回 のセクショニングごとに これらのパラメータを 変 化 さ せた 複 数 の 条 件 で 撮 影 することが 可 能 である なお 撮 影 された 画 像 は PC 内 に 保 存 される すべてのセクションにおいて ステージは 全 く 同 じポジションで 停 止 するとともに ミクロスコープと サンプルブロック 表 面 との 距 離 も 常 に 一 定 である すなわち 得 られる2D 画 像 は 薄 切 面 に 垂 直 な 方 向 について 正 確 な 連 続 性 が 保 たれており このことは 三 次 元 化 処 理 に 際 して Z 軸 方 向 に 歪 み のない 再 構 成 画 像 が 得 られることを 意 味 する また 撮 影 対 象 は 薄 切 した 切 片 ではなくブロック 表 面 であるので X-Y 平 面 についてもヨレや 伸 縮 ひび 割 れなどが 生 じにくい Z 軸 方 向 の 分 解 能 は 薄 切 厚 に 依 存 するが 前 述 のように 1μ m での 薄 切 が 可 能 であることから その 分 解 能 は 十 分 に 高 いと 言 える X-Y 軸 方 向 の 分 解 能 は CCD カメラの 性 能 に 依 存 するが Hamamatsu Orca ER CCD camera の 場 合 理 論 上 の 最 大 値 は 0.6(μ m/pixel)である しかし 実 際 は 光 の 拡 散 等 によりこれより 低 くなる と 考 えられる 薄 切 により 得 られた 切 片 は HE 染 色 などの 従 来 の 組 織 染 色 に 適 用 することもできる( 図 5) 図 5. 薄 切 時 に 回 収 した 切 片 に 対 して HE 染 色 を 行 ったもの ( 左 ) 回 収 切 片 を 伸 展 後 スライドガラスに 乗 せた 状 態 ( 右 )HE 染 色 が 完 了 した 組 織 標 本 Wax は rehydration 系 列 のキシレンにより 洗 い 流 される 5

(5) EFIC Image view 蛍 光 コントラストについて 1. 蛍 光 の 由 来 は NADH NADH はすべての 細 胞 に 存 在 する 細 胞 密 度 の 高 い 組 織 ほど 蛍 光 強 度 が 大 きい( 図 6) 2. 蛍 光 の 由 来 は NADH ATP 産 生 が 活 発 で 代 謝 活 性 の 高 い 組 織 ほど 蛍 光 強 度 が 大 きい(?) 3. 赤 血 球 は 励 起 光 の 照 射 を 受 けて 非 常 によく 光 る 血 管 や 造 血 組 織 は 蛍 光 強 度 が 大 きい( 図 7) 4.LacZ の 発 現 は 自 家 蛍 光 を 消 失 させる(?) 図 6. 細 胞 密 度 が 高 いほど 蛍 光 強 度 が 大 きい ( 左 )ラット 20 日 齢 胎 仔 右 脚 膝 関 節 領 域 の EFIC 矢 状 断 画 像 ( 右 ) 左 の 画 像 で 黄 色 く 囲 った 部 分 の HE 染 色 像 高 intensity は 後 十 字 靱 帯 の 横 断 面 ( 大 腿 骨 顆 付 着 部 )で 周 囲 の 軟 骨 組 織 より 高 密 度 で 細 胞 が 分 布 しているため 蛍 光 強 度 が 強 い (F: 大 腿 骨, T: 頸 骨, P: 膝 蓋 骨, MM: 内 側 半 月 ) 図 7. 赤 血 球 はよく 光 る ( 左 )EFIC によるラット 16 日 齢 胎 仔 右 脚 の 矢 状 断 の 画 像 ( 中 央 ) 同 サンプルを HE 染 色 し たもの 左 画 像 の 赤 枠 に 対 応 する ( 右 ) 中 央 HE 画 像 の 青 枠 について 拡 大 したもの EFIC で 蛍 光 の 強 い 部 分 に 胎 児 性 赤 血 球 が 多 くみられる EFIC の 長 所 1. 分 解 能 が 高 く 2D 3D ともに 高 精 細 なイメージが 得 られる( 図 8) 2.2D stack の 再 構 成 により 得 られた 3D 立 体 像 は 任 意 の 断 面 について 切 断 可 能 ( 図 8) 3. 全 体 として 作 業 工 程 はさほど 煩 雑 でない 4.すべての 細 胞 が 自 家 蛍 光 能 を 有 するため 全 身 のあらゆる 組 織 を 対 象 にできる 6

1 2 3 4 5 図 8.20 日 齢 胎 児 の EFIC 処 理 例 1photograph 2EFIC 3D image 3EFIC 2D image( 矢 状 面 薄 切 面 ) 4EFIC 2D image( 水 平 面 ) 5EFIC 2D image( 前 額 面 ) EFIC の 短 所 1.セクショニング 時 間 が 長 い 2. 細 胞 レベルでの 観 察 ( 個 々の 細 胞 の 形 態 や 極 性 オルガネラの 観 察 など)は 不 可 能 3. 三 次 元 化 処 理 に 当 たって 血 球 の 存 在 が 作 業 の 障 害 となることがある 4. 日 中 に 長 時 間 暗 室 の 中 にいると 気 分 が 沈 む 7