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目 的 : 角 膜 移 植 手 術 において 拒 絶 反 応 は 予 後 に 影 響 する 最 も 大 きな 因 子 の 一 つであるが 現 在 のところ 拒 絶 反 応 の 出 現 を 予 測 することは 困 難 である 角 膜 の 免 疫 学 的 体 系 の 研 究 が 進 められているが 拒 絶 反 応 におけるメカニズムはいまだに 明 らかにされていない 角 膜 に 拒 絶 反 応 がおこったときの 免 疫 細 胞 の 活 性 の 状 態 は 前 房 水 のサイトカイン 濃 度 を 測 定 して 調 べる 間 接 的 な 方 法 があるが 涙 液 中 のサイトカイン 濃 度 にも 免 疫 細 胞 の 活 性 状 態 が 反 映 される 今 回 我 々は 涙 液 中 サイトカインの 経 時 的 変 化 を 調 べ 拒 絶 反 応 との 関 係 を 調 査 した 対 象 と 方 法 : 福 岡 大 学 病 院 において 2011 年 8 月 から 2012 年 9 月 までの 期 間 に 施 行 され た 角 膜 移 植 手 術 症 例 のうち 術 後 6 か 月 間 の 経 過 観 察 が 可 能 であった 連 続 症 例 30 人 31 眼 とした 全 層 角 膜 移 植 手 術 (penetrating keratoplasty: 以 下 PKP)25 例 層 状 角 膜 移 植 手 術 (lamellar keratoplasty: 以 下 LKP)6 例 および 正 常 対 象 18 例 を 対 象 とした 正 常 群 は 感 染 症 とアレルギーの 既 往 のない 健 常 者 ならびに 白 内 障 術 前 および 硝 子 体 術 前 の 症 例 とした 症 例 群 は 33 歳 から 85 歳 で 平 均 年 齢 は 64.23±14.60 ( 平 均 値 ± 標 準 偏 差 ) 歳 男 性 17 例 女 性 14 例 であった 正 常 群 は 29 歳 から 59 歳 で 平 均 年 齢 は 39.4±10.3 歳 男 性 8 例 女 性 10 例 であった 手 術 症 例 のまとめを 表 1 に 示 した 涙 液 採 取 および 抽 出 方 法 は 既 報 に 従 って 行 った 症 例 は 術 前 術 翌 日 術 後 7 日 術 後 1 か 月 術 後 3 か 月 術 後 6 か 月 にシルマー 法 による 濾 過 法 で 涙 液 を 採 取 した 涙 液 抽 出 はシルマー 紙 に 0.01M リン 酸 緩 衝 液 ph7.2 (0.5mol NaCl, 0.5% Tween 20) 100μl を 添 加 後 4 にて 一 晩 振 とうし 検 体 を 作 製 した サイトカインの 測 定 はベクトン デッ キンソン(BD) 社 の BD TM Cytometric Beads Array システム(CBA) を 用 い BD TM FACS Canto Ⅱにて 蛍 光 抗 体 法 による 多 項 目 同 時 解 析 を 行 った データ 解 析 は BD 社 の FCAP Array 解 析 ソフトを 使 用 した 解 析 対 象 は 7 項 目 のサイトカイン IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A とした 統 計 学 的 検 討 は Wilcoxon の 順 位 和 検 定 もしくは Mann-Whitney の U 検 定 にて 比 較 し 危 険 率 5 % 未 満 を 統 計 学 的 に 有 意 差 ありとした 本 研 究 は 福 岡 大 学 病 院 臨 床 研 究 審 査 委 員 会 の 承 認 を 得 て 行 った 結 果 : 正 常 群 のサイトカイン 濃 度 を 図 1 に 示 した 正 常 群 では IL-2 IL-4 IL-10 TNF は 5 pg/ml 以 下 と 低 い 値 であった この7つのサイトカインの 中 では IL-6 と IL-17A が 比 較 的 高 い 値 であり それぞれ 26 pg/ml, 21 pg/ml 以 上 であった 対 象 群 のサイトカイン 濃 度 の 変 化 を 図 2 に 示 した PKP と LKP のすべての 症 例 で 拒 絶 反 応 の 有 無 にかかわらず 術 翌 日 の IL-6 濃 度 が 術 前 に 比 べ 有 意 に 上 昇 (p<0.01 p<0.01 ) したが 他 のサイトカインは IL-6 のような 術 前 後 の 有 意 な 変 化 はなかった IL-6 は 術 後 1 か 月 で 術 前 値 ま で 低 下 し た が 拒 絶 反 応 群 で は 拒 絶 反 応 後 に 有 意 に 再 上 昇 し て い た (p<0.01) 拒 絶 反 応 は PKP の 術 後 1 か 月 で 1 例 3 か 月 で 2 例 6 か 月 で 1 例 みられた 6 か 月 間 の 拒 絶 反 応 の 発 症 率 は PKP 25 例 中 4 例 16%であった 拒 絶 反 応 群 と 拒 絶 反 応 のなかっ た 群 での 手 術 前 のサイトカイン 濃 度 の 比 較 検 討 では 拒 絶 反 応 群 は IL-2, IL-4, IL-10, TNF, IL-17A が 有 意 に 高 かった( p=0.0014, 0.0014, 0.0016, 0.0011, 0.0015) 特 に IL-10 は 拒 1

絶 反 応 のなかった 群 の 5 倍 以 上 の 濃 度 であった 一 方 で 拒 絶 反 応 群 は 拒 絶 反 応 の なかっ た 群 と 比 較 して 術 前 の IL-6, IFN-γ の 濃 度 が 有 意 に 低 かった(p=0.0016, 0.0016) 拒 絶 反 応 群 の 術 前 値 と 正 常 群 の 比 較 では 拒 絶 反 応 群 は IL-2, IL-6, IL-10, TNF, IL-17A が 有 意 に 高 く( p=0.0023, 0.0025, 0.0025, 0.0015, 0.0025) IL-4, IFN-γ は 有 意 に 低 かった (p=0.0025, 0.0025) 拒 絶 反 応 時 の 濃 度 を 正 常 群 と 比 較 すると IL-2, IL-6, TNF, IL-17A は 有 意 に 高 く( p=0.0023, 0.0025, 0.0016, 0.0025) IL-4, IL-10, IFN-γ は 有 意 に 低 かった ( p=0.0025, 0.0025, 0.0025) 拒 絶 反 応 群 の 涙 液 中 サイトカイン 濃 度 の 変 化 を 図 3 に 示 した 拒 絶 反 応 時 を 0 とし 拒 絶 反 応 がおこる 1 回 前 の 採 取 点 を-1 2 回 前 の 採 取 点 を-2 とした 左 図 は 拒 絶 反 応 出 現 前 の 濃 度 変 化 である 右 図 は 拒 絶 反 応 出 現 時 の 濃 度 変 化 で あ る IL-2, IL-4, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A は 拒 絶 反 応 が 起 こる 前 に 有 意 に 上 昇 し 拒 絶 反 応 が 起 きた 時 点 で 低 下 して いた( 各 々 p=0.028) 特 に IL-4 と IL-10 のサイトカイン 濃 度 は 拒 絶 反 応 がおこる 前 の 濃 度 の 1/10 以 下 に 著 しく 低 下 していた IL-6 のみ 拒 絶 反 応 の 出 現 前 も 出 現 時 も 濃 度 が 低 下 した IL-6 は 拒 絶 反 応 後 に 拒 絶 反 応 が な い 群 と 比 較 す る と 濃 度 が 上 昇 し て い た (p=0.0016) 結 論 : 涙 液 中 のサイトカイン 濃 度 は 個 人 差 が 大 きく 濃 度 だけでの 評 価 は 困 難 であった が 経 時 的 に 変 化 をみていくと 類 似 した 傾 向 が 見 られた 今 回 の 検 討 で 涙 液 中 のサイトカイン 濃 度 の 解 析 が 拒 絶 反 応 の 予 測 に 有 用 であると 思 われた 今 回 の 我 々の 結 果 をまとめると 術 前 に IL-2, IL- 6, IL-10, TNF, IL-17A が 正 常 群 より 高 い 症 例 は 拒 絶 反 応 をおこしやすく 注 意 を 要 する 術 後 IL-2, IL-4, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A と 多 種 のサイトカインが 上 昇 した 場 合 には 数 週 間 以 内 に 拒 絶 反 応 が 起 こることが 予 測 された 診 察 を 頻 回 に 注 意 深 く 行 い ステロイドや 免 疫 抑 制 剤 の 早 期 の 投 与 を 開 始 す ることができれば 拒 絶 反 応 が 予 防 できるのではない かと 考 えられた 今 後 さらなる 症 例 の 解 析 と 免 疫 学 的 解 明 が 必 要 である 2

審 査 の 結 果 の 要 旨 角 膜 移 植 手 術 において 拒 絶 反 応 は 予 後 に 影 響 する 最 も 大 きな 因 子 の 一 つであるが 現 在 のと ころ 拒 絶 反 応 の 出 現 を 予 測 することは 困 難 である 角 膜 の 免 疫 学 的 体 系 の 研 究 が 進 められている が 拒 絶 反 応 におけるメカニズムはいまだに 明 らかにされていない 角 膜 に 拒 絶 反 応 がおこった ときの 免 疫 細 胞 の 活 性 の 状 態 は 前 房 水 のサイトカイン 濃 度 を 測 定 して 調 べる 間 接 的 な 方 法 があ るが 涙 液 中 のサイトカイン 濃 度 にも 免 疫 細 胞 の 活 性 状 態 が 反 映 される 今 回 の 研 究 では 角 膜 移 植 が 施 行 された 31 症 例 の 涙 液 中 サイトカインの 経 時 的 変 化 を 調 べ 拒 絶 反 応 との 関 係 を 調 査 した 本 研 究 の 斬 新 さ 重 要 性 実 験 方 法 の 正 確 性 表 現 の 明 確 さ 審 査 委 員 との 主 な 質 疑 応 答 は 以 下 の 通 りである 1. 斬 新 さ 角 膜 移 植 と 拒 絶 反 応 におけるサイトカインの 報 告 は 過 去 にもあるが 拒 絶 反 応 を 予 測 する 方 法 はいまだ 解 明 されていない 前 房 水 中 のサイトカインや 動 物 モデルでの 組 織 片 におけるサイトカ インの 報 告 はあるが 角 膜 移 植 と 涙 液 中 のサイトカインについての 報 告 は 少 なく 今 回 のシルマ ー 方 で 涙 液 を 採 取 した 角 膜 移 植 前 後 の 報 告 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A につ いての 解 析 を 行 った 報 告 は 初 めてである 2. 重 要 性 角 膜 移 植 における 3 大 合 併 症 拒 絶 反 応 緑 内 障 感 染 症 のうち 拒 絶 反 応 は 予 後 に 大 きく 関 与 するが 術 後 1 割 から 3 割 の 頻 度 で 発 症 する 拒 絶 反 応 後 不 可 逆 的 な 変 化 が 起 きた 場 合 に は 再 移 植 手 術 しか 方 法 がない 拒 絶 反 応 を 未 然 に 防 ぐことができれば 将 来 有 用 である 本 研 究 では 種 々のサイトカインをモニタリングすることで 拒 絶 反 応 を 予 測 することが 可 能 であり 臨 床 応 用 として 予 防 的 にステロイドや 免 疫 抑 制 剤 の 投 与 をすることで 拒 絶 反 応 を 防 ぐことが 可 能 ではないかと 考 えられた 3. 研 究 方 法 の 正 確 性 本 研 究 ではアレルギー 性 結 膜 炎 における 涙 液 中 サイトカインの 測 定 方 法 を 応 用 しており 確 立 された 方 法 である 涙 液 の 長 さを 各 検 体 で 測 定 しシルマー 紙 の 余 分 な 断 端 を 切 除 後 すぐに-80 度 で 凍 結 した 涙 液 を 抽 出 するときに 解 凍 し 実 験 に 使 用 しており たんぱく 質 の 変 性 はないと 考 えられる シルマー 紙 の 長 さを 計 測 することで 涙 液 量 の 補 正 は 正 確 に 行 えた 抗 体 や 測 定 機 械 解 析 ソフト 等 も 実 績 のある 薬 品 や 機 械 を 用 いており 研 究 データは 正 確 であると 言 える 4. 表 現 の 明 確 さ 及 び 結 論 本 論 文 は 英 語 論 文 で 海 外 の 学 術 誌 に 投 稿 中 である 目 的 方 法 結 果 につては 明 確 かつ 詳

細 に 表 現 されている また 結 果 の 考 察 にあたっては 過 去 の 文 献 を 適 宜 引 用 し 適 切 に 行 われて いる 5. 主 な 質 疑 応 答 Q: シルマーによる 検 査 の 精 度 は 正 確 なのでしょうか A: 過 去 の 報 告 で 特 にアレルギー 性 結 膜 炎 の 分 野 ではシルマー 法 による 検 体 の 報 告 が 多 数 見 られます 日 本 大 学 の 庄 司 先 生 の 論 文 には シルマー1mm あたり 涙 液 が 1μl 抽 出 されると の 報 告 があります 既 報 の 報 告 に 基 づいて 行 っており 精 度 は 正 確 と 考 えます Q: 臨 床 応 用 への 使 用 は 可 能 でしょうか A: 今 回 の 研 究 で さまざまな 種 類 のサイトカインが 上 昇 した 後 に 拒 絶 反 応 が 起 きていました 涙 液 中 のサイトカインをモニタリングすることで 上 昇 の 傾 向 が 出 た 時 点 で 早 めにステロ イドの 内 服 や 免 疫 抑 制 剤 の 内 服 を 予 防 的 に 開 始 すれば 拒 絶 反 応 を 防 げるのではないかと 考 えます 臨 床 応 用 が 可 能 と 考 えます Q: 拒 絶 反 応 はどのように 診 断 したのですか A: 細 隙 顕 微 鏡 を 用 い 拒 絶 反 応 の 出 現 時 に 特 徴 的 な 角 膜 内 皮 の 白 色 の 混 濁 Khodadoust line の 有 無 や 浮 腫 また 臨 床 経 過 などから 総 合 的 に 判 断 し 診 断 しました Q: 涙 液 を 用 いる 意 味 はあるのでしょうか A: 角 膜 移 植 後 の 反 応 は 直 接 前 房 水 中 のサイトカインに 影 響 を 与 えることは 知 られているが 涙 液 中 のサイトカインにも 反 映 されると 考 え 本 研 究 を 行 いました Q: 再 移 植 例 の 感 作 はないのでしょうか A: 今 回 の 症 例 のうち 角 膜 移 植 の 原 因 が 拒 絶 反 応 後 の 再 移 植 症 例 が 1/3 程 度 ありましたが 拒 絶 反 応 の 出 現 群 には 再 移 植 症 例 が 1/4 しかなく 拒 絶 反 応 がおこりにくいというわけでは ありませんでした それぞれの 移 植 された 角 膜 に 対 して 拒 絶 反 応 がおこっており 感 作 はな いと 考 えます Q: 免 疫 抑 制 剤 の 治 療 の 実 際 は A: 基 本 的 には 拒 絶 反 応 出 現 時 にステロイドや 免 疫 抑 制 剤 の 投 与 を 開 始 しました 免 疫 抑 制 剤 の 副 作 用 もあるので 全 例 投 与 するわけではありません Q: 拒 絶 反 応 時 の 治 療 開 始 のタイミングはいつですか データへの 影 響 はないのでしょうか A: 本 研 究 では 拒 絶 反 応 の 起 きた 4 例 全 て 治 療 前 のタイミングで 涙 液 採 取 できました 全 例 投 薬 開 始 前 の 数 値 になります 拒 絶 反 応 がおこった 時 点 で まず 涙 液 を 採 取 し その 後 治 療 を 開 始 しました 今 回 偶 然 3 か 月 目 6 か 月 目 のタイミングでしたが その 間 に 拒 絶 反 応 が 起 きている 症 例 があったら 治 療 前 のデータではなくなり 投 薬 の 影 響 が 考 えられる ので より 採 取 の 間 隔 を 短 く 設 定 していた 方 がよかったと 思 いました Q: 患 者 さんは 術 後 の 不 安 を 抱 えていると 思 いますが 本 研 究 のために 涙 液 を 採 取 され さら に 間 隔 もあいていることはどうなのでしょうか A: 実 際 は 外 来 受 診 中 に 涙 液 を 集 めているだけで 全 例 2 週 間 から 最 低 でも 1 か 月 に 1 回 は 診 察 をしていました 不 調 時 はすぐに 来 院 するように 説 明 していますし 本 研 究 のために 来 院

間 隔 をあけていたということはありません Q: グラフで 拒 絶 反 応 はどれに 相 当 しますか 3 つしかないけど A: 全 て 平 均 値 でグラフを 表 記 しているので 3 か 月 の 拒 絶 反 応 群 のグラフは 2 症 例 の 平 均 値 になります Q: n=4で 言 えるのか A: 涙 液 中 のサイトカインは 個 人 差 が 非 常 に 大 きく 解 析 時 に 苦 労 した 点 です IL-6 や IL-10 を 分 母 にした 比 の 検 討 をしてみましたが データ 値 に 0 が 多 く 検 討 できませんでした 他 にも 術 前 値 を 引 く 方 法 や 術 前 値 との 比 で 検 討 しましたが 有 意 差 がでませんでした と ころが 拒 絶 反 応 時 を 0 とし その 前 を-1-2 として 比 較 すると 拒 絶 反 応 前 に 有 意 に 増 減 を 認 めており 4 例 でも 有 意 差 がでており 意 味 のある 結 果 だと 考 えています Q: 反 対 眼 の 涙 液 の 動 態 はどうでしょうか A: 今 回 実 際 には 両 眼 とも 採 取 して 検 討 しています 非 常 に 面 白 いことに 手 術 をしていな い 反 対 眼 でも 手 術 眼 と 同 様 に 涙 液 中 のサイトカインが 変 動 していました 眼 科 では 交 感 性 眼 炎 など 受 傷 眼 の 反 対 眼 に 炎 症 がおこることがあり 涙 液 中 でも 両 眼 同 じような 結 果 が 出 たことは 面 白 い 結 果 だと 思 います Q: 涙 液 中 のサイトカインはどこから 出 ているのでしょうか A: 細 胞 性 免 疫 液 性 免 疫 どちらからも 反 応 があり 胸 腺 や 種 々の 細 胞 からの 反 応 もあると 思 いますが 両 眼 のサイトカインが 類 似 の 傾 向 を 示 したことから 脳 への 信 号 が 伝 達 した 後 に フィードバックされて 両 方 の 涙 線 から 分 泌 されていると 考 えられます Q: 拒 絶 反 応 の 機 序 は A: 現 状 では 詳 細 な 機 序 はわかっておらず 解 明 がまたれるところです Q: サイトカインの 動 態 は A: 現 在 世 界 中 で 動 物 モデルを 使 って 解 明 しているところです 明 確 なサイトカインの 動 態 はわかっていません Q: 血 中 たんぱくの 影 響 はないのか A: 今 回 の 研 究 では 血 中 のたんぱく 質 の 検 査 はしていません 今 後 検 討 します ありがとう ございました 以 上 の 内 容 の 斬 新 さ 重 要 性 研 究 方 法 の 正 確 性 表 現 の 明 確 さ 及 び 質 疑 内 容 の 結 果 を 踏 ま え 審 査 員 で 討 議 の 結 果 本 論 文 は 学 位 に 値 すると 評 価 された