ヨーロッパザラボヤ 判 定 DNA 検 査 方 法 マニュアル Ver.5 作 成 日 :2013 年 4 月 30 日 ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa と 形 態 で 判 定 されたホヤについて これの DNA の Specific PCR や 塩 基 配 列 を 分 析 することによっても ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa と 判 定 することができる また 形 態 で 種 査 定 できなかったホヤについても DNA の Specific PCR や 塩 基 配 列 を 分 析 することによって 日 本 在 来 のザラボヤ Ascidia zara か ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa か またはその 近 縁 種 の Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. Scabra (A. scabra の 隠 蔽 種 )かを 判 定 できる DNA の 分 析 は ミトコンドリア DNA の CO1 遺 伝 子 を 利 用 した Specific PCR (Polymerase Chain Reaction)または PCR-ダイレクトシーケンシング 法 で 行 う 得 られた Specific PCR や DNA 塩 基 配 列 のパターンから 日 本 在 来 のザラボヤ Ascidia zara であるか ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa であるか またはその 近 縁 種 の Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra であるかを 判 定 する *PCR では 鋳 型 DNA が 微 量 存 在 しても 増 幅 される したがって 目 的 外 の DNA( 特 に PCR 増 幅 産 物 )の 混 入 に 注 意 を 払 う 必 要 がある また DNA は 人 間 の 皮 膚 表 面 から 分 泌 されている DNA 分 解 酵 素 (DNase)により 分 解 されるので 本 酵 素 の 混 入 を 防 止 しなければならない これ らの 点 を 考 慮 し 使 い 捨 てのチューブ チップ 等 を 使 用 し DNA や DNase 等 が 混 入 しないよう 注 意 して 用 いる 1. 試 料 の 準 備 検 査 に 用 いるホヤの 成 体 は 生 きている 個 体 を-20 以 下 で 冷 凍 する 試 料 は -20 以 下 に 冷 却 して 絶 命 させた 後 そのまま 冷 凍 保 存 する または 100%エタノールで 固 定 した 後 -20 で 保 存 する * 水 逆 浸 透 膜 精 製 した RO 水 又 は 蒸 留 水 を Milli-Q 等 で 17 MΩ/cm まで 精 製 した 超 純 水 をオートク レーブで 121 15 分 以 上 で 滅 菌 したものなど DNA DNase 等 が 混 在 していないもの 本 Specific PCR および PCR-ダイレクトシーケンシングによる 検 査 では 特 に 断 り 書 きがない 限 り このような 水 を 使 用 すること 2.DNA 抽 出 精 製 DNA 抽 出 にはいくつかの 方 法 があるが TNES(10 mm Tris-HCl ph 7.5; 125 mm NaCl; - 1 -
10 mm EDTA;1% sodium dodecyl sulfate (SDS))- 6 M Urea 緩 衝 液 とフェノール クロロホ ルムを 用 いた 抽 出 法 は 応 用 範 囲 が 広 く 魚 介 類 の DNA 抽 出 で 実 績 がある そこで 本 抽 出 法 について 以 下 に 記 す なお 市 販 の DNA 抽 出 キットでも DNA が 良 好 に 抽 出 できる 物 もあるため そのようなキットを 用 いて DNA を 抽 出 してもよい 2.1 TNES - 6 M Urea 緩 衝 液 とフェノール クロロホルムを 用 いた 抽 出 法 入 水 管 出 水 管 図 1 ホヤの 解 剖 図 被 嚢 を 取 り 去 り 腹 正 中 で 切 り 開 いたところ 図 1 の 四 角 部 分 の 筋 肉 組 織 をハサミとピンセットで 50 mg ほど 摘 出 する 摘 出 後 の 残 りの 検 体 *1 は-20 以 下 で 保 存 する 摘 出 した 筋 肉 組 織 を 500 μl の TNES 6 M Urea 緩 衝 液 の 入 った 1.5 ml マイクロチューブに 投 入 後 20 mg/ml の Proteinase K *2 を 10 μl 加 えて 軽 く 撹 拌 して 混 和 し 37 で 1 晩 静 置 する 攪 拌 する 際 は チューブの 蓋 に 緩 衝 液 が 付 かないよう 注 意 する 次 に 500 μl のフェノール クロロホルム *3 を 加 え 転 倒 混 和 後 ミキサーで 軽 く 攪 拌 し ローテーター にマイクロチューブを 設 置 する これを 10 rpm で 10 分 間 回 転 させて 攪 拌 した 後 15,000 rpm (>7,500 g)で 10 分 間 室 温 遠 心 する 水 層 ( 上 層 )を 新 しい 1.5 ml マイクロチューブに 移 す この 時 中 間 層 とフェノール クロロホルム 層 ( 下 層 )を 混 入 しないように 注 意 する 再 度 500 μl のフェノール クロロホルムを 加 え 上 記 と 同 様 に 攪 拌 遠 心 する 水 層 ( 上 層 )を 新 しい 1.5 ml マイクロチューブに 移 す この 時 中 間 層 とフェノール クロロホルム 層 ( 下 層 )を 混 入 しないように 注 意 する 4 に 冷 却 した 500 μl のジエチルエーテル *4 を 加 え 約 30 秒 転 倒 混 和 する なお ジエチルエーテルを 加 えた 直 後 は ジエチルエーテルが 白 濁 するが これが 元 の 透 明 色 に 戻 るまで 転 倒 混 和 する 15,000 rpm(>7,500 g)で 30 秒 室 温 遠 心 する ジエチルエー テル 層 ( 上 層 )を 取 り 除 き 専 用 の 廃 液 瓶 中 に 入 れる この 時 なるべく 水 層 ( 下 層 )を 混 入 し ないように 注 意 する 再 度 4 に 冷 却 した 500 μl のジエチルエーテルを 加 え 上 記 と 同 様 に 転 倒 混 和 遠 心 する ジエチルエーテル 層 ( 上 層 )を 取 り 除 き 専 用 の 廃 液 瓶 中 に 入 れる 次 に - 2 -
-20 に 冷 却 した 1 ml の 100%エタノールを 加 え -80 で 15 分 以 上 -20 で 1 時 間 以 上 静 置 す る 15,000 rpm(> 7,500 g)で 15 分 間 冷 却 遠 心 (4 )する マイクロチューブをゆっくり と 傾 けて 上 澄 み 液 を 捨 てる -20 に 冷 却 した 1 ml の 70%エタノールを 加 え 15,000 rpm(> 7,500 g)で 15 分 間 冷 却 遠 心 (4 )する 上 記 と 同 様 に 上 澄 み 液 を 捨 て 再 度 -20 に 冷 却 した 1 ml の 70%エタノールを 加 え 遠 心 する 上 記 と 同 様 に 上 澄 み 液 を 捨 て 2~3 分 間 真 空 乾 燥 あるいは 約 1 時 間 風 乾 する この 時 完 全 に 乾 燥 しないように 注 意 する 300 μl の 0.1 TE 緩 衝 液 *5 または TE 緩 衝 液 を 加 えて 軽 く 混 和 後 4 で 一 晩 静 置 して 完 全 に 溶 解 する その 後 しばら く 検 査 に 使 用 しない 場 合 や 長 期 保 存 する 場 合 は -20 以 下 で 保 存 する 本 抽 出 法 により 抽 出 した DNA 試 料 は RNA も 含 むが PCR 等 への 利 用 において 特 に 問 題 はない RNA を 分 解 する 場 合 は DNA を 完 全 に 溶 解 した 後 100 μg/ml の RNAse A *6 を 10 μl 加 えて 37 で 1 時 間 静 置 する *1 TNES (10 mm Tris-HCl, ph7.5; 125 mm NaCl; 10 mm EDTA; 1% sodium dodecyl sulfate (SDS)) - 6 M Urea 緩 衝 液 360g の Urea 10 ml の 1 M Tris (ph 7.5) 20 ml の 0.5 M EDTA 7.3 g の NaCl をビーカ ーに 入 れ 水 ( 滅 菌 してなくて 良 い)を 約 900 ml 加 え 加 温 しながらスターラーで 攪 拌 する Urea は 溶 解 すると 吸 熱 反 応 するため Urea が 完 全 に 溶 解 するまで 加 温 する 10 g の SDS を 少 量 ずつ 加 えて 溶 解 する 全 量 が 1,000 ml となるよう 水 ( 滅 菌 してなくて 良 い)を 加 えた 後 オ ートクレーブで 滅 菌 する 室 温 で 長 期 間 保 存 できる なお 市 販 の ISOHAIR(( 株 )ニッポン ジーン)を 使 用 しても 良 い *2 20 mg/ml の Proteinase K 20 mg/ml となるように 水 に 溶 解 し 分 注 して-20 で 凍 結 保 存 する 使 用 する 毎 に 溶 解 し 使 用 後 は 凍 結 保 存 する *3 フェノール クロロホルム 0.1% 8-hydroxyquinoline で 着 色 した 1 M Tris-HCl (ph 8.0) 飽 和 フェノールとクロロホルムを 1 : 1 (v/v)で 混 合 する 4 で 遮 光 保 存 する 有 害 であるので 手 袋 を 着 用 する 揮 発 物 を 吸 い 込 まない 等 して 取 り 扱 いの 際 は 注 意 する *4 ジエチルエーテル 有 害 な 有 機 溶 媒 であるので 揮 発 物 を 吸 い 込 まない 等 取 り 扱 いの 際 は 注 意 する *5 TE 緩 衝 液 各 最 終 濃 度 が 10 mm Tris-HCl (ph8.0) 1 mm EDTA (ph8.0)となるように 水 ( 滅 菌 してなく て 良 い)で 調 整 し オートクレーブで 滅 菌 する 室 温 で 保 存 できる *6 100 μg/ml の RNAse A 100 μg/ml となるように 水 に 溶 解 し 分 注 して-20 で 凍 結 保 存 する 使 用 する 毎 に 溶 解 し - 3 -
使 用 後 は 凍 結 保 存 する RNAse は 不 活 化 しにくい 酵 素 であり 除 染 が 難 しい そのため 実 験 室 内 に 拡 散 しないように 注 意 する 3 DNA 試 料 原 液 中 の DNA 純 度 の 確 認 並 びに DNA 試 料 液 の 調 整 と 保 存 上 記 抽 出 法 で 抽 出 した DNA は 特 に 問 題 なくそのまま PCR に 使 用 できるが 抽 出 した DNA の 純 度 と 濃 度 を 紫 外 部 吸 収 スペクトルを 測 定 して 算 出 する また 抽 出 した DNA が PCR の 鋳 型 として 利 用 できる 長 さであるか アガロースゲル 電 気 泳 動 で 確 認 する 3.1 紫 外 部 吸 収 スペクトルの 測 定 DNA 試 料 の 適 当 量 を 取 り 原 液 もしくは 必 要 に 応 じて DNA 溶 液 と 同 じ 溶 液 で 10~100 倍 希 釈 した 希 釈 液 について 200~300 nm の 範 囲 で 紫 外 部 吸 収 スペクトルを 測 定 し 230 nm 260 nm 及 び 280 nm の 吸 光 度 (O.D. 230 O.D. 260 O.D. 280)を 記 録 する 次 いで O.D. 260 が 1 のときの DNA 濃 度 を 50 ng/μl DNA として DNA 試 料 原 液 の DNA 濃 度 を 算 出 する また O.D. 260 / O.D. 280 を 計 算 する この 比 が 1.7~2.0 になれば DNA が 十 分 に 精 製 されていることを 示 す 得 ら れた DNA 濃 度 から DNA 試 料 原 液 を 以 後 の PCR に 必 要 な 濃 度 に 水 で 希 釈 して DNA 試 料 液 と し -20 以 下 で 冷 凍 保 存 する 冷 凍 保 存 した DNA 試 料 液 は 融 解 後 直 ちに 使 用 する なお DNA 試 料 原 液 の 濃 度 が PCR で 規 定 された 濃 度 (5 ng/μl~10 ng/μl)に 達 しないときは そのまま DNA 試 料 液 として 用 いる 3.2 アガロースゲル 電 気 泳 動 DNA 試 料 原 液 をアガロースゲル 電 気 泳 動 により 分 離 し 抽 出 した DNA のバンドを 確 認 する 3.2.1 アガロースゲルの 作 成 必 要 量 のアガロースを 秤 量 し TAE 緩 衝 液 *を 加 え 電 子 レンジ 等 で 加 熱 して 目 視 でアガロー スの 粒 子 が 全 く 確 認 できなくなるまで 溶 解 する 次 に ゲルを 50 前 後 まで 冷 やした 後 ゲルメ ーカーにゲルを 流 し 込 み 室 温 で 十 分 に 冷 やし 固 めてゲルを 作 成 する ゲルはすぐに 使 用 するの が 望 ましいが 緩 衝 液 に 浸 して 4 で 数 日 間 保 存 することもできる ゲルの 濃 度 は 500~10 kbp の DNA を 明 瞭 に 分 離 する 濃 度 とする * TAE 緩 衝 液 各 最 終 濃 度 が 40 mm Tris- 酢 酸 1 mm EDTA となるように 水 ( 滅 菌 してなくて 良 い)を 用 いて 調 整 したもの 3.2.2 電 気 泳 動 TAE 緩 衝 液 を 満 たした 電 気 泳 動 槽 にゲルをセットする DNA 試 料 原 液 (1~5 μl)と 適 当 量 のゲ ルローディング 緩 衝 液 を 混 ぜ 合 わせた 後 ゲルのウェルに 注 入 する また DNA 分 子 量 マーカー (λhind Ⅲ digestion 等 )を DNA 試 料 原 液 を 入 れたウェルの 両 隣 のウェルに 注 入 する(2~9 番 目 のウェルに DNA 試 料 原 液 を 入 れた 場 合 1 及 び 10 番 目 のウェルに DNA 分 子 量 マーカーを 入 - 4 -
れる) ゲルへの 試 料 注 入 に 時 間 がかかりすぎると DNA が 拡 散 し 鮮 明 な 結 果 が 得 られにくくな るので 注 意 する 次 に 100 V 定 電 圧 で 電 気 泳 動 を 行 い ゲルローディング 緩 衝 液 に 含 まれる BPB がゲルの 1/3~2/3 まで 進 んだところで 電 気 泳 動 を 終 了 する 3.2.3 ゲルの 染 色 ゲルが 浸 かる 量 の TAE 緩 衝 液 が 入 った 容 器 に 泳 動 後 のゲルを 移 し 入 れる 次 に 緩 衝 液 100 ml あたり 5 μl のエチジウムブロミド * 溶 液 (10 mg/ml)を 加 え 容 器 を 振 とう 器 に 乗 せて 軽 く 振 とうしながら 30 分 程 度 染 色 する * エチジウムブロミド 2 本 鎖 の DNA 鎖 の 間 に 入 り 込 む 蛍 光 試 薬 であり 強 力 な 発 ガン 作 用 と 毒 性 がある 取 り 扱 いに は 必 ず 手 袋 をはめ マスクを 着 用 する 3.2.4 ゲルイメージ 解 析 ゲルイメージ 解 析 装 置 内 のステージあるいはトランスイルミネーターのステージ 上 に 電 気 泳 動 と 染 色 が 終 了 したゲルをのせて 紫 外 線 (312 nm)を 照 射 する ゲルイメージ 解 析 装 置 の 画 面 ある いは 操 作 パソコンの 画 面 で 電 気 泳 動 パターンを 確 認 する 泳 動 結 果 は 画 像 データとして 保 存 して おく DNA 分 子 量 マーカーと 比 較 して DNA のバンドが 約 20 kbp 以 上 のところにあるのが 望 ましい 4 Specific PCR この 手 法 は 種 特 異 的 プライマー(Species Specific Primer SSP)を 用 いて PCR を 行 い (SSP-PCR) 種 を PCR 産 物 の 長 さの 違 いとして 見 分 ける 手 法 である 第 1 の Specific PCR で 日 本 在 来 のザラボヤ Ascidia zara であれば 226 bp ヨーロッパザラ ボヤ Ascidiella aspersa であれば 122 bp その 近 縁 種 の Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra であれば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる また 第 1 の Specific PCR で Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra と 判 定 された 場 合 第 2 の Specific PCR で Ascidiella scabra であれば 113 bp Ascidiella sp. aff. scabra であれ ば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる 第 1 の Specific PCR Specific PCR 反 応 液 は 14.2 μl の 水 2 μl の 10 緩 衝 液 *1 及 び 2.5 mm dntp *1 各 0.1 μl の 100 μm プライマー*2 計 7 種 類 0.1 μl (0.5units (U))の Taq DNA ポリメラーゼ *3 (5 U/μL)の 順 に 加 え これに 1 μl の DNA 溶 液 (20~50 ng/μl)を 加 えて 総 量 を 20 μl にする DNA 溶 液 以 外 の 緩 衝 液 等 を 1 本 のマイクロチューブ 等 で 必 要 量 調 整 した 後 0.2 ml PCR 反 応 チューブ 等 に 19 μl ずつ 分 注 しても 良 い なお PCR 反 応 液 の 調 整 は 反 応 液 の 温 度 が 上 がらないように 氷 上 等 で 行 う 次 に PCR 反 応 チューブ 等 を PCR 増 幅 装 置 *4 に 設 置 する PCR 反 応 は 先 ず 94 で 5 分 間 加 熱 し 次 に 94 で 30 秒 55 で 30 秒 72 で 1 分 間 のサイクルを 40 回 行 い 最 後 - 5 -
に 72 で 7 分 間 の 伸 長 反 応 を 行 った 後 4 で 保 存 する 得 られた 反 応 液 を PCR 増 幅 反 応 液 とす る *1 10 緩 衝 液 及 び 2.5 mm dntp DNA ポリメラーゼに 添 付 されているもの 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られる 物 を 用 いる *2 100 μm プライマー 100 μm になるよう 1/10 TE または TE に 溶 解 したもの 各 プライマーの 塩 基 配 列 は 以 下 の 通 りである なお 合 成 したプライマーは salt free 以 上 に 精 製 されていることが 望 ましい 第 1 の Specific PCR のためのプライマー scabra-f :5 -GGC TTC TTC CYC CTG CAT TC 3 (20 mer) ASW-FL :5 GGT TAC TCC CTC CGG CAT TT-3 (20 mer) zara-f :5 TCC TCC CCT TTC AAG AGG TG-3 (20 mer) aspersa-f2 :5 TTA ATT TCT TAG TGA CAA TGA TAG GT-3 (26 mer) Ascidiella-R :5 TGC AGC CAA CAC MGG AAG AG-3 (20 mer) zara-r :5 GGC AGC TAG CAC TGG CAA TG-3 (20 mer) ASW-R :5 CGC AGC CAA TAC GGG AAG AG-3 (20 mer) *3 Taq DNA ポリメラーゼ TaKaRa EX Taq DNA ポリメラーゼ(タカラバイオ 社 製 ) 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られるものを 用 いる *4 PCR 増 幅 装 置 Gene Amp PCR System 9700(アプライドバイオシステムズ 社 製 ) icycler サーマルサイク ラー(バイオ ラッドラボラトリーズ 社 製 ) 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られるものを 用 いる 4.1 電 気 泳 動 PCR 増 幅 反 応 液 をアガロースゲル 電 気 泳 動 により 分 離 し PCR 増 幅 した DNA 断 片 のバンドを 確 認 する 4.1.1 アガロースゲルの 作 成 3.2.1 アガロースゲルの 作 成 と 同 様 に 行 う 4.1.2 電 気 泳 動 3.2.2 電 気 泳 動 と 同 様 に 行 う なお PCR 増 幅 反 応 液 は 適 当 量 (1~3 μl) 使 用 し DNA 分 子 量 マーカーは 100bp DNA Step Ladder 等 を 用 いる - 6 -
4.1.3 ゲルの 染 色 3.2.3 ゲルの 染 色 と 同 様 に 行 う 4.1.4 ゲルイメージ 解 析 3.2.4 ゲルイメージ 解 析 と 同 様 に 行 う M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M 図 2 第 1 の Specific PCR の 電 気 泳 動 図 M:DNA 分 子 量 マーカー 上 から 2,000 bp 1,500 bp 1,000 bp 700 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp (100 bp 50 bp よく 分 離 されていない) 1~3:Ascidiella sp. aff. scabra 4~6:Ascidiella scabra 7~9:Ascidia zara 10~12:Ascidiella aspersa 13:DNA 無 し( 陰 性 対 照 区 ) 第 1 の Specific PCR で Ascidia zara であれば 226 bp ヨーロッパザラボヤ Ascidiella aspersa であれば 122 bp その 近 縁 種 の Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra であれば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる 第 2 の Specific PCR 第 1 の Specific PCR で Ascidiella scabra または Ascidiella sp. aff. scabra と 判 定 された 場 合 第 2 の Specific PCR で Ascidiella scabra であれば 113 bp Ascidiella sp. aff. scabra であれば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる Specific PCR 反 応 液 は 14.4 μl の 水 2 μl の 10 緩 衝 液 及 び 2.5 mm dntp 各 0.1 μl の 100 μm プライマー*1 計 5 種 類 0.1 μl (0.5 units (U))の Taq DNA ポリメラーゼ(5 U/μL)の 順 に 加 え これに 1 μl の DNA 溶 液 (20~50 ng/μl)を 加 えて 総 量 を 20 μl にする DNA 溶 液 以 外 の 緩 衝 液 等 を 1 本 のマイクロチューブ 等 で 必 要 量 調 整 した 後 0.2 ml PCR 反 応 チューブ 等 に 19 μl ずつ 分 注 しても 良 い なお PCR 反 応 液 の 調 整 は 反 応 液 の 温 度 が 上 がらないように 氷 上 等 で 行 う 次 に PCR 反 応 チューブ 等 を PCR 増 幅 装 置 に 設 置 する PCR 反 応 は 先 ず 94 で 5 分 - 7 -
間 加 熱 し 次 に 94 で 30 秒 55 で 30 秒 72 で 1 分 間 のサイクルを 40 回 行 い 最 後 に 72 で 7 分 間 の 伸 長 反 応 を 行 った 後 4 で 保 存 する 得 られた 反 応 液 を PCR 増 幅 反 応 液 とする *1 100 μm プライマー 100 μm になるよう 1/10TE または TE に 溶 解 したもの 各 プライマーの 塩 基 配 列 は 以 下 の 通 り である なお 合 成 したプライマーは salt free 以 上 に 精 製 されていることが 望 ましい 第 2 の Specific PCR のためのプライマー scabra-f :5 -GGC TTC TTC CYC CTG CAT TC 3 (20 mer) ASW-FS :5 CCA TAA TAG GCA TGA AGG CC-3 (20 mer) ASW-FS2 :5 CCA TAA TAG GCA TGA AGG CT-3 (20 mer) Ascidiella-R :5 TGC AGC CAA CAC MGG AAG AG-3 (20 mer) ASW-R :5 CGC AGC CAA TAC GGG AAG AG-3 (20 mer) 電 気 泳 動 については 第 1 の Specific PCR と 同 様 に 行 う M 1 2 3 4 5 6 7 図 3 第 2 の Specific PCR の 電 気 泳 動 図 M:DNA 分 子 量 マーカー 上 から 2,000 bp 1,500 bp 1,000 bp 700 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp (100 bp 50 bp よく 分 離 されていない) 1~3:Ascidiella sp. aff. scabra 4~6:Ascidiella scabra 7:DNA 無 し( 陰 性 対 照 区 ) 第 2 の Specific PCR で Ascidiella scabra であれば 113 bp Ascidiella sp. aff. scabra であれば 305 bp の PCR 産 物 が 得 られる 5 PCR-ダイレクトシーケンシング Specific PCR の 判 定 では 不 十 分 と 考 えられる 場 合 や Specific PCR では 判 定 が 出 来 なかった 場 合 には 直 接 シーケンシングして Blast 検 索 等 を 行 い 自 分 の 求 めた 塩 基 配 列 がデータベース 上 - 8 -
のどの 配 列 と 最 も 相 同 性 が 高 いかを 調 べることが 出 来 る 5.1 CO1 の PCR PCR 反 応 液 は 14.7 μl の 水 2 μl の 10 緩 衝 液 *1 及 び 2.5 mm dntp *1 各 0.1 μl の 100 μm プライマー*2 計 2 種 類 0.1 μl (0.5 units (U))の Taq DNA ポリメラーゼ *3 (5 U/μL)の 順 に 加 え これに 1 μl の DNA 溶 液 (20~50 ng/μl)を 加 えて 総 量 を 20 μl にする DNA 溶 液 以 外 の 緩 衝 液 等 を 1 本 のマイクロチューブ 等 で 必 要 量 調 整 した 後 0.2 ml PCR 反 応 チューブ 等 に 19 μl ずつ 分 注 しても 良 い なお PCR 反 応 液 の 調 整 は 反 応 液 の 温 度 が 上 がらないように 氷 上 等 で 行 う 次 に PCR 反 応 チューブ 等 を PCR 増 幅 装 置 *4 に 設 置 する PCR 反 応 は 先 ず 94 で 5 分 間 加 熱 し 次 に 94 で 30 秒 55 で 30 秒 72 で 1 分 間 のサイクルを 40 回 行 い 最 後 に 72 で 7 分 間 の 伸 長 反 応 を 行 った 後 4 で 保 存 する 得 られた 反 応 液 を PCR 増 幅 反 応 液 とする *1 10 緩 衝 液 及 び 2.5 mm dntp DNA ポリメラーゼに 添 付 されているもの 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られる 物 を 用 いる *2 100 μm プライマー 100 μm になるよう 1/10TE または TE に 溶 解 したもの 各 プライマーの 塩 基 配 列 は 以 下 の 通 り である なお 合 成 したプライマーは salt free 以 上 に 精 製 されていることが 望 ましい CO1 の PCR 増 幅 のためのプライマー 対 Asc,CO1-ForA 5' TTA TTC GSS TYG AGT TAT CTC A 3' (22mer) Asc,CO1-RevA 5' TCA AAY AGA AGC ATW GTR ATA GC 3' (23mer) 484 bpのpcr 産 物 (プライマーを 除 く)が 得 られる 場 合 がある または Asc,CO1-ForC 5 TTA TTC GGG TTG AGT TAT CTC A 3 (22mer) Asc.CO1-RevC 5 TCA AAA AGA AGC ATA GTA ATA GC 3 (23mer) 484 bpのpcr 産 物 (プライマーを 除 く)が 得 られる (Ascidiella scabraはこのプライマー 対 でのみPCR 増 幅 される) または LCO1490Asc 5 TGT CMA CWA AYC ATA ARG ATA TTG G 3 (25mer) HCO2198Asc 5 TAS ACC TCS GGR TGS CYA AAA AAC CA 3 (26mer) 657 bp(ascidiella aspersa Ascidiella sp. aff. scabra)の PCR 産 物 (プライマーを 除 く)が 得 られる 場 合 がある または LCO1490 5 GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3 (25mer) HCO2198 5 TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 3 (26mer) 657 bp の PCR 産 物 (プライマーを 除 く)が 得 られる (Ascidia zara はこのプライマー 対 でのみ PCR 増 幅 される) - 9 -
プライマーの 配 置 図 CO1 遺 伝 子 ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ LCO1490Asc-> <-HCO2198Asc LCO1490 -> <-HCO2198 Asc.CO1-ForA-> <-Asc.CO1-RevA Asc.CO1-ForC-> <-Asc.CO1-RevC *3 Taq DNA ポリメラーゼ TaKaRa EX Taq DNA ポリメラーゼ(タカラバイオ 社 製 ) 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られるものを 用 いる *4 PCR 増 幅 装 置 Gene Amp PCR System 9700(アプライドバイオシステムズ 社 製 ) icycler サーマルサイク ラー(バイオ ラッドラボラトリーズ 社 製 ) 又 は 同 等 の 結 果 が 得 られるものを 用 いる PCR 反 応 後 の 電 気 泳 動 については 4.Specific PCR に 記 載 した 通 りに 行 う 5.2 ExoSAP-IT*を 用 いた PCR 産 物 の 精 製 PCR による 増 幅 を 確 認 できたら PCR の 増 幅 産 物 1 サンプルあたり 0.1 μl の ExoSAP-IT が 入 るようにミリ Q 水 で 希 釈 調 整 した 溶 液 を PCR 産 物 に 加 える < 例 >96 サンプルで 96 穴 プレートを 使 用 の 場 合 ( 少 し 多 めに 調 整 ) 9.6 μl の ExoSAP-IT を 288 μl のよく 冷 やしたミリ Q 水 に 加 え 泡 立 てないようによくピペ ッティングした 後 各 サンプルの 壁 面 に 3 μl ずつ 8 連 ピペットで 加 える シリコンマットを 乗 せて 蓋 をした 後 プレートの 壁 面 についた 滴 を 完 全 に 落 とすため 遠 心 機 で 軽 く 回 す サーマルサイクラーを 用 いて 37 (30 min) 80 (15 min)で 処 理 する 増 幅 した PCR 産 物 の 濃 度 が 濃 い 場 合 は ExoSAP-IT で 処 理 した PCR 産 物 にミリ Q を 10~30 μl 程 加 えて 希 釈 する 場 合 もある * 極 めて 熱 に 弱 いデリケートな 酵 素 を 用 いるため 扱 いには 特 に 注 意 する 常 温 に 放 置 したり チ ューブの 下 の 方 を 直 に 手 で 持 ったりしない 5.3 シーケンス 反 応 の 反 応 系 シーケンス 反 応 にはいくつかの 企 業 がキットを 販 売 しているが ここでは BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ 社 )を 例 に 述 べる 反 応 液 は 以 下 の 通 り 調 整 する - 10 -
1 サンプルあたり 96 サンプルの 場 合 Template* 1 0.5 μl Bdmix * 3 0.3 μl 28.8 μl 5 Buffer* 4 2 μl 192 μl DW 7.2 μl サンプル 数 (96) 691.2 μl 5μM Primer* 2 0.5 μl 48 μl Total 10.5 μl 1,008 μl *1 Template ExoSAP-IT で 精 製 した PCR 産 物 *2 Primer は 5 μm にミリ Q で 希 釈 濃 度 はその 都 度 必 ず 確 認 する *3 Bdmix は BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit の Reaction Mixture *4 5 Buffer は BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit に 付 属 している 5.4 サーマルサイクラーの 設 定 上 記 サーマルサイクラーを 用 いてシーケンス 反 応 を 以 下 の 通 り 行 う {96 (10sec) 50 (5sec) 60 (4min)} 30 サイクル 4 forever 5.5 シーケンス 反 応 産 物 の 精 製 (エタノール 沈 殿 ) 10 μl の 反 応 産 物 が 入 ったウェルへ 125 mm EDTA 5 μl を 8 連 ピペットで 加 える リザーバーと 8 連 ピペットを 用 いて 冷 凍 庫 のよく 冷 えた 100 %エタノールを 50 μl 加 え 白 いシリコンマットをセットする プレート 攪 拌 機 で 5 秒 間 ほどプレートごとよく 撹 拌 させる プレート 遠 心 機 用 のプレート 台 にセットして 2,150 g 45 min で 遠 心 をかける 遠 心 済 みのプレートを 取 り 出 し 流 しで 上 清 液 を 捨 てる ( 一 回 で 一 気 に 上 清 液 を 捨 てる 絶 対 にプレートを 裏 返 してはならない) プレートを 下 に 向 けてキムタオルに 乗 せ 軽 めに 遠 心 をかけて(50 g で 1 分 ) 壁 面 の 残 った エタノールをキムタオルへ 完 全 に 吸 わせる リザーバーと 8 連 ピペットを 用 いて 冷 凍 庫 のよく 冷 えた 70%エタノールを 50 μl 加 え 白 いシリコンマットをセットする プレート 遠 心 機 用 のプレート 台 にセットして 1,700 g 15 min で 遠 心 をかける 遠 心 済 みのプレートを 取 り 出 し 流 しで 上 清 液 を 捨 てる プレートを 下 に 向 けてキムタオルに 乗 せ 軽 めの 遠 心 で(50 g で 1 分 ) 壁 面 のエタノールを キムタオルへ 完 全 に 吸 わせる 白 いシリコンマットをセットして アルミホイルで 遮 光 して 冷 凍 庫 で 保 存 5.6 シーケンサーへセット(ABI3100 ABI3130xl genetic analyzer の 場 合 ) エタ 沈 済 みサンプルプレートの 各 ウェルに HiDi-ホルムアミドを 10 μl ずつ 加 える プレートごと 10 秒 間 VORTEX をかける - 11 -
遠 心 して 壁 面 についている 液 を 落 とす サーマルサイクラーで 92 2 分 のヒートショック すぐにアルミホイル 等 で 遮 光 して 氷 冷 シーケンサーにセット ABI3100 ABI3130xl genetic analyzer のマニュアルに 従 ってシーケンス 取 得 波 形 データと 塩 基 配 列 データが 得 られる 5. 7 結 果 の 判 定 1- 分 子 系 統 樹 の 作 成 分 子 系 統 樹 作 成 ソフトウェア MEGA5 を install する 次 の 配 列 を 国 際 DNA データベースからダウンロードしたり コピー&ペーストして マルチ ファスタ 形 式 に 並 べる Ascidiella aspersa cytochrome oxidase subunit I mitochondrial pseudogene, partial sequence. (AY116600) Ascidia zara cytochrome oxidase subunit I mitochondrial gene, partial sequence AACAGGTATGGTTATTGGAGATGGTCATACTTACAATGTTATTGTTACTGCCCATGCGTT TGTTATAATTTTTTTTTTTGTTATACCCACAATGATTGGGGGTTTTAGGAATTGGCTCTT GCCTATGATAGTTAGAGCTCCGGATATAGCCTTTCCTCGATTAAATAATATGAGCTTCTG GCTTTTGCCTCCAGCATTTTTTTTTATAGTTATCTCTACCTTAATGGGTAGGGGTGCAAG AACGGGATGAACTGTTTATCCTCCCCTTTCAAGAGGTGTGGCCCACAGCGGTCCTGCAGT GGATTTTGCTATTTTTTCCCTCCATCTTGCTGGTATTTCGAGCATTCTAGGATCTATTAA TTTTCTTGTTACTATGTGGAATATGAAGGCTAAGGGTATAGAGGCCTATCATATTAGTTT GTTCTGTTGGTCAGTTATCTTTACTACCATCCTTCTAGTGCTGTCATTGCCAGTGCTAGC TGCC Ascidiella scabra cytochrome oxidase subunit I mitochondrial gene, partial sequence GCCGGGTCAGGTGATTAGGGATGGTCAGGTCTATAACGTGGTCGTGACTGCTCATGCTTT TGTTATGATTTTTTTCTTTGTTATGCCCATTATGATTGGTGGGTTTGGTAATTGGTTGTT ACCTATGATAGTAGGGGCTCCGGATATGGCTTTCCCTCGTATGAATAATATGAGTTTTTG GTTACTCCCTCCGGCATTTTTTATGTTGATTATTTCTTCTGTTATTGGGAGTGGAGCAGG TACGGGGTGGACAGTATATCCACCGCTTTCTAGCAATCTAGCCCACGCGGGCCCTGCTGT TGATTGTGCTATTTTTTCTTTACACCTAGCCAGAGTTTCAAGTATTCTTGGGTCTATTAA TTTTTTAGTAACCATAATAGGCATGAAGGCTAAGGGGTTCAGTTACTTGAATTTGAGTTT ATTTTGTTGGTCTGTTATTTTTACTACTATTTTGTTGGTGCTTTCTCTTCCCGTATTGGC TGCG Ascidiella sp. aff. scabra cytochrome oxidase subunit I mitochondrial gene, partial sequence ACCTGGGCAGGTTATTGGTGACGGTCAAGTATATAATGTGGTGGTGACGG - 12 -
CCCATGCCTTTGTTATGATCTTTTTTTTTGTTATGCCCATTATAATTGGT GGGTTTGGGAATTGGTTATTACCTATGATAGTTGGGGCTCCGGATATGGC TTTTCCTCGTATAAATAATATGAGTTTTTGGCTTCTTCCCCCTGCATTCT TTATGTTGATTATTTCTTCTGTGATTAGGACCGGGGCTGGGACGGGGTGG ACAGTATATCCCCCTCTGTCAGGCAACTTAGCCCACGCTGGCCCTGCTGT TGATTGTGCAATTTTTTCTTTACACTTGGCGGGTGTTTCTAGCATTCTCG GGTCTATTAATTTCTTAGTGACGATAATGGGAATAAAAGCACGGGGTTTT AGTTATTTAAATTTAAGTTTATTTTGTTGGTCTGTAATTTTTACTACTAT TTTGTTGGTGCTTTCTCTTCCTGTGTTGGCTGCA ( 自 分 の 決 めた CO1 の 配 列 1) ( 自 分 の 決 めた CO1 の 配 列 2) MEGA5 Align Edit/Build Alignment Create a new alignment OK を 選 択 Are you building a DNA or Protein sequence alignment? で DNA を 選 択 Alignment explorer が 表 示 されるので マルチファスタ 形 式 に 並 べた 配 列 をコピー ペースト する Alignment Align by CLUSTAL W を 選 択 パラメータが 表 示 されるので OK を 押 すと 自 動 的 に Alignment を 行 う Alignment が 終 わったら 名 前 を 付 けてデータを 保 存 する 具 体 的 には Data Exit AlnExplorer Closing Alignment Explorer. Would you like to save the current alignment session to file? と 表 示 されるので はい を 選 択 し ファイル 名 を 入 力 し て 保 存 する(MAS ファイル) Data Open A File/Session を 選 択 し 保 存 してある MAS ファイルを 選 択 して 開 く How would you like to open this MAS file? と 聞 いて 来 るので Analyse を 選 択 MEGA5 のウィンドウの Phylogeny を 選 び 表 示 されるタブから Construct/Test Minimum-EvolutionTree を 選 ぶ Would you like to use the currently active data? と 聞 いて 来 るので Yes を 選 択 選 択 肢 が 表 示 されるので Model/Method から Kimura 2 parameter model を 選 択 する Compute を 押 すと 系 統 樹 が 計 算 される 自 分 の 決 定 した CO1 の 配 列 が Ascidiella aspersa Ascidiella scabra Ascidiella sp. aff. scabra Ascidia zara に 近 縁 であるか 系 統 樹 から 判 断 する 5.8 結 果 の 判 定 2-Blast 検 索 結 果 の 判 定 1 で 自 分 の 決 定 した CO1 の 配 列 が Ascidiella aspersa Ascidiella scabra Ascidiella sp. aff. scabra Ascidia zara のいずれにも 該 当 しないことが 判 明 した 場 合 国 際 DNA データベースに 自 分 の 決 定 した 配 列 を 投 入 して Blast 検 索 し 最 も 相 同 性 の 高 い 配 列 がどの 種 の 配 列 であるかを 調 べることが 出 来 る - 13 -
DNA データベースにアクセスする http://www.ddbj.nig.ac.jp 左 横 の 検 索 欄 の BLAST をクリック 自 分 の 配 列 を 検 索 配 列 データのところにコピー&ペーストする 検 索 結 果 を WWW で 見 るか E-mail で 見 るか 選 択 する 検 索 対 象 DIVISION で Standard divisions の 無 脊 椎 動 物 以 外 のチェックを 全 て 消 す より 詳 細 な 設 定 を 適 当 にセットする 検 索 開 始 ( 入 力 内 容 の 送 信 をクリックする) 例 自 分 の 配 列 が 以 下 のような 100 bp であるとき tttggttttttggccaccctgaagtttatatcctcatcttacctaggtttggtataatcagccatgtggta gttttctattcaagaaagcctaatatttt Blast 検 索 の 結 果 は Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value U21670 U21670.1 Ascidia mentula cytochrome oxidase subunit I (CO... 198 3e-49 EF057731 EF057731.1 Pseudachorutinae sp. RCG-2004 haplotype 18 c... 84 1e-14 GU937470 GU937470.1 Scutovertex sp. 'ianus' isolate SianSch6 cyt... 70 2e-10 GU937466 GU937466.1 Scutovertex sp. 'ianus' isolate SianSt1 cyto... 70 2e-10 AB608870 AB608870.1 Neomicropteryx bifurca mitochondrial COI gen... 68 6e-10 GQ488184 GQ488184.1 Stylocellus sp. Peninsula 5 voucher MCZ DNA1... 68 6e-10 FJ913762 FJ913762.1 Neoconocephalus triops isolate NtTT5 cytochr... 68 6e-10 FJ913761 FJ913761.1 Neoconocephalus triops isolate NtTT4 cytochr... 68 6e-10 FJ913760 FJ913760.1 Neoconocephalus triops isolate NEtrioPR3 cyt... 68 6e-10 FJ913759 FJ913759.1 Neoconocephalus triops isolate NEtrioPR1 cyt... 68 6e-10 となり U21670 が 最 も 高 い Score と 圧 倒 的 に 小 さい E-value を 持 つことがわかる 先 頭 の U21670 のリンクを クリックすると LOCUS AMU21670 205 bp DNA linear INV 03-SEP-2002 DEFINITION Ascidia mentula cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product. ACCESSION U21670 と 表 示 されることから 自 分 の 塩 基 配 列 は Ascidia mentula の CO1 との 相 同 性 が 高 いことがわかる スコアの 198 (bits)をクリックすれば >U21670 U21670.1 Ascidia mentula cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product. Length = 205 Score = 198 bits (100), Expect = 3e-49-14 -
Identities = 100/100 (100%) Strand = Plus / Plus Query: 1 tttggttttttggccaccctgaagtttatatcctcatcttacctaggtttggtataatca 60 Sbjct: 21 tttggttttttggccaccctgaagtttatatcctcatcttacctaggtttggtataatca 80 Query: 61 gccatgtggtagttttctattcaagaaagcctaatatttt 100 Sbjct: 81 gccatgtggtagttttctattcaagaaagcctaatatttt 120 のように 相 同 性 検 索 の 結 果 が 示 される このケースでは 相 同 性 (Identities)は 100%であった 執 筆 者 独 立 行 政 法 人 水 産 総 合 研 究 センター 中 央 水 産 研 究 所 水 産 遺 伝 子 解 析 センター 大 原 一 郎 問 い 合 わせ 独 立 行 政 法 人 水 産 総 合 研 究 センター 中 央 水 産 研 究 所 業 務 推 進 課 236-8648 神 奈 川 県 横 浜 市 金 沢 区 福 浦 2-12-4 TEL:045-788-7615( 代 表 ) FAX:045-788-5001-15 -