[PDF] Biacore 3000 ver3 日本語マニュアル

Biacore3000 Ver.3 JJ-3012-01 (71-3128-32)

目 次 1. セットアップ 1 1-1 電 源 およびソフトウェアの 起 動 1 1) 電 源 の 立 ち 上 げおよび 緩 衝 液 の 準 備 1 2)BIACORE コントロールソフトウェアの 起 動 2 1-2 システムの 初 期 化 3 1)Dock(センサーチップの 挿 入 ) 3 2)Prime 5 3)ラックベースの 設 定 7 4) 温 度 設 定 9 5)Normalize 10 2. 基 本 操 作 11 2-1 サンプルのインジェクト 11 2-2 レポートポイントの 取 り 方 14 2-3 ファイルの 保 存 17 3.リガンドの 固 定 化 18 3-1 プレコンセントレーションの 検 討 (マニュアル 操 作 ) 21 3-2 プログラム 操 作 によるリガンドの 固 定 化 24 1)ファイルの 呼 び 出 し 24 2)Method の 編 集 28 3)エラーの 検 索 29 4)プログラムの 実 行 30 5)プログラムの 終 了 32 3-3 MANUAL INJECT を 用 いた 固 定 化 量 の 調 節 方 法 35 4. 相 互 作 用 の 検 討 40 4-1 マニュアル 操 作 による 相 互 作 用 の 検 討 41 4-2 プログラムによる 相 互 作 用 の 検 討 50 1)ファイルの 呼 び 出 し 5 2)Method の 編 集 52 3)エラーの 検 索 52 4)プログラムの 実 行 52 5)プログラムの 終 了 52 4-3 ファイルの 保 存 様 式 53 5. シャットダウン 54 5-1 実 験 の 終 了 54 5-2 センサーチップの 抜 き 取 り(Undock) 55 5-3 センサーチップの 保 存 55

6. メンテナンス 56 6-1 メンテナンス 56 6-2 Air の 除 去 57 6-3 流 路 系 に 詰 まりがあるとき 58 6-4 システムチェック 59 7. データ 管 理 62 1)My Computer から 作 成 する 方 法 62 2)Explore から 作 成 する 方 法 63 8.プログラムの 説 明 64 ステップ1) MAIN ボックス 64 ステップ2) APROG ボックス 65 ステップ3) レポートポイント 68 ステップ4) DETECTION と FLOWPATH 72 ステップ5) 固 定 化 のプログラム 75 ステップ6) 相 互 作 用 のプログラム 82 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 87 9-1 Surface preparations 89 9-1-1 ph スカウティング 89 9-1-2 Immobilization( 固 定 化 操 作 ) 96 9-1-3 Regeneration scouting( 再 生 条 件 検 討 実 験 ) 111 9-1-4 Surface performance test 117 9-2 Binding analysis( 特 異 的 結 合 実 験 ) 122 9-3 Kinetic analysis 128 9-3-1 Concentration series 128 9-3-2 Control experiments( 各 種 コントロールの 実 験 ) 135 1)Mass transfer control 135 2)Linked Rreaction のチェック 140 9-4 Customer Application wizard 145 9-4-1 アイコンの 説 明 146 9-4-2 基 本 操 作 147 ステップ1)1 個 のアナライトについての 分 析 147 ステップ2) 複 数 個 のアナライトについての 分 析 158 ステップ3)If/Then を 使 用 した 再 生 の 操 作 省 略 162 ステップ4) 実 験 途 中 で 流 路 (FLOWPATH)や 流 速 を 変 更 する 164 ステップ5) 濃 度 測 定 166 9-5 Wizard Template について 172 1) アルデヒドカップリング 法 173 2) HPA センサーチップカップリング 法 178 3) リガンドチオールカップリング 法 183

1.セットアップ 1 1.セットアップ 1-1. 電 源 およびソフトウェアの 起 動 1) 電 源 の 立 ち 上 げおよび 緩 衝 液 の 準 備 電 源 安 定 化 装 置 プリンター モニター 画 面 システム 本 体 コンピ ューター の 順 番 に 電 源 を 入 れる 本 体 のフロントパネル 上 の 左 にあるインジケータ(ライト)が 点 灯 し 30 秒 程 でリセット 後 新 たに 必 要 事 項 のみが 点 灯 あるいは 点 滅 する Biacore 本 体 のドアを 開 け 本 体 右 側 下 部 の 細 い 2 本 のインレットチューブをラ ンニング 緩 衝 液 のボトルに 入 れ 太 いシリコンチューブを 廃 液 入 れの 空 ボトル に 入 れる 装 置 の 配 置 センサーチップを 入 れる 場 所 サンプルバイヤル インジケーター 電 源 廃 液 入 れ ランニング 緩 衝 液

2 1.セットアップ 2)コントロールソフトウェアの 起 動 モニターの 初 期 画 面 中 左 下 のスタートを 押 し BIA programs をクリックし Biacore 3000 Control Software のアイコン( )をク リックする 画 面 の 説 明 Menu bar BIACORE の 全 ての 操 作 コマンドが 含 まれている Toolbar 使 用 頻 度 の 高 いコマンドをアイコン 化 しており 簡 便 にコマンド 操 作 を 選 択 できる Sensorgram window センサーグラムをリアルタイムに 表 示 Report point table 指 定 した 時 間 におけるレスポンスを 数 字 で 表 示 結 合 量 の 表 示 等 に 使 用 Eventlog window 測 定 中 の 操 作 内 容 を 表 示 グラフの X 軸 上 の( )と 対 応 Status window 現 在 のシステムの 状 態 を 表 示 時 間 レスポンス(RU) 流 速 使 用 フローセル 温 度 Run 実 行 状 態

1.セットアップ 3 1-2. システムの 初 期 化 1)Dock(センサーチップの 挿 入 ) ソフトウェアを 立 ち 上 げると Dock ボックスに 自 動 的 が 表 示 される 黒 のカバーを 開 け コンベアを 手 前 に 引 く コンベアによって 引 かれてきたガ イドピンにセンサーチップシートのホールが 入 るようにセンサーチップをセッ トし コンベアを 押 し 込 み カバーを 戻 す (フロントパネルのインジケータの Sensor chip のシグナルが 緑 色 に 点 滅 する) Dock ボックスの Dock をクリックする (フロントパネルのインジケータの Sensor chip のシグナルが 緑 色 の 点 灯 に 変 わ る)

4 1.セットアップ Dock 操 作 における 注 意 事 項 解 説 1 各 種 のセンサーチップは 同 様 に Dock することができる 2センサーチップの 交 換 は 必 ず Undock の 状 態 で 行 う インジケータの Sensor chip が Dock 状 態 ( 本 体 シグナルが 緑 色 の 点 灯 時 )に 強 引 にセンサーチップを 抜 かないこと 3センサーチップ 内 のプラスチックシートがセンサーチップのカバーにしっかり 収 まって いることを 確 認 してから 挿 入 する 4センサーチップを 冷 蔵 庫 から 取 り 出 した 場 合 には 室 温 に 戻 した 後 包 装 あるいは 容 器 から 取 り 出 すようにする センサーチップには 以 下 の 種 類 がある (1) CM5: カルボキシルメチルデキストランをコーティングしたチップ アミンカップリ ング チオールカップリング アルデヒドカップリング 等 の 固 定 化 に 利 用 する 汎 用 性 の 高 いチップ Research Grade:ロット 間 の 誤 差 が 15% 以 下 のチップ 通 常 の 実 験 に 使 用 できる Certified Grade:ロット 間 の 誤 差 が 5% 以 下 のチップ 品 質 管 理 等 で 長 期 にわたる 精 密 な 実 験 を 組 む 場 合 等 に 使 用 する (2) CM4: CM5 のカルボキシルメチルデキストラの 導 入 量 を 減 少 させたチップ カルボキシ ル 基 にイオン 交 換 的 に 非 特 異 的 結 合 する 塩 基 性 物 質 を 含 むサンプルを 用 いる 場 合 に 使 用 する (3) CM3: CM5 のカルボキシルメチルデキストラを 短 くしたチップ 巨 大 分 子 ( 細 胞 細 菌 ファージ 等 )の 固 定 化 や 添 加 して 相 互 作 用 測 定 を 行 う 場 合 に 利 用 する (4) C1: 金 表 面 に 直 接 カルボキシル 基 のみを 導 入 したチップ CM3 と 同 様 に 巨 大 分 子 ( 細 胞 細 菌 ファージ 等 )を 用 いる 場 合 に 使 用 する 比 較 的 非 特 異 的 結 合 が 多 い (5) SA: ストレプトアビジンをあらかじめ 固 定 化 してあるカルボキシルメチルデキストラ ンベースのチップ ビオチン 化 した DNA ペプチド 化 合 物 等 ビオチン 化 分 子 の 固 定 化 に 使 用 する (6) NTA: NTAをあらかじめ 固 定 化 してあるカルボキシルメチルデキストランベースのチッ プ ヒスチジンタグを 持 つ 発 現 タンパク 質 (His-Tag Fusion Protein)をNi 2+ を 介 して 固 定 化 できる (7) HPA: 金 表 面 にオクタデシル 基 (C18)を 導 入 したチップ 疎 水 性 の 高 い 表 面 で リン 脂 質 や 糖 脂 質 などをリポソームとして 添 加 することで 単 層 (Monolayer)で 固 定 化 で きる (8) L1: 疎 水 性 分 子 をあらかじめ 固 定 化 してあるカルボキシルメチルデキストランベース のチップ リン 脂 質 や 糖 脂 質 などをリポソームとして 添 加 することで 2 重 膜 (Bilayer) で 固 定 化 できる 糖 脂 質 リン 脂 質 や 膜 貫 通 型 レセプター 等 の 固 定 化 に 使 用 できる

1.セットアップ 5 2) Prime Dock 操 作 終 了 後 自 動 的 に Working Tools の Prime が 選 択 される 緩 衝 液 および 廃 液 入 れを 確 認 後 Start をクリックする 内 容 を 確 認 後 Start をクリックする Prime 終 了 後 Exit をクリックする

6 1.セットアップ Prime における 注 意 事 項 解 説 このボックスは Tools Working Tools の 操 作 で 開 くことができる 実 験 途 中 でランニング 緩 衝 液 を 交 換 する 場 合 には Working Tools を 開 いて Prime を 行 う Prime は 新 しくセンサーチップをセットした 時 やランニング 緩 衝 液 を 交 換 した 時 に 行 い ポンプやマイクロ 流 路 系,オートサンプラー 等 をランニング 緩 衝 液 で 洗 浄 置 換 する 操 作 で ある ランニング 緩 衝 液 として 弊 社 から HBS 緩 衝 液 を 発 売 している HBS-EP 10 mm HEPES ph 7.4/0.15 M NaCl/3 mm EDTA/0.005 % Surfactant P 20(pH7.4) フィルターろ 過 脱 気 済 み HBS-P 10 mm HEPES ph 7.4/0.15 M NaCl/0.005 % Surfactant P 20(pH7.4) フィルターろ 過 脱 気 済 み HBS-N 10 mm HEPES ph 7.4/0.15 M NaCl(pH7.4) フィルターろ 過 脱 気 済 み 実 験 目 的 にあわせ 緩 衝 液 の 変 更 は 自 由 であるが 各 自 で 調 製 した 場 合 には 0.22 μm フィ ルターでろ 過 を 行 い さらに 十 分 脱 気 を 行 う また CM5 センサーチップ 使 用 の 場 合 は リガンドの 固 定 化 終 了 時 まで アミン 系 の 緩 衝 液 (トリスあるいはグリシン 緩 衝 液 等 )は 使 用 しない

1.セットアップ 7 3)ラックベースの 設 定 Biacore 本 体 にセットしてあるラックベースの 設 定 を 行 う Command Rack Base をクリックする ラックに 変 更 がある 場 合 には をクリックしラックを 選 択 する ラック 設 定 後 OK をクリックする 各 ラックと 使 用 できるバイアルについては 8 ページを 参 照 すること

8 1.セットアップ ラックベース 設 定 における 注 意 事 項 解 説 ラックベースは 向 かって 左 側 が Rack Base1 右 側 が Rack Base2 となる 各 ラックは 次 のバイアルがセットできる Thermo_A 7 mm プラスチックバイアル 9 mm ガラスバイアル 0.5 ml 容 エッペンチューブ 16 mm ガラスバイアル Thermo_B 9 mm のガラスバイアル 0.5 ml 容 エッペンチューブ Thermo_C 2 ml プラスチックバイアル 1.5 ml 容 エッペンチューブ MICRO 96 穴 のマイクロタイタープレート 中 央 のラックベー スには 洗 浄 溶 液 専 用 のラック(リージェントラック)がセットできる Reag_A 16 mm ガラスバイアル 2 ml プラスチックバイアル 1.5 ml 容 エッペンチューブ ラックのサンプルの 位 置 は 以 下 のように 指 定 される ラックベースは 向 かって 左 側 が Rack Base1 右 側 が Rack Base2 となる たとえば 右 側 の ラックの f の 列 の 2 番 目 のサンプル( 黒 く 塗 りつぶした 位 置 )は r2f2 となる マイクロ タイタープレート(96 穴 )の 場 合 にも 同 様 な 方 法 で 設 定 する なお Reag_A での 位 置 の 設 定 は 手 前 から RR1,RR2,RR3 である Biacore 社 純 正 以 外 のバイアルを 使 用 する 場 合 の 注 意 事 項 1 バイアルの 底 がラックの 穴 の 底 に 届 くものを 使 用 する 2 ニードルはラックの 穴 の 中 央 に 下 りる バイアルのエッジがぶつからないものを 使 用 す る 3 蓋 付 のバイアルは 蓋 を 取 るかニードルがぶつからないように 注 意 する 4 バイアルの 高 さは 5cm 以 下 のものを 使 用 する

1.セットアップ 9 4) 温 度 設 定 フローセルを 含 む 検 出 器 部 位 の 温 度 の 設 定 を 行 う Command Set Temperature をクリックする 4 ~40 の 範 囲 で 設 定 し OK をクリックする 温 度 設 定 における 注 意 事 項 解 説 1 温 度 設 定 は 4~40 で 設 定 できる 2 設 定 温 度 に 達 していない 場 合 には 画 面 上 の states window 中 の 温 度 の 表 示 が 赤 の 点 滅 本 体 インジケータの Temperature のシグナルが 橙 色 の 点 滅 である 設 定 温 度 に 達 し 温 度 が 安 定 した 場 合 には 画 面 上 の 温 度 の 表 示 が 黒 インジケータは 点 灯 に 変 わる 3 温 度 が 安 定 するまでに 比 較 的 時 間 がかかるので 室 温 から 離 れている 場 合 は 早 めに 設 定 する 4サンプルラックの 温 度 を 調 整 したい 場 合 には 恒 温 循 環 槽 のチューブを 本 体 右 側 面 のノ ズルに 接 続 する この 時 専 用 のアダプターを 使 用 する

10 1.セットアップ 5) Normalize BIAmaintenance kit 中 の BIAnormalize solution 0.5 ml を R2F2 にセットし Tools Working Tools Normalize を 行 う 溶 液 をセット 後 Start をクリックする Normalize における 注 意 事 項 解 説 この 操 作 は SPR シグナルの 校 正 を 行 うものである 以 下 の 場 合 に 実 行 する 1 設 定 温 度 を 変 更 した 場 合 2 センサーチップの 種 類 を変 更 した 場 合 3 最 大 感 度 を 得 たい 場 合 温 度 が 安 定 してから 行 う

2. 基 本 操 作 11 2. 基 本 操 作 ここでは サンプルのインジェクトについて 基 本 操 作 の 解 説 をする サンプルは Sucrose 溶 液 を 使 用 して 説 明 する BIACORE はセンサーチップ 表 面 近 傍 の 屈 折 率 を 測 定 しているため 密 度 の 異 なる 溶 液 がフローセルを 通 過 するとレスポンスとして 検 出 される (サンプル) 1 2% Sucrose 2 4% Sucrose 3 8% Sucrose 4 16% Sucrose 2-1.サンプルのインジェクト サンプル(100μl)をそれぞれラックにセットする アイコン( )あるいはRun Run sensorgram をクリックし センサー グラムをスタートする Detection modeの 選 択 後 OKをクリックする

12 2. 基 本 操 作 流 速 (1~100μl/min)を 入 力 後 OK をクリックする (センサーグラムが 表 示 され 測 定 が 開 始 される) アイコン( )あるいはCommand Inject をクリックする サンプルのポジションおよび 容 量 (10 μl 程 度 )を 入 力 し Start Injection をクリ ックする RU Injection of several concentration of Sucrose 16500 16000 15500 15000 14500 Response 14000 13500 13000 12500 12000 11500 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Time s 2%Sucrose のインジェクション 引 き 続 き 次 のサンプルをインジェクトする

RU 80 60 40 20 0-20 -40-60 50 100 150 200 250 300 350 Tim e s 2. 基 本 操 作 13 全 てのサンプルのインジェクションが 終 了 したら アイコン( )もしくはRun Stop Sensorgramをクリックし 測 定 を 終 了 する マニュアル 操 作 における 注 意 事 項 フローセル 全 部 で 4 個 ある 流 路 の 流 し 方 は 以 下 の 中 から 選 択 できる 1. 単 独 で 使 用 する 場 合 RU 800 700 フローセル 1 フローセル 2 フローセル 3 フローセル 4 2. 複 数 個 のセルを 同 時 に 使 用 する 場 合 フローセル 1-2 フローセル 3-4 Response Response 600 500 400 300 200 100 0-100 50 100 150 200 250 300 350 400 Time s RU 120 100 80 60 40 20 リガンドとの 結 合 コントロール 0-20 -40-20 0 20 40 60 80 100 120 140 Tim e s フローセル 1-2-3-4 Response コントロール

14 2. 基 本 操 作 2-2. レポートポイントの 取 り 方 レポートポイントは センサーグラム 上 の 任 意 の 時 間 におけるレスポンス(RU) を 下 のテーブルに 表 示 させるものである アイコン( )あるいはView Reference Lineをクリックし グラフ 中 にリ ファレンスラインを 表 示 させる マウスのカーソル( 矢 印 )をリファレンスラインの 縦 線 上 に 移 動 後 マウスの 左 ボタンをドラッグし レポートポイントを 取 りたい 時 間 に 移 動 するか もし くはレポートポイントを 取 りたい 場 所 のセンサーグラム 上 の 位 置 でカーソルを ダブルクリックし リファレンスラインを 移 動 する アイコン( )あるいはEdit Add Report Pointをクリックする

2. 基 本 操 作 15 Id の 欄 にコメントを 書 きます ベースラインとする 場 合 には Baseline にチェ ックを 入 れる 表 中 の 相 対 値 (RelResp)の 値 が 0 になる リファレンスラインを 他 のポイントに 移 動 後 同 様 にレポートポイントを とるとベースラインからの 相 対 値 (RelResp)が 表 示 される さらに 必 要 な 場 所 のレポートポイントを 作 成 する

16 2. 基 本 操 作 レポートポイントにおける 注 意 事 項 解 説 1センサーグラムの 下 の 表 をレポートポイントテーブルと 呼 ぶ サンプルをインジェクト する 前 のベースライン インジェクト 後 の 結 合 量 をレスポンス 量 として 表 示 することがで きる 2レポートポイントの 名 前 として baseline bound 等 を 入 力 する 3レポートポイントは ボックス 中 の Window に 示 された 秒 間 隔 における 平 均 値 である こ の 間 隔 は 2 秒 以 上 で 設 定 することが 可 能

2. 基 本 操 作 17 2-3. ファイルの 保 存 得 られたセンサーグラムを 保 存 するには File Save As を 選 択 する Save in:で C:\Bia Users\( 自 分 のフォルダー)に 移 動 後 ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする

18 3. リガンドの 固 定 化 3.リガンドの 固 定 化 リガンド 相 互 作 用 を 検 討 する 分 子 のうち 固 定 化 する 分 子 を リガンド と 言 う リガ ンドの 精 製 度 は リガンド 結 合 の 特 異 性 やキャパシティーに 大 きく 作 用 するの で 非 常 に 重 要 な 要 因 となる 90% 以 上 の 精 製 度 のリガンドを 使 用 する リガンドの 固 定 化 方 法 の 種 類 1 リガンドの 固 定 化 方 法 (CM5 を 使 用 する 場 合 )には 以 下 のような 方 法 がある 1 アミンカップリング リガンド 表 面 に 存 在 するアミノ 基 (N 末 端 アミノ 基 あるいはリジン ε-アミノ 基 ) を 利 用 して 固 定 化 する 方 法 CM デキストランのカルボキシル 基 を NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)で 活 性 化 し プレコンセントレーションを 利 用 して 濃 縮 したリガンドを 固 定 化 する 残 った 活 性 NHS 基 をエタノールアミンでブロッキングする 2 チオールカップリング(183 ページ 参 照 ) リガンドチオールカップリング リガンドの 表 面 に 存 在 する 遊 離 型 チオール 基 を 用 いて 固 定 化 する 方 法 表 面 チオールカップリング センサー 表 面 にチオール 基 を 導 入 し リガンドのカルボキシル 基 を 解 して 固 定 化 する 方 法 リガンドの 修 飾 など 操 作 が 複 雑 である 3 アルデヒドカップリング(173 ページ 参 照 ) 大 量 の 糖 鎖 を 持 つムチンタンパク 質 等 の 固 定 化 をする 方 法 糖 鎖 の 非 還 元 末 端 をメタ 過 ヨウ 素 酸 により 解 裂 させアルデヒド 基 を 作 成 し ヒドラジンによりア ミノ 基 を 導 入 したセンサーチップにシッフ 塩 基 で 固 定 化 する 方 法 リガンドの 修 飾 など 操 作 が 複 雑 である

3. リガンドの 固 定 化 19 リガンドの 固 定 化 方 法 の 種 類 2 リガンドの 固 定 化 方 法 (SA を 使 用 する 場 合 )には 以 下 のような 方 法 がある DNA の 固 定 化 DNA(プライマー 等 )を 固 定 する 場 合 末 端 ビオチン 標 識 した DNA を 適 当 な 緩 衝 液 に 希 釈 (1~10μg/ml)し そのままインジェクトして 固 定 化 を 行 う この 場 合 には アミン 系 の 緩 衝 液 を 使 用 してもかまわない 50 ベース 以 上 の DNA を 固 定 化 する 場 合 には 荷 電 の 影 響 を 少 なくするために 食 塩 を 150mM 程 度 添 加 する ここでは 固 定 化 法 として 汎 用 されるアミンカップリングを 中 心 に 記 載 する ( 準 備 するもの) アミンカップリングキット(GE ヘルスケア バイオサイエンス 社 製 ) ランニング 緩 衝 液 (トリスあるいはグリシン 緩 衝 液 等 の 1 級 アミンを 含 まな いもの) リガンド(アジ 化 ナトリウム 等 の 求 核 性 物 質 の 含 まないもの) リガンド 希 釈 液 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (リガンドの 等 電 点 よりも 1~2 低 いpH) リガンドの 等 電 点 が 不 明 な 場 合 には 21,89 ページのプレコンセントレーショ ン 操 作 を 行 い 固 定 化 ph を 決 める アミンカップリングキット アミンカップリングキットには 以 下 の 試 薬 が 含 まれている EDC(N-ethyl-N -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochroride) NHS(N-hydroxysuccinimide) 1 M ethanolamine hydrochloride 溶 液 (ph 8.5) ( 試 薬 の 調 製 方 法 ) キットに 添 付 されている 説 明 書 にしたがってい EDC および NHS はそれぞれ 10ml の 超 純 水 に 溶 解 し 直 ちに 200μl ずつ 0.5ml 容 のマイクロチューブあるい は 7mm プラスティックバイアル( 弊 社 発 売 )にそれぞれ 小 分 けし 蓋 をして 使 用 直 前 まで-20 で 冷 凍 保 存 する 使 用 に 際 して 1 組 ずつの 試 薬 を 取 り 出 し 溶 解 後 使 用 する 溶 解 後 の 試 薬 の 再 凍 結 はできない エタノールアミンは 溶 液 で 供 給 されており 4 で 保 存 する 200μl ずつ 小 分 けしておくか 使 用 する 直 前 にサンプリングする

20 3. リガンドの 固 定 化 リガンド 希 釈 液 タンパク 質 の 固 定 化 リガンド 濃 度 は 通 常 5~200μg/ml 程 度 になるよう 10mM 酢 酸 緩 衝 液 で 希 釈 して 固 定 化 を 行 う 酢 酸 緩 衝 液 の ph はリガンドの 等 電 点 より 1~2 低 い ph か 21,89 ページに 示 したプレコンセントレーション 操 作 により 決 定 した ph を 用 いる ま た リガンド 希 釈 用 緩 衝 液 は 非 アミン 系 で 比 較 的 低 塩 濃 度 (10 mm)のものを 使 用 する 希 釈 用 緩 衝 液 は ph3.5 以 下 のものは 使 用 しない プレコンセントレー ション 効 果 が 見 られない 場 合 (ペプシン 等 の 酸 性 タンパク 質 )には ビオチン 化 後 SA チップに 固 定 化 する ペプチドや 低 分 子 物 質 の 固 定 化 リガンドがペプチドや 化 合 物 等 低 分 子 物 質 の 固 定 化 の 場 合 は プレコンセン トレーションの 効 果 が 見 られない 場 合 がある この 場 合 には 弱 アルカリ 性 条 件 で 固 定 化 を 行 う つまり プレコンセントレーションを 行 う 代 わりに 高 濃 度 のリガンド 溶 液 を 使 用 する 活 性 型 NHS 基 とアミノ 基 とのカップリング 効 率 は ph8.5 前 後 がもっとも 高 いので この ph 付 近 で 固 定 化 を 行 う 例 えば 希 釈 液 として 10~50mM 炭 酸 緩 衝 液 (ph 8.5)を 使 用 し サンプル 濃 度 を 100μg/ml 以 上 の 比 較 的 高 濃 度 で 固 定 化 する 方 法 である リガンドの 荷 電 の 影 響 がある 場 合 には 食 塩 を 150mM 程 度 添 加 する しかし この 場 合 必 ずしも 目 的 の 固 定 化 量 が 得 られるとは 限 らない 酸 性 タンパクの 場 合 は ビオチン 化 後 SA チッ プへ 固 定 化 する 方 法 をお 勧 めする

3. リガンドの 固 定 化 21 3-1. プレコンセントレーションの 検 討 (マニュアル 操 作 ) プレコンセントレーションとは? 固 定 化 操 作 において センサー 表 面 の CM デキストランに 存 在 するカルボキシル 基 は 非 常 に 重 要 である リガンドを 正 に 荷 電 した 状 態 でインジェクトすると 負 に 荷 電 している CM デキストランとの 間 に 静 電 気 的 な 相 互 作 用 が 生 じ リガン ドをデキストラン 中 に 濃 縮 することができる この 方 法 を 用 いることで 固 定 化 効 率 を 上 昇 させることができる したがって リガンドは 等 電 点 よりも 低 い ph の 緩 衝 液 に 希 釈 し リガンドを 正 に 荷 電 させる 必 要 がある 等 電 点 が 既 知 のサ ンプルの 場 合 は リガンドの 等 電 点 よりも 1~2 低 い ph 条 件 を 使 用 すればよい が 等 電 点 が 不 明 な 場 合 には プレコンセントレーションの 検 討 を 行 って... 固 定 化 に 適 する ph を 調 べることができる この 操 作 では 何 も 処 理 していない... フローセルを 使 用 し 各 ph におけるセンサー 表 面 へのリガンド 濃 縮 の 程 度 を 見 るものである サンプル 調 製 例 リガンドを 最 終 濃 度 で 5~50μg/ml になるよう 各 緩 衝 液 で 希 釈 する 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 6) 100μl 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 5) 100μl 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 4) 100μl... この 操 作 によりリガンドは 固 定 化 されることはない インジェクトが 終 了 後 高 い 塩 濃 度 のランニング 緩 衝 液 ( 例 えば 150mM 食 塩 を 含 む HBS 緩 衝 液 )に 置 換 された 後 に 速 やかに 解 離 する しかし リガンドがデキストランに 非 特 異 的 吸 着 を 起 こすことも 考 えられるので 操 作 終 了 後 洗 浄 溶 液 ( 例 えば 50mM NaOH 30 秒 間 ) 等 で 洗 浄 を 行 う プレコンセントレーションに 使 用 したセンサーチッ プはそのまま 固 定 化 に 利 用 することができる (この 操 作 は Application Wizard を 用 いて 行 うこともできる 89 ページ)

22 3. リガンドの 固 定 化 サンプル 調 製 例 リガンドを 最 終 濃 度 で 5~50μg/ml になるよう 各 緩 衝 液 で 希 釈 する 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 6) 100μl 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 5) 100μl 10mM 酢 酸 緩 衝 液 (ph 4) 100μl サンプルをラックにセットする アイコン( )あるいは Run Run Sensorgram をクリックし センサー グラムをスタートする 使 用 する 流 路 を 選 択 し OK をクリックする 流 速 を 10μl/min に 設 定 し OK をクリックする アイコン( )あるいは Command Inject をクリックする サンプルの 位 置 容 量 (μl)を 入 力 し Start Injection をクリックする

3. リガンドの 固 定 化 23 引 き 続 き 残 りのサンプルも 同 様 にインジェクトする ph 5 ph 4 ph 6 Human IgG のプレコンセントレーション アイコン( )もしくは Run Stop sensorgram をクリックし 測 定 を 終 了 する プレコンセントレーションの 評 価 について プレコンセントレーション 効 果 は 希 釈 緩 衝 液 の ph を 下 げれば 増 加 する しかし 低 い ph 環 境 下 では 活 性 型 NHS 基 とアミノ 基 とのカップリング 効 率 は 減 少 する 上 記 のセンサ ーグラムの 場 合 ph4 の 方 が 5 比 べ 速 い 速 度 でプレコンセントレーションしているが 必 ずしも ph4 で 固 定 化 量 が 多 いとは 限 らない また タンパク 質 の 安 定 化 のためにはできる だけ 高 めの ph を 使 用 すべきである したがって 濃 縮 効 果 のある 一 番 高 い ph 条 件 を 使 用 する 上 記 の 場 合 ph5 で 十 分 である

24 3. リガンドの 固 定 化 3-2. プログラム 操 作 によるリガンドの 固 定 化 リガンドのアミンカップリングについて 記 載 する 固 定 化 は マニュアル 操 作 プログラム 操 作 および Application Wizard(96 ページ 参 照 )で 行 うことができる が ここでは プログラム 操 作 によるリガンドの 固 定 化 について 記 載 する プログラムの 詳 細 については 64 ページ 参 照 のこと 1)ファイルの 呼 び 出 し アイコン( )あるいは File Open をクリックする C:\Program File\BIACORE 3000\Guide\Methods とフォルダーを 開 け アミ ンカップリングのメソッドファイルである Amine をクリックする アイコンの 種 類 1Program File ( 拡 張 子.blm) 2Result File ( 拡 張 子.blr) 3BIAevaluation File ( 拡 張 子.ble) 以 下 のプログラムが 表 示 される

3. リガンドの 固 定 化 25 ( 固 定 化 プログラム) DEFINE APROG immob CAPTION Amine coupling!グラフのタイトル FLOW 10! 流 速 10μl/min DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50!NHS/EDC の 混 合 液 の 作 成 * INJECT R2E3 70!NHS/EDC の 混 合 液 の 添 加 -0:10 RPOINT Baseline b!レポートポイントの 表 示 INJECT R2A1 70!リガンド 溶 液 の 添 加 * INJECT R2E4 70!エタノールアミンの 添 加 * INJECT R2F3 10! 洗 浄 溶 液 の 添 加 2:00 RPOINT immob!レポートポイントの 表 示 END MAIN RACK 1 thermo_b!ラックベースの 設 定 RACK 2 thermo_a!ラックベースの 設 定 DETECTION 1! 検 出 フローセルの 設 定 APROG immob!aprog immob の 実 行 APPEND standby!standby の 実 行 END ( 試 薬 およびサンプルの 位 置 ) R2A1 : リガンド( 至 適 な ph に 酢 酸 溶 液 に 希 釈 したもの) R2E1 : NHS(もしくは EDC 冷 凍 庫 から 取 り 出 し 溶 解 直 後 のもの) R2E2 : EDC(もしくは NHS 冷 凍 庫 から 取 り 出 し 溶 解 直 後 のもの) R2E3 : 空 容 器 (9 mm ガラスバイアルあるいは 0.5ml マイクロチューブ) R2E4 : エタノールアミン 溶 液 R2F3 : 洗 浄 溶 液 このプログラムは 1つのフローセルにリガンドを 固 定 化 する 方 法 である 4 つのフローセルに 同 じリガンドを 固 定 する 場 合 や 別 々のリガンドを 固 定 化 す る 場 合 のプログラムを 作 成 する 場 合 には プログラムの 説 明 (79 ページ)を 参 照 すること

26 3. リガンドの 固 定 化 (コマンドの 説 明 ) 詳 しいプログラムの 解 説 は 64 ページを 参 照 すること FLOW 10 流 速 を 10μl/min に 設 定 している DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 R2E1 のサンプルと R2E2 のサンプルを 等 量 とり R2E3 で 混 合 液 を 調 製 する ここでは EDC と NHS の 混 合 液 を 作 成 している この 操 作 によって 混 合 液 が 200μl 作 成 される 50 は R2E1 の 混 合 割 合 が 50%であることを 示 している * INJECT R2E3 70 調 製 した 混 合 液 を 70μl インジェクトし センサー 表 面 を 活 性 化 する 添 加 時 間 7 分 7 分 間 の 添 加 で CM デキストランのおよそ 40%が 活 性 化 される ことになる 目 的 によって 時 間 を 増 減 する 残 存 カルボキシル 基 を 少 なくした い 場 合 には この 活 性 化 時 間 を 長 くする 活 性 化 時 間 と 固 定 化 量 との 関 係 は 約 10 分 間 まで 比 例 関 係 である INJECT R2A1 70 R2A1 のポジションにあるリガンドを 70μl インジェクトし カップリングを 行 う 添 加 時 間 7 分 サンプルは 添 加 量 + 30μl(この 場 合 は 100μl)を 用 意 する * INJECT R2E4 70 R2E4 のポジションにある 1M エタノールアミンを 70μl インジェクトし 残 余 の 活 性 型 NHS 基 をブロッキングする EDC と NHS の 混 合 液 の 添 加 時 間 と 同 じ 時 間 添 加 する サンプルは 添 加 量 + 30μl(この 場 合 は 100μl)を 用 意 する * INJECT R2F3 10 R2F3 のポジションにある 洗 浄 溶 液 を 10μl インジェクトすることで センサー 表 面 を 簡 単 に 洗 浄 する 通 常 は 10mM Gly-HCl(pH 1.5~2.0)あるいは 10~50mM NaOH 等 を 使 用 する 1 回 のインジェクションは 1 分 間 以 内 にする

3. リガンドの 固 定 化 27 ファイルの 呼 び 出 しおよび 修 正 における 注 意 事 項 解 説 1 試 薬 およびサンプルの 位 置 と 添 加 量 は 自 由 に 変 更 できる 変 更 する 場 合 は プログラム 中 のサンプル 位 置 および 添 加 容 量 を 変 更 する 2 リガンドの 希 釈 液 については 21 ページのプレコンセントレーションの 項 を 参 考 にす る 3 洗 浄 溶 液 の 添 加 は 非 特 異 結 合 により 結 合 しているリガンドを 洗 浄 するために 行 うもの である 不 必 要 な 場 合 には 省 略 する 4 C:\Program Files\BIACORE 3000\Guide\Methods 中 にあるプログラムは 書 き 直 さな いようにする 書 き 直 す 場 合 には 自 分 のフォルダーにオリジナルプログラムをコピー 後 上 書 きするようにする

28 3. リガンドの 固 定 化 2)Method の 編 集 作 成 あるいは 修 正 したプログラムのコマンドの 文 字 を 全 部 大 文 字 にし 行 をそ ろえることができる Edit Adjust Method Second あるいは Minute をクリックする define aprog immob caption immobilization flow 5 dilute r2e1 r2e2 r2e3 * inject r2e3 35-0:10 rpoint baseline -b end (Edit Adjust Method Minute すると) DEFINE APROG immob CAPTION immobiilization FLOW 5 DILUTE r2e1 r2e2 r2e3 * INJECT r2e3 35-0:10 RPOINT baseline -b END と 変 更 される METHOD の 編 集 における 注 意 事 項 解 説 1 この 操 作 はプログラムを 実 行 する 上 で 必 ずしも 必 要 ではない プログラムは 大 文 字 と 小 文 字 のどちらを 使 用 してもかまわない また コマンドとコマンドの 間 隔 も 任 意 である (1 スペースあればよい) 2 レポートポイントの 時 間 表 示 を 秒 表 示 にしたい 時 には Second を また 分 表 示 にした い 時 には Minute を 選 択 する

3. リガンドの 固 定 化 29 3)エラーの 検 索 作 成 したプログラム 中 に 言 語 等 の 誤 りがあるかを 検 索 する Run Prerun Method をクリックする エラーがある 場 合 には 以 下 の 様 なメッセージが 現 れる エラーの 内 容 が 表 示 されるので OK をクリック 後 訂 正 する >>Expected:'1','2','3','4','1,2','2-1','3,4','4-3','1,2,3,4', '2-1,4-3'... >> ^ DETECTION 5 >> ^ マークのある 項 にエラーがあるので 正 しく 変 更 し もう 一 度 Prerun Method を 実 行 する ( 上 下 のメッセージは 消 去 する 必 要 はない) 何 もエラーが 表 示 されない 場 合 には エラーがない エラーの 検 索 における 注 意 事 項 解 説 1 実 際 にセットしたサンプルの 位 置 の 認 識 はしないので サンプル 位 置 は 間 違 えないよう にする 2 プログラム 実 行 前 には 必 ず( Run Prerun Method )を 実 行 する

30 3. リガンドの 固 定 化 4)プログラムの 実 行 Run Run Method をクリックする 呼 び 出 してきたプログラム(Amine.blm)の 内 容 を 書 き 直 した 場 合 以 下 のメッ セージが 表 示 される ここで Yes をクリックすると 元 のファイルが 書 き 直 おされる 基 本 となるメソ ッドファイルは 書 き 換 えないよう 注 意 する 通 常 は No をクリックする 保 存 先 の 各 自 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックす る

3. リガンドの 固 定 化 31 Response RU immobilization 30000 28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 0 500 1000 1500 2000 2500 Time s ( 固 定 化 センサーグラム) プログラムの 実 行 における 注 意 事 項 解 説 1 プログラムを 保 存 しなかった 場 合 でも Method は Result ファイルの 中 に 保 存 される Result ファイルの View Method をクリックすれば その 時 の Method を 見 ることが できる また その Method を 再 実 行 することも 可 能 である 2 拡 張 子.blm は 省 略 しても 自 動 的 に 書 き 込 まれる 拡 張 子 について BIACORE のファイル 名 には 以 下 の 拡 張 子 が 付 いている ファイル 名. blm :Method ファイル ファイル 名. blr :Result ファイル ファイル 名. ble :BIAevaluation software で 作 成 したファイル 拡 張 子 の 種 類 からどれに 属 するファイル 名 か 確 認 できる ( 重 要 ) 実 行 後 にプログラムを 強 制 終 了 したい 場 合 には キーボードの を 同 時 に 押 す Ctrl( 左 下 )+ Break( 右 上 )

32 3. リガンドの 固 定 化 5)プログラムの 終 了 プログラムが 終 了 すると Standby 状 態 になる(プログラムの MAIN ボックスの APPEND Standby による) Stop をクリックし Standby を 停 止 する データは 先 に 入 力 したファイル 名 で 保 存 される

3. リガンドの 固 定 化 33 固 定 化 全 体 における 注 意 事 項 固 定 化 量 は 実 験 の 目 的 によって 調 節 する 必 要 がある 1 特 異 的 結 合 の 確 認 実 験 特 異 的 な 結 合 を 確 認 するための 実 験 の 場 合 には アナライトのレスポンスが 十 分 得 られる ような 固 定 化 量 があればよい したがって リガンドの 固 定 化 量 は 多 くしてもかまわな い 感 度 を 良 くするためにも 固 定 化 量 を 多 くする 方 が 理 想 的 である 低 分 子 のアナライト の 場 合 には リガンドの 固 定 化 量 を 十 分 に 多 くしなければならない リガンドの 固 定 化 量 とアナライトのレスポンスとの 関 係 は それぞれの 分 子 量 によって 決 まる 固 定 化 したリガンドにアナライトが 最 大 どれだけ 結 合 するか 以 下 の 式 で 算 出 するこ とができる アナライトの 結 合 量 =アナライトの 分 子 量 リガンドの 固 定 化 量 /リガンドの 分 子 量 s ( 最 大 結 合 量 Rmax) (Da) (RU) (Da) s はリガンドの 結 合 部 位 数 ( 例 ) リガンドの 分 子 量 50,000 Da リガンド 固 定 化 量 1,000 RU リガンド 結 合 部 位 数 1 アナライト 分 子 量 20,000 の 場 合 アナライトの 最 大 結 合 量 (Rmax) 以 下 の 値 となる アナライトの 最 大 結 合 量 (Rmax)= 20,000 1,000 / 50,000 1 = 400RU 特 に 低 分 子 のアナライトを 使 用 する 場 合 には 最 大 アナライトの 結 合 量 が 最 低 でも 50~ 100RU 程 度 は 必 要 であるので 注 意 する 2 濃 度 測 定 濃 度 測 定 を 行 う 場 合 には 固 定 化 量 はできるだけ 多 くする 目 安 としては 10,000~15,000RU 程 度 は 固 定 化 したい 固 定 化 量 を 多 くするとスタンダードサンプルを 使 用 した 際 の 検 量 線 の 直 線 性 がより 高 くなる

34 3. リガンドの 固 定 化 3 反 応 速 度 定 数 ( 結 合 速 度 定 数 (k ass ) 解 離 速 度 定 数 (k diss ))の 算 出 反 応 速 度 定 数 (Kinetics Parameter)を 算 出 させる 場 合 には 固 定 化 量 はできるだけ 抑 える 必 要 がある 至 適 な 固 定 化 量 は 以 下 の 式 から 得 られた 最 小 固 定 化 量 と 最 大 固 定 化 量 の 間 の 固 定 化 量 (RU)を 目 安 にする ( 最 小 固 定 化 量 ) 200 1/S (リガンドの 分 子 量 /アナライトの 分 子 量 ) ( 最 大 固 定 化 量 ) 1000 1/S (リガンドの 分 子 量 /アナライトの 分 子 量 ) Sはリガンドの 結 合 部 位 数 例 えば 50 kda のリガンドと 120 kda のアナライトを 使 用 する 場 合 のリガンドの 固 定 化 量 は(S=1 として) 最 小 固 定 化 量 200 1/1 (50,000/120,000)= 83 RU から 最 大 固 定 化 量 1000 1/1 (50,000/120,000)= 417 RU の 間 となる 固 定 化 量 を 調 節 する 場 合 には Manual Inject を 使 用 すると 便 利 である(35 ページ 参 照 )

3. リガンドの 固 定 化 35 3-3. MANUAL INJECT を 用 いた 固 定 化 量 の 調 節 方 法 Manual Inject は サンプルのインジェクトを 小 刻 みに 繰 り 返 すことのできる Inject の 方 法 であり この 方 法 を 使 用 することで 厳 密 な 固 定 化 量 の 調 節 を 行 う ことができる この 操 作 は 全 ての 段 階 をマニュアル 操 作 で 行 う(プログラム 操 作 では 行 えない) NHS 活 性 化 やエタノールアミンブロッキング 時 は 通 常 の INJECT を 使 用 し リガンドのインジェクト 時 にのみ MANUAL INJECT を 使 用 する アイコン( )あるいは Run Run Sensorgram をクリックし センサーグ ラムをスタートさせる(22 ページ 参 照 ) Manual Inject をする 場 合 には Command Queue を 閉 じておく 必 要 がある 画 面 上 の をクリックする File Close をクリックする Yes をクリックする 画 面 上 から が 消 える

36 3. リガンドの 固 定 化 (1)NHS の 活 性 化 NHS/EDC の 当 量 混 合 液 ( 自 分 で 混 合 する)をラックにセットする アイコン( )あるいは Command Inject をクリックする サンプル 位 置 および 添 加 容 量 を 入 力 し Start Injection をクリックする (7 分 間 活 性 化 が 基 本 となる) RU 19000 18000 17000 16000 Response 15000 14000 13000 12000 11000 10000 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Time s NHS 活 性 化 反 応 が 行 われる

3. リガンドの 固 定 化 37 (2)リガンドの 添 加 アイコン( )あるいは Command Inject をクリックする MANUAL INJECT を 選 択 し Start Injection をクリックする をクリックする Load Loop をクリックする サンプル 位 置 およびサンプルロード 量 を 入 力 後 OK をクリックする

38 3. リガンドの 固 定 化 Manual を 選 択 し Start をクリックするとリガンドが 添 加 され Stop をクリッ クすると 停 止 する(この 操 作 を 繰 り 返 し 固 定 化 量 を 調 節 する) ( 結 合 量 の 確 認 ) アイコン( )をクリックし リファレンスラインを 表 示 させ リガンドイン ジェクション 前 に 移 動 後 View Baseline をクリックすると 画 面 上 のレス ポンスが 0 になる さらに 添 加 後 に 移 動 させると 結 合 量 を 表 示 させること ができる

3. リガンドの 固 定 化 39 (3)エタノールアミンの 添 加 NHS/EDC 混 合 液 の 添 加 時 と 同 様 に 通 常 の INJECT コマンドを 使 用 し エタノー ルアミンを 添 加 する(NHS/EDC と 同 じ 添 加 時 間 ) R es Ti この 方 法 を 用 いることで 任 意 の 固 定 化 量 に 調 節 できる なお Application Wizard を 用 いると 簡 単 に 固 定 化 量 の 調 節 ができる(99 ペ ージ 参 照 )

40 4. 相 互 作 用 の 検 討 4. 相 互 作 用 の 検 討 アナライト 相 互 作 用 を 見 る 場 合 インジェクトする 方 の 分 子 をアナライトという アナラ イトとしては 血 清 や 培 養 上 清 等 のクルード(crude)なサンプルも 使 用 するこ とができるが 不 溶 性 の 粒 子 等 は 遠 心 などで 除 去 しなければならない また 正 確 な 反 応 速 度 定 数 を 算 出 する 場 合 には サンプルはできるだけ 精 製 したもの を 使 用 する サンプルは できるだけランニング 緩 衝 液 で 希 釈 する 必 要 のある 場 合 には ランニング 緩 衝 液 でゲルろ 過 等 を 使 用 し 緩 衝 液 交 換 するか ランニング 緩 衝 液 をサンプル 溶 解 液 の 条 件 に 変 更 する 緩 衝 液 が 異 なる 場 合 には 結 合 領 域 と 解 離 領 域 の 緩 衝 液 組 成 が 異 なることになる また 溶 液 効 果 (Bulk Effect)が 発 生 する 場 合 があるので 注 意 する(47 ページ 参 照 ) アナライト 濃 度 はアフィニティーや 分 子 量 にもよるが およそ 数 十 ng/ml~ 数 百 μg/ml で 行 う 反 応 速 度 定 数 を 算 出 する 場 合 には 予 想 される K D ( 解 離 定 数 ) 値 濃 度 の 1/10~10 倍 の 濃 度 で 分 析 すると 良 好 な 結 果 が 得 られる 再 生 溶 液 結 合 したアナライトを 強 制 的 に 全 部 解 離 させる 操 作 を 再 生 (Regeneration) 操 作 という 再 生 操 作 は 以 下 の 条 件 を 満 たしていることが 必 要 である 1リガンドの 活 性 を 失 わないこと 2リガンドがセンサーチップ 表 面 から 遊 離 しないこと 3アナライトを 完 全 に 解 離 させること 再 生 溶 液 としては 通 常 は 以 下 のような 種 類 のものを 使 用 する ( 詳 しくは 45 ペ ージ 参 照 ) 1 高 塩 濃 度 溶 液 2pH を 変 化 させる 溶 液 ( 酸 性 溶 液 あるいはアルカリ 溶 液 ) 3キレート 剤 ( 多 価 カチオン 依 存 性 反 応 の 場 合 ) 4 界 面 活 性 剤 5 有 機 溶 媒 6 変 性 剤 再 生 溶 液 を 添 加 する 場 合 には 30 秒 ~1 分 間 の 短 いインジェクションで 行 い 充 分 再 生 されない 場 合 には この 短 時 間 のインジェクションを 数 回 繰 り 返 す( 長 時 間 の 添 加 は 避 ける)

4. 相 互 作 用 の 検 討 41 4-1. マニュアル 操 作 による 相 互 作 用 の 検 討 サンプルをラックにセットする アイコン( )あるいは Run Run sensorgram をクリックし センサー グラムをスタートする 使 用 するフローセルの 選 択 およびコントロール 差 し 引 き 機 能 の 選 択 を 行 い OK をクリックする (46 ページ 参 照 ) 流 速 を 設 定 し OK をクリックする 反 応 速 度 定 数 (k ass, k diss )を 算 出 する 場 合 には 比 較 的 速 い 流 速 (20~50μl/min)に 設 定 する アイコン( )あるいは Command Inject をクリックする

42 4. 相 互 作 用 の 検 討 INJECT の 右 のをクリックすると 各 種 のインジェクトコマンドが 表 示 される( 下 図 参 照 ) (インジェクトコマンドの 種 類 ) コマンド 内 容 試 料 添 加 量 試 料 消 費 量 INJECT 通 常 使 用 のモード 5-325μl +30μl KINJECT 反 応 速 度 を 算 出 する 際 に 有 効 10-250μl +40μl 解 離 時 間 を 入 力 する QUICKINJECT 試 料 の 必 要 量 が 少 ない 5-325μl +10μl 測 定 開 始 までの 待 ち 時 間 が 少 ない COINJECT 2つのサンプルを 間 隔 を 空 けず 連 続 して 添 加 できる Sample 1: 10-100μl +40μl Sample 2: 15-250μl +40μl BIGINJECT 大 容 量 の 試 料 を 添 加 する 325-750μl +52μl MANUAL INJECT 35 ページを 参 照

4. 相 互 作 用 の 検 討 43 RU 15500 15400 15300 15200 Response 15100 15000 14900 14800 14700 14600 0 50 100 150 200 250 Time s 解 離 状 態 を 観 察 後 再 生 溶 液 (45 ページ 参 照 )を 添 加 し(この 場 合 は INJECT で 良 い) 結 合 したアナライトを 洗 い 流 す RU 16000 15500 15000 Response 14500 14000 13500 13000 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Time s さらに 分 析 するサンプルがある 場 合 には Run Start New Cycle をクリックす ると 同 一 ファイル 内 に 新 しいサイクルとしてセンサーグラムを 開 始 することが できる 測 定 を 終 了 する 場 合 アイコン( )あるいは Run Stop Sensorgram をク リックし 測 定 を 終 了 する レポートポイント 作 成 方 法 については 14 ページをご 参 照 すること 通 常 は サンプル 添 加 前 10 秒 程 度 のポイントでベースラインをとり サンプル インジェクト 終 了 10 秒 ~30 秒 後 を 結 合 量 として 表 示 させる また コントロー ルブランク 差 し 引 きグラフを 表 示 している 場 合 には サンプルインジェクト 終.. 了 直 前 の 値 を 結 合 量 とする 場 合 もある

44 4. 相 互 作 用 の 検 討 RU 30000 Binding of DSA(100ug/ml) to immobilized Asialofetuin 25000 20000 15000 10000 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Time s 相 互 作 用 のセンサーグラム

4. 相 互 作 用 の 検 討 45 再 生 溶 液 について 再 生 溶 液 は 通 常 以 下 のようなものが 使 用 されるが 結 合 したアナライトが 完 全 に 再 生 され かつ 固 定 化 したリガンドの 活 性 が 保 持 されていなければならない 再 生 溶 液 の 例 試 薬 濃 度 あるいは ph ( 塩 ) NaCl < 1M ( 酸 性 条 件 ) 10mM Gly-HCl > ph 1.5 HCl < 100mM Phosphoric acid < 100mM Formic acid < 20% (アルカリ 条 件 ) 10mM Gly-NaOH < ph 12 NaOH Ethanolamine Ethanolamine-HCl < 100mM < 100mM < 1M (キレート 剤 )- 多 価 カチオン 依 存 性 反 応 の 場 合 EDTA < 0.35M ( 界 面 活 性 剤 ) Surfactant P-20 (Tween 20) < 5% Triton X-100 < 5% SDS < 0.5% Octylglycoside < 40mM ( 有 機 溶 媒 ) Acetonitrile < 20% DMSO < 8% Ethyleneglycol in HBS buffer < 50% Ethanol < 20% Formamide < 40% ( 変 性 剤 ) Guanidine-HCl Urea < 5M < 8M

46 4. 相 互 作 用 の 検 討 流 路 の 選 択 について 実 験 の 目 的 によって サンプルを 流 す 流 路 を 選 択 できる ブランクコントロールを 同 時 にとる 場 合 には 複 数 のセルを 選 択 後 インラインコントロ ール 差 し 引 き 機 能 を 利 用 して コントロールを 差 し 引 いたグラフを 表 示 することができる この 場 合 コントロールセルとできるのは フローセル1と3である 上 図 の 場 合 フローセル1をコントロールにして フローセル2のレスポンスからフロー セル1のレスポンスを 差 し 引 きしたグラフを 表 示 することができる また Fc1-2-3-4 を 選 択 すると 以 下 のボックスの 各 種 引 き 算 のグラフを 表 示 することができる

4. 相 互 作 用 の 検 討 47 センサーグラムの 表 示 表 示 するセンサーグラムを 変 更 することができる 11 本 表 示 (Single Plot) View Plot Single をクリックすると センサーグラム 1 本 だけを 表 示 する 左 上 の Curve: のをクリックし 表 示 セ ンサーグラムを 選 択 することができる 2 複 数 表 示 (Overlay Plots) View Plot Overlay をクリックすると すべてのセンサーグラムを 表 示 することができる 3カーブの 種 類 による 表 示 表 示 センサーグラムの 種 類 が 多 い 場 合 には センサーグラムの 種 別 で 表 示 変 更 することが できる View Plot Curve Classes をクリックし Curves:で 選 択 することで 各 フローセルのセン サーグラムもしくは 差 し 引 きグラフを 選 択 して 表 示 することができる サンプルの 調 製 サンプルは できるだけランニング 緩 衝 液 で 希 釈 する サンプル 溶 液 とランニング 緩 衝 液 の 組 成 とが 異 なる 場 合 には 溶 液 効 果 (bulk effect)が 大 きくなる 場 合 がある Bulk Effect

48 4. 相 互 作 用 の 検 討 インジェクトの 中 止 インジェクトを 途 中 で 中 止 したい 場 合 には アイコン( )もしくは Command Stop Inject をクリックする ニードルに 残 ったサンプルを 設 定 したポジション(あるいは WASTE) に 戻 すことができる インジェクトコマンドの 拡 張 機 能 Extra Cleanup クルードなサンプル 等 を 使 用 し 添 加 後 の 洗 浄 を 通 常 よりも 良 くしたい 場 合 には 添 加 時 インジェクションボックスの 拡 張 機 能 を 利 用 する More>>をクリックする Extra Cleanup にマークを 入 れる

4. 相 互 作 用 の 検 討 49 Command Queue について マニュアル 操 作 でセンサーグラムを 開 始 すると Command Queue ボックスのアイコンがセ ンサーグラム 画 面 右 上 に 表 示 される このボックスをクリックして 開 くと マニュアル 操 作 で 入 力 したコマンドを 確 認 することができる 入 力 したコマンドは 入 力 順 に 実 行 してい く また 入 力 したコマンドの 1 つを 削 除 したい 場 合 には Edit Delete コマンド 間 に コマンドを 挿 入 したい 場 合 には Edit Insert をクリックし 新 たにコマンドを 入 力 する Command Queue ボックスは 右 上 の 縮 小 ボタンをクリックしてアイコン 化 ( 縮 小 )すること ができる また アイコンをクリックすると 再 びボックスを 開 くことができる

50 4. 相 互 作 用 の 検 討 4-2. プログラムによる 相 互 作 用 の 検 討 固 定 化 と 同 様 に 基 本 となるメソッドファイルを 呼 び 出 し 修 正 後 実 行 する ここでは 相 互 作 用 検 討 用 のメソッドファイルである Assay.blm を 基 本 に 説 明 す る プログラムの 詳 細 については 64 ページを 参 照 すること Application Wizard を 用 いると 簡 単 に 相 互 作 用 の 実 験 を 行 うことができる 1. 特 異 的 結 合 の 検 討 (スクリーニング) 122 ページ 参 照 2. 結 合 解 離 反 応 速 度 定 数 の 算 出 128 ページ 参 照 1)ファイルの 呼 び 出 し アイコン( )あるいは File Open をクリックする C:\Program Files\BIACORE 3000\guide\Methods とフォルダーを 開 け 相 互 作 用 測 定 用 のファイルである Assay.blm を 選 択 後 Open をクリックする

4. 相 互 作 用 の 検 討 51 DEFINE APROG assay PARAM %pos %ID %conc CAPTION Binding of %ID(%conc) to immobilized antibody FLOW 20 FLOWPATH 1,2 * KINJECT %pos 60 180-0:10 RPOINT Baseline -b 3:10 RPOINT bound * QUICKINJECT R2F3 20 2:00 RPOINT Regeneration END MAIN RACK 1 THERMO_B RACK 2 THERMO_A DETECTION 2-1 APROG assay R2A1 Antigen 25ug/ml APROG assay R2A2 Antigen 12.5ug/ml APROG assay R2A3 Antigen 6.25ug/ml APROG assay R2A4 Antigen 3.125ug/ml APPEND standby END このプログラムでは フローセル2に 固 定 化 したリガンドに 対 し アナライト を 反 応 させる 場 合 のプログラムを 表 示 している(フローセル1はコントロール) コントロールの 差 し 引 きグラフを 作 成 する 場 合 には DETECTION 2-1 に 設 定 す る DETECTION の 設 定 (シングル 検 出 ) (マルチ 検 出 ) ( 差 し 引 き 機 能 ) DETECTION 1 DETECTION 1,2 DETECTION 2-1 DETECTION 2 DETECTION 3,4 DETECTION 4-3 DETECTION 3 DETECTION 1,2,3,4 DETECTION 2-1,3-1,4-1 DETECTION 4 DETECTION 2-1,4-3 以 上 の 中 から 選 択 する

52 4. 相 互 作 用 の 検 討 このプログラムにおけるサンプルの 位 置 サンプルポジション サンプル( 例 ) 濃 度 ( 例 ) R2A1 Antigen 25μg /ml R2A2 Antigen 12.5μg /ml R2A3 Antigen 6.25μg /ml R2A4 Antigen 3.125μg /ml R2F3 再 生 溶 液 (10mM Gly-HCl (ph 1.75)) 2)Method の 編 集 固 定 化 操 作 の 項 (28 ページ)を 参 照 すること 3)エラーの 検 索 固 定 化 操 作 の 項 (29 ページ)を 参 照 すること 4)プログラムの 実 行 固 定 化 操 作 の 項 (30 ページ)を 参 照 すること RU 30000 Binding of DSA(100ug/ml) to immobilized Asialofetuin 25000 20000 15000 10000 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Time s 5)プログラムの 終 了 固 定 化 操 作 の 項 (32 ページ)を 参 照 すること ( 重 要 ) 実 行 後 にプログラムを 強 制 終 了 したい 場 合 には キーボードの を 同 時 に 押 し 緊 急 停 止 する Ctrl( 左 下 )+Break( 右 上 )

4. 相 互 作 用 の 検 討 53 プログラムの 実 行 における 注 意 事 項 解 説 Method ファイルは Result ファイル 中 に 保 存 される Result ファイル 上 で View Method をクリックすれば センサーグラム 作 成 時 の Method が 表 示 される ま た 改 めてその Method を 実 行 することができる 4-3.ファイルの 保 存 様 式 データは1つのサンプルで 1 つのグラフ(サイクル)として 保 存 される Cycle のサイクル 番 号 を 選 択 すると 他 のサンプルのデータを 表 示 するこ とができる 1つのファイルの 中 にたくさんの Cycle が 存 在 することになる

54 5.シャットダウン 5.シャットダウン 5-1. 実 験 の 終 了 実 験 が 終 了 した 場 合 には 次 の 2 方 法 のどちらかを 行 う 1 Standby 状 態 での 放 置 2 電 源 を 落 として 終 了 比 較 的 頻 繁 (3 日 以 内 に 使 用 する)に BIACORE を 使 用 する 場 合 には 1の Standby にする 3 日 以 上 使 用 しない 場 合 には 2の 電 源 を 落 として 終 了 を 行 う 1 Standby の 実 行 Tools Working Tools をクリックし Standbyを 選 択 し 実 行 する 5 μl/min の 流 速 で 最 大 96 時 間 ランニング 緩 衝 液 を 送 り 続 ける 操 作 を 自 動 的 に 行 う 週 末 に 使 用 しないような 場 合 Standby を 実 行 する 96 時 間 の Standby でランニング 緩 衝 液 の 消 費 量 はおよそ 80 ml 程 度 である 2 電 源 を 落 として 終 了 電 源 を 落 とす 場 合 には 基 本 的 にシステムを 水 で 洗 浄 して Biacore の 流 路 中 の 緩 衝 液 を 完 全 に 除 く( 洗 浄 には 洗 浄 用 センサーチップを 使 用 ) 流 路 系 等 に 塩 の 析 出 を 防 ぐために 行 うものである これには 2 つの 方 法 がある 超 純 水 で Prime 緩 衝 液 ボトルを 超 純 水 ボトルに 置 き 換 え Tools Working Tools をクリック し Primeを 実 行 する Close 16 mm ガラスバイアルに 超 純 水 を 3 ml 入 れ R2F3 におき Tools Working Tools をクリックし Closeを 実 行 する

5. シャットダウン 55 5-2.センサーチップの 抜 きと(Undock) Command Undock をクリックし Undockを 実 行 する フロントパネルの Sensor chip の 緑 のライトが 点 灯 から 点 滅 に 変 わったら センサーチップを 抜 きとる Biacore システム コンピューター モニター プリンターの 電 源 を Off にする ランニング 緩 衝 液 廃 液 入 れをかたづける 5-3.センサーチップの 保 存 実 験 に 使 用 後 Undock したセンサーチップは 以 下 の 方 法 で 保 存 することができ る 1Dry 状 態 での 保 存 取 り 出 したセンサーチップを 50 ml 容 のふたつプラスチック 管 等 に 入 れ 4 で 保 存 する 安 定 なタンパク 質 や DNA を 固 定 したセンサーチップの 保 存 に 用 いる 2Wet 状 態 での 保 存 取 り 出 したセンサーチップのシート 部 分 をカバーから 抜 きとり シートだけを PBS 等 の 緩 衝 液 を 入 れた 容 器 (50 ml 容 のふたつプラスチック 管 等 )に 入 れ 4 で 保 存 する センサーチップを 再 Dock するときには シートについたバッファ ーをふきとった 後 カバーに 戻 し 使 用 する リガンドの 固 定 してある 側 につい ては 細 くとがらせたキムワイプ 等 をセンサー 部 分 の 四 角 の 隅 に 置 き 余 分 な バッファーを 吸 い 取 る リガンドの 固 定 していない 側 のセンサー 部 分 は 反 射 面 でとなるので キムワイプ 等 で 全 体 をきれいにふきとる 反 射 面 に 濁 りや 汚 れ 等 がないように 注 意 する センサー 部 分 以 外 の 白 い 部 分 は キムワイプ 等 でし っかりふきとる タンパク 質 の 種 類 によっては どちらの 方 法 を 用 いても 保 存 中 に 変 性 する 場 合 があるので 再 Dock 後 活 性 を 確 認 すること

56 6.メンテナンス 6.メンテナンス 6-1. メンテナンス Biacoreのメンテナンスは Working Tools(Tools Working Tools ) 中 のコマ ンドを 用 いて 行 う 実 験 を 行 う 前 に Prime 新 しいセンサーチップを Dock したときやランニング 緩 衝 液 を 交 換 したときに 行 う 操 作 である ポンプや IFC(マイクロ 流 路 系 ) オートサンプラー 等 をランニ ング 緩 衝 液 で 置 換 洗 浄 する ( 所 要 時 間 約 6 分 20 秒 間 ) Prime はランニング 緩 衝 液 でシステムを 初 期 化 する 操 作 である 大 きく 塩 濃 度 が 変 化 する 緩 衝 液 や 粘 性 の 異 なる 緩 衝 液 に 交 換 する 場 合 には Prime を 2~3 回 繰 り 返 すことをお 勧 めする ランニング 緩 衝 液 で 洗 浄 したい 場 合 に Flush IFC とフローセルをランニング 緩 衝 液 で 簡 単 に 洗 浄 する ( 所 要 時 間 約 2 分 20 秒 間 ) Rinse IFC フローセル 回 収 カップをランニング 緩 衝 液 で 高 流 速 にて 洗 浄 する ( 所 要 時 間 約 3 分 間 ) 通 常 の 洗 浄 は 実 験 の 各 段 階 で 自 動 的 に 行 われるが 粘 性 の 高 いサンプルや 非 常 にクルードなサンプルを 用 いたときなどに 使 用 する 定 期 的 な 洗 浄 Desorb( 毎 週 1 回 が 目 安 ) IFC やフローセル 等 に 付 着 したタンパク 質 や 脂 質 を 洗 浄 する 操 作 である BIA メンテナンスキット 中 の BIAdesorb solution 1(0.5 % SDS 溶 液 )および BIAdesorb solution 2(50 mm Gly-NaOH ph 9.5)を 使 用 する

6.メンテナンス 57 Thermorack A をラックポジション 2( 右 側 )にセットし R2F3 に 3ml の BIAdesorb solution 1 を R2F4 に 3 ml の BIAdesorb solution 2 をセットして 行 う ( 所 要 時 間 約 22 分 間 ) BIACORE のメンテナンスにおいて Desorb は 非 常 に 重 要 である BIAdesorb solution 1 は 4 で 保 存 すると 結 晶 が 析 出 するので 室 温 におくこと センサーチップに 固 定 してあるリガンドは 失 活 するので 必 ず 洗 浄 用 のセン サーチップと 入 れ 替 えて 行 う 設 定 温 度 を 20 以 下 で 行 わない Sanitize( 毎 月 1 回 が 目 安 ) IFC やフローセルを 殺 菌 する 操 作 である BIAdisinfectant solution( 次 亜 塩 素 酸 ナトリウム 溶 液 )と 超 純 水 を 使 用 する ステップ 1:1.5 ml の BIAdisinfectant solution を BIA メンテナンスキット 内 の 専 用 の 容 器 に 入 れ 20 ml の 超 純 水 で 希 釈 し ランニング 緩 衝 液 の 位 置 に 置 き 実 行 する ステップ 2: 超 純 水 15 ml をランニング 緩 衝 液 の 位 置 に 置 き 実 行 する センサーチップに 固 定 してあるリガンドは 失 活 するので 必 ず 洗 浄 用 のセン サーチップと 入 れ 替 えて 行 う Sanitize 終 了 後 ランニング 緩 衝 液 あるいは 超 純 水 で Prime を 1~2 回 行 う 病 原 性 があるサンプル 等 を 使 用 したときには 適 時 Sanitize を 実 行 する 6-2. Airの 除 去 脱 気 していない 緩 衝 液 を 使 用 したり Air をインジェクトすると Air が 流 路 系 内 に 留 まってしまうことがある

58 6.メンテナンス このような 場 合 には 以 下 の 操 作 を 順 次 行 い Air の 除 去 を 確 認 する 1 Tools Working Tools Prime Flush あるいはRinseを 組 み 合 わせて 数 回 行 う 2 Tools Service Tools Uncloggingを 行 う... 3 充 分 脱 気 したランニング 緩 衝 液 をセットし Prime を 数 回 繰 り 返 す 上 記 のような 乱 れが 解 決 しない 場 合 には IFC(マイクロ 流 路 系 )の 劣 化 の 可 能 性 も 考 えられるので システムチェックを 行 って 機 械 の 状 態 を 把 握 する(59 ペ ージ 参 照 ) 6-3. 流 路 系 に 詰 まりがあるとき 不 溶 性 のサンプルや 吸 着 性 の 高 いサンプルを 使 用 した 場 合 には 流 路 が 詰 まる 場 合 がある このような 場 合 には センサーグラムに 乱 れが 発 生 したりする RU Rabbit IgG 1.25µg/ml 22370 22350 Response 22330 22310 22290 22270 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Time s Unclogging を 行 って 詰 まりを 除 去 する Tools Service Tools のUncloggingを 行 う これは ランニング 緩 衝 液 を 高 流 速 で 流 すことにより 詰 まりを 除 去 するもの である

6.メンテナンス 59 6-4. システムチェック ベースラインがドリフトするなど 機 械 の 調 子 が 思 わしくない 場 合 には 以 下 の 方 法 でシステムチェックを 行 う 使 用 するもの 1 新 しいセンサーチップ CM5( 使 用 しているチップは 使 用 できない) 2 HBS-EP 緩 衝 液 3 9mm ガラスバイアル 4 BIAtest soluton(bia maintenance kit) ( 方 法 ) BIA maintenance kit 中 の BIAtest solution 1 ml を 9 mm のガラスバイアルに 入 れ R2F1 にセットする(あらかじめ ラック 2 に Thermo_A をセットしておく) 空 の 9mm のガラスバイアル 4 本 を R2E1 から R2E4 にセットする Tools Test tools System checkをクリックする ( 所 要 時 間 : 約 40 分 ) Start をクリックする

60 6.メンテナンス ( 結 果 の 表 示 ) RU 40000 37000 34000 31000 28000 Re sponse 25000 22000 19000 16000 13000 10000 0 500 1000 1500 2000 2500 Time s (システムの 評 価 ) 約 40 分 間 のシステムチェック 終 了 後 上 記 のようなボックスが 表 示 される Evaluateをクリックする

6.メンテナンス 61 RESULTS A. IFC Serial Sequential Clip Fc 1: 22292 OK 21278 OK -5 OK Fc 2: 22330 OK 21130 OK 7 OK Fc 3: 22336 OK 21055 OK 45 OK Fc 4: 22319 OK 21066 OK 37 OK Fc 1-2: 13385 OK 10 OK Fc 3-4: 13467 OK 17 OK Fc 1-2-3-4: 22326 OK 45 OK Leaks: 23 OK B. Refractometer test 15% Sucrose Baseline level Fc 1: 22287 Fc 1: 19752 Fc 2: 22338 Fc 2: 19758 Fc 3: 22348 Fc 3: 19764 Fc 4: 22331 Fc 4: 19816 Average: 22326 ( 22000-23000 ) Average: 19773 Stdev: 27 ( < 200 ) Stdev: 29 ( < 300 ) C. Mixing Mix 1: 13385 Mix 2: 13467 Average: 13426 Difference (%): 1.2 OK Dilution factor: -0.20 Check! D. Noise Short term Stdev Long term Slope Fc 1: 0.08 ( < 0.2 RU ) Fc 1: 0.01 ( < 0.05 RU/s) Fc 2: 0.05 ( < 0.2 RU ) Fc 2: 0.00 ( < 0.05 RU/s) Fc 3: 0.06 ( < 0.2 RU ) Fc 3: 0.00 ( < 0.05 RU/s) Fc 4: 0.08 ( < 0.2 RU ) Fc 4: 0.01 ( < 0.05 RU/s) エラーがある 場 合 には 赤 色 で 表 示 される 次 ページの 解 説 にしたがって 対 処 す る それでもシステムの 調 子 が 思 わしくない 場 合 には 機 械 の 故 障 が 考 えられ る システムチェックはできるだけ 定 期 的 に 実 施 する

62 7.データ 管 理 7.データ 管 理 実 験 結 果 ファイルは 各 自 のフォルダー 内 に 保 存 する 各 自 のフォルダーは 以 下 の 方 法 で Bia Users フォルダーの 中 に 作 成 する 1My Computerから 作 成 する 方 法 Windows 初 期 画 面 の My computer( ) をクリックする Bia(C):をクリックし Bia Users のフォルダーをダブルクリックして 開 く File New Folderをクリックし フォルダー 名 入 力 後 Enterをクリックす る

7.データ 管 理 63 2Exploreから 作 成 する 方 法 Start Program Windows Explores をクリックする C:(ハードディスク)の 中 のBia Usersのフォルダーをハイライトにし File New Folderをクリックする フォルダー 名 を 入 力 し Enter をクリックする フォルダーの 作 成 における 注 意 事 項 解 説 自 分 のフォルダーは Bia Users の 中 に 作 成 する 他 のフォルダー 内 に 作 成 すると( 例 えば Biacore 等 ) ソフトウェアの 再 インストール 時 に 消 去 されてしまう 場 合 がある 各 自 のフォルダーの 中 に さらに 詳 細 なフォルダーを 作 成 することも 可 能 である 日 付 あるいは 実 験 内 容 など 細 かくフォルダーを 作 成 すると 便 利 である ファイルの 容 量 について 基 本 的 な 実 験 での 各 ファイルの 容 量 はおおよそ 以 下 のようになる 1 固 定 化 操 作 (アミンカップリング) 1 個 のフローセルを 使 用 した 場 合 約 20 kb 4 個 のフローセルを 使 用 した 場 合 約 76 kb (チオールカップリング) 1 個 のフローセルを 使 用 した 場 合 約 20 kb 2 相 互 作 用 の 検 討 1 個 のフローセル 使 用 5 サンプルの 場 合 約 90 kb 5 個 のフローセル 使 用 5 サンプルの 場 合 約 150 kb

64 8. プログラムの 説 明 8.プログラムの 説 明 ここでは 簡 単 なプログラムを 基 礎 から 理 解 することを 目 的 として 説 明 する BIACORE のプログラムは 基 本 的 に 1 つの MAIN ボックスと 1 つあるいは 複 数 個 の DEFINE APROG ボックスから 成 り 立 っている MAIN ボックスは Method の 諸 条 件 を 決 め DEFINE APROG ボックスで 実 際 の 実 験 操 作 を 行 う どちらのボッ クスも 最 後 の 行 に END を 入 力 してボックスを 括 る ステップ 1: MAIN ボックス 1 つのプログラムには 必 ず 1 つだけの MAIN ボックスが 存 在 する MAIN ボック スの 内 容 は 上 のコマンドから 順 次 実 行 する プログラムは MAIN ボックスだけ で 動 かすことができる 非 常 に 簡 単 な MAIN ボックスのみのプログラムを 示 すと 次 のようになる File New Method をクリックし 新 しいMethodボックスを 開 き プログラムを 入 力 する MAIN DETECTION 1 END Run Run Method をクリックすると プログラムを 実 行 する モニター 画 面 上 の 右 下 Status windowのdetectionが 1 に 設 定 されすぐにプログラムが 終 了 する このように MAINボックス 内 のコマンドを 実 行 する 次 に この MAIN を 少 しだけ 複 雑 にする 以 下 のプログラムを 入 力 する 同 様 に Run させる MAIN DETECTION 1 DETECTION 2 DETECTION 3 DETECTION 4 END Run させると DETECTION 1 2 3 4と 切 り 替 わり 終 了 する このように MAIN ボックスはコマンドを 上 から 順 番 に 実 行 していく

8. プログラムの 説 明 65 ( 参 考 ) MAIN ボックスだけを 使 用 し 便 利 な 洗 浄 プログラムを 組 むことができる プロ グラムで Working Tools 中 のメンテナンスコマンドを 実 行 することができる MAIN Prime Prime Rinse Rinse END 上 記 のように 入 力 後 Run させると Prime を 2 回 Rinse を 2 回 実 行 して 終 了 する しばらく BIACORE を 洗 浄 したいときに 便 利 である このように プログラム 中 に MAIN ボックスが 1 個 あれば プログラムは 実 行 さ れる また MAIN ボックスがないとプログラムを 実 行 させることができない ステップ 2: APROGボックス プログラムは MAIN ボックスがあれば Run させることができるが MAIN ボック スだけではサンプルの 添 加 等 の 実 験 操 作 を 行 うことはできない そこで APROG (Analysis Program の 略 )ボックスを 使 用 してこれらの 操 作 を 行 う ここでは サンプルを 1 回 インジェクトするプログラムを 作 成 してみる ラック 1 の R2A1 にサンプルをセットする このサンプルを 1 分 間 インジェクト するプログラムを 作 成 する DEFINE APROG injection FLOW 5 INJECT R2A1 5 END FLOW は 流 速 の 設 定 で この 場 合 5 μl/min になる DEFINE APROG injection の injection とは この APROG ボックスの 名 前 になる このプログラムを 入 力 し Run Prerun Methodを 行 うと 以 下 のような error が 表 示 される (Prerun Methodは 作 成 したプログラム 言 語 が 正 しいかどうか 検 索 するものである 29 ページ 参 照 )

66 8. プログラムの 説 明 >> Expecting keyword MAIN これは MAIN ボックスがないというメッセージである. プログラムは APROG ボックスだけで 実 行 することはできない 次 のプログラムのように MAIN ボックスを 使 用 して APROG ボックスを 行 う 命 令 を 入 力 する DEFINE APROG injection FLOW 5 INJECT R1A1 5 END MAIN END DETECTION 1 APROG injection まず MAIN ボックスを 順 番 に 実 行 し APROG injection で 上 記 の DEFINE APROG injection が 実 行 される APROG ボックスが 終 了 すると MAIN ボックスの END と なりプログラムが 終 了 する DEFINE APROG( 名 前 )と MAIN ボックスの APROG ( 名 前 )の 名 前 が 一 致 し ていないとプログラムは 実 行 されない

8. プログラムの 説 明 67 APROG を 数 回 繰 り 返 したい 場 合 には MAIN ボックスの APROG injection を 繰 り 返 したい 回 数 入 力 する 以 下 の 場 合 には APROG を 2 回 繰 り 返 して 実 行 する DEFINE APROG injection FLOW 5 INJECT R1A1 5 END MAIN END DETECTION 1 APROG injection APROG injection これを 少 し 変 形 すると APROG injection をフローセルを 変 えて 実 行 することが できる DEFINE APROG injection FLOW 5 INJECT R1A1 5 END MAIN END DETECTION 1 APROG injection DETECTION 2 APROG injection DETECTION 3 APROG injection DETECTION 4 APROG injection

68 8. プログラムの 説 明 ステップ 3: レポートポイント レポートポイントをとることで センサーグラムの 任 意 の 時 間 における 測 定 値 (RU)をセンサーグラムの 下 のレポートポイントテーブルに 表 示 させることが できる (14 ページ 参 照 ) この 表 がレポートポイントテーブルである このようなレポートポイントをプログラムでとることができる DEFINE APROG Injection FLOW 5 0:10 RPOINT 10 sec 0:20 RPOINT 20 sec 0:30 RPOINT 30 sec END MAIN END DETECTION 1 APROG injection センサーグラムをスタートさせた 後 任 意 の 時 間 でレポートポイントをとりこ む プログラム 中 の RPOINT の 前 の 時 間 がレポートポイントをとりこむ 時 間 とな る 0:20 RPOINT 20 sec

8. プログラムの 説 明 69 この 場 合 には センサーグラム 測 定 開 始 から 20 秒 後 にレポートポイントを 作 成 することになる プログラム 中 の RPOINT の 右 側 に 入 力 したもの( 例 えば 10 sec 20 sec 30 sec) はコメントなり 表 中 に 表 示 される レポートポイントテーブルの AbsResp は グラフ 上 の 値 ( 絶 対 値 ) RelResp は 設 定 したベースラインとの 差 ( 相 対 値 )に なる レポートポイントは 設 定 した 時 間 を 中 心 とした 5 秒 間 の 平 均 値 として 計 算 される(Window 5)

70 8. プログラムの 説 明 (アスタリスクマーク(*)を 使 用 した 時 間 設 定 の 仕 方 ) レポートポイントの 時 間 をセンサーグラム 開 始 からの 時 間 の 設 定 では 紛 らわし いので コマンドの 実 行 開 始 時 間 からの 設 定 にすることができる DEFINE APROG assay FLOW 5 * INJECT R1A1 5 0:10 RPOINT 10 sec 0:20 RPOINT 20 sec 0:30 RPOINT 30 sec * INJECT R1A1 5 0:10 RPOINT 10 sec 0:20 RPOINT 20 sec 0:30 RPOINT 30 sec END MAIN DETECTION 1 APROG assay END 例 えば 上 のプログラムの 0:10 RPOINT 10 sec は その 直 前 の * INJECT R1A1 5 の* 印 からの 時 間 つまり R1A1 のサンプルのインジェクション 開 始 時 間 から 10 秒 後 にレポートポイントを 作 成 することになる 上 のプログラムでは さら に 20 秒 後 30 秒 後 にレポートポイントをとるようになっている

8. プログラムの 説 明 71 (ベースラインの 取 り 方 ) サンプルの 結 合 量 を 表 示 させる 場 合 には インジェクトする 前 の 値 をベースラ インとし 結 合 量 をベースラインとの 相 対 値 で 表 示 させる プログラム 中 の RPOINT コマンドの 後 に-b と 入 力 すると 0:10 RPOINT 10 sec -b そのときの 値 がベースライン( 相 対 値 0)となり それ 以 後 の 値 がベースライン との 差 として 表 示 される DEFINE APROG assay FLOW 5 * INJECT R1A1 5 0:10 RPOINT 10 sec -b 0:20 RPOINT 20 sec 0:30 RPOINT 30 sec END

72 8. プログラムの 説 明 ステップ 4: DETECTIONとFLOWPATH BIACORE 3000 の 場 合 には 4 つのフローセルをそれぞれ 単 独 に 使 用 する 以 外 に いろいろな 組 み 合 わせで 直 列 に 流 して 分 析 を 行 うことができる これを 設 定 す るには 以 下 の 2 つのパラメーターを 設 定 する DETECTION : 検 出 のモード FLOWPATH : 流 路 の 設 定 DETECTION は 検 出 のモードのことである(MAIN ボックスで 設 定 ) FLOWPATH は 流 路 への 流 し 方 である(APROG ボックスで 設 定 ) それぞれは 以 下 の 組 み 合 わせの 中 から 設 定 できる FLOWPATH (APROG) DETECTION (MAIN) 1 1 2 2 3 3 4 4 1,2 1,2 1,2(フローセル 1 をコントロールとする 場 合 ) 2-1 3,4 3,4 3,4(フローセル 3 をコントロールとする 場 合 ) 4-3 1,2,3,4 1,2,3,4 1,2,3,4(フローセル 1 をコントロールとする 場 合 ) 2-1,3-1,4-1 1,2,3,4(フローセル 1 および 3 をコントロールとする 場 合 ) 2-1,4-3

8. プログラムの 説 明 73 実 験 の 途 中 で FLOWPATH を 変 更 することができる FLOWPATH 1 FLOWPATH 2 FLOWPATH 3 FLOWPATH 4 FLOWPATH 1,2 FLOWPATH 1,2,3,4 上 の 中 から 選 択 することができる 途 中 で FLOWPATH を 変 更 する 場 合 には DETECTION モードは 必 ず DETECTION 1,2,3,4 に 設 定 する DEFINE APROG path FLOW 10 FLOWPATH 1 FLOWPATH 2 FLOWPATH 3 FLOWPATH 4 END MAIN END DETECTION 1,2,3,4 APROG path 上 のプログラムではスタート 後 FLOWPATH が 順 番 に 変 更 される

74 8. プログラムの 説 明 DEFINE APROG path FLOW 10 FLOWPATH 1 INJECT R1A1 10 FLOWPATH 2 INJECT R1A1 10 FLOWPATH 3 INJECT R1A1 10 FLOWPATH 4 INJECT R1A1 10 END MAIN END DETECTION 1,2,3,4 APROG path 上 のプログラムの 場 合 FLOWPATH 1 にした 後 R1A1 をインジェクトし さら に FLOWPATH 2 FLOWPATH 3 FLOWPATH 4 と 随 時 流 路 を 変 更 し R1A1 のサ ンプルをインジェクトすることになる

8. プログラムの 説 明 75 ステップ 5: 固 定 化 のプログラム C:\Program Files\Biacore 3000\Guide\Methods とフォルダーを 開 け 固 定 化 のプログラムである Amine.blm をクリックし ファイルを 呼 び 出 す DEFINE APROG immob CAPTION Amine coupling FLOW 10 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E3 70-0:10 RPOINT Baseline -b INJECT R2A1 70 INJECT R2E4 70 * INJECT R2F3 10 2:00 RPOINT immob END MAIN RACK 1 thermo_c RACK R Reag_a RACK 2 thermo_a DETECTION 1 APROG immob APPEND Standby END 今 までどおりMAINを 順 番 に 実 行 する RACK 1 thermo_bはラックベースの 設 定 であるが あらかじめCommand Rack Base で 設 定 している 場 合 には 削 除 しても 差 し 支 えない なお RACK R は 中 央 のラックベース 位 置 である この 位 置 にはReag_Aのみ 設 定 することができる APROG 中 には FLOWPATHの 設 定 を 行 っていないが FLOWPATHを 設 定 しない 場 合 には DETECTIONモードで 自 動 的 に 設 定 される

76 8. プログラムの 説 明 DETECTION 1 FLOWPATH 1 DETECTION 2 FLOWPATH 2 DETECTION 3 FLOWPATH 3 DETECTION 4 FLOWPATH 4 DETECTION 1,2,3,4 FLOWPATH 1,2,3,4 ( 説 明 ) APROG ボックス CAPTION センサーグラムのタイトル この 場 合 には タイトルが Amine coupling に なる センサーグラムのタイトルを 入 力 することができる FLOW 10 流 速 を 10 μl/min に 設 定 する DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 NHS と EDC の 混 合 液 を 調 製 する R2E1 に EDC 溶 液 を R2E2 に NHS 溶 液 を セット( 逆 でも 可 )し R2E3 に 混 合 するための 空 容 器 をセットする 50 は R2E1 のサンプルの 割 合 であり 50%である この 混 合 液 は 200μl 作 製 する INJECT R2E3 70 R2E3 で 作 成 した 混 合 液 70 μl をインジェクトする 流 速 が 10 μl/min なので 7 分 間 のコンタクトタイムになる( 目 的 によりこの 時 間 を 変 更 する) INJECT R2A1 70 R2A1 にセットされたリガンドを 70 μl インジェクトする ( 目 的 によりこの 時 間 を 変 更 する) INJECT R2E4 70 R2E4 にセットされたエタノールアミンを 70 μl インジェクトする ( 通 常 は NHS 活 性 化 時 間 と 同 じ 時 間 にする) INJECT R2F3 10 洗 浄 溶 液 をインジェクトする ( 例 )50 mm NaOH 等

8. プログラムの 説 明 77 MAIN ボックス DETECTION 1 検 出 モードをフローセル 1 にする APROG immob APROG immob を 実 行 する APPEND Standby すべてのプログラムを 終 了 したら Standby 状 態 (すべてのフローセルに 5 μl/min の 流 速 でランニング 緩 衝 液 を 流 すコマンド 54 ページ 参 照 ) プログラム 作 成 のときは 通 常 は 最 後 に APPEND Standby と 入 力 する このプログラムを 実 行 すると 通 常 以 下 のような 結 果 が 得 られる

78 8. プログラムの 説 明 ( 複 数 のフローセルに 同 じサンプルを 固 定 するプログラム) 75 ページのプログラムにおいて DETECTION を 1,2,3,4 に 変 更 すると 同 じ 固 定 化 を 4 個 のフローセルに 同 時 に 実 行 することができる この 場 合 には 流 速 を 20 μl/min に 上 げることで フローセル 間 のラグタイムを 短 縮 し それぞれの 固 定 化 量 を 再 現 性 よく 得 ることができる DEFINE APROG immob CAPTION amine coupling(fc=1,2,3,4) FLOW 20 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E3 140-0:10 RPOINT Baseline -b INJECT R2A1 140 INJECT R2E4 140 * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT immob END MAIN DETECTION 1,2,3,4 APROG immob APPEND Standby END

8. プログラムの 説 明 79 (それぞれのフローセルに 異 なったリガンドを 固 定 化 する) それぞれのフローセルに 異 なったリガンドを 同 じプログラムで 固 定 化 するこ ともできる 下 のプログラムの 場 合 2 個 のフローセルについて 同 時 に NHS 活 性 化 した 後 に 各 フローセルに 別 々のリガンドを 固 定 化 し さらに 2 つのフローセルを 同 時 にエタノールアミンでブロッキングするプログラムである DEFINE APROG immob CAPTION Amine coupling FLOW 10 FLOWPATH 1,2 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E3 70-0:10 RPOINT Baseline -b FLOWPATH 1 INJECT R2A1 70 FLOWPATH 2 INJECT R2A2 70 FLOWPATH 1,2 INJECT R2E4 70 * INJECT R2F3 10 2:00 RPOINT immob END MAIN DETECTION 1,2 APROG immob APPEND Standby END 活 性 化 された NHS 基 の 安 定 性 が 悪 いため 上 記 のようなプログラムで 行 うと 後 半 の 固 定 化 量 が 低 くなる 傾 向 がある 同 一 条 件 で 異 なるリガンドを 固 定 化 す る 場 合 には NHS の 活 性 化 から 別 々に 行 う 以 下 のプログラムで 行 う 方 がよい

80 8. プログラムの 説 明 このプログラムでは 2 個 の APROG を 作 成 し それぞれの APROG をフローセル を 変 更 して 実 行 する DEFINE APROG immob1 CAPTION Amine coupling(flowcell1) FLOW 10 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E3 70-0:10 RPOINT Baseline -b INJECT R2A1 70 INJECT R2E4 70 * INJECT R2F3 10 2:00 RPOINT immob END DEFINE APROG immob2 CAPTION Amine coupling(flowcell2) FLOW 10 DILUTE R2E5 R2E6 R2E7 50 * INJECT R2E7 70-0:10 RPOINT Baseline -b INJECT R2B1 70 INJECT R2E8 70 * INJECT R2F3 10 2:00 RPOINT immob END MAIN DETECTION 1 APROG immob1 DETECTION 2 APROG immob2 APPEND Standby END

8. プログラムの 説 明 81 (4つのフローセルに 1 つのリガンドを 固 定 化 量 を 変 えて 固 定 する) 各 フローセルでリガンドのインジェクト 時 間 を 変 えて 固 定 化 量 を 変 化 させるこ とができる DETECTION および FLOWCELL を 1,2,3,4 に 設 定 し リガンドのインジェクトのコ マンドを 以 下 のように 変 更 する INJECT R2A1 70,35,20,10 このようにするとリガンドがフローセル 1,2,3,4 にそれぞれ 70 μl 35μl 20 μl 10 μl 流 れ 固 定 化 量 を 変 化 させることができる RU 40000 Gradient surface 35000 30000 Response 25000 20000 15000 10000 5000 0 500 1000 1500 2000 Time s DEFINE APROG immob CAPTION Amine coupling FLOW 10 DILUTE R2E1 R2E2 R2E3 50 * INJECT R2E3 70-0:10 RPOINT Baseline -b INJECT R2A1 70,35,20,10 * INJECT R2E4 70 8:00 RPOINT immob END MAIN DETECTION 1,2,3,4 APROG immob APPEND Standby END

82 8. プログラムの 説 明 ステップ 6: 相 互 作 用 のプログラム 相 互 作 用 のプログラムは 基 本 的 に 固 定 化 のプログラムと 同 様 である ここで サンプルを 2 分 間 インジェクトするプログラムを 作 成 してみる ここでは R2A1 に 置 いたサンプルをインジェクトするプログラムを 作 成 する DEFINE APROG assay FLOW 20 FLOWPATH 1 INJECT R2A1 40 END MAIN DETECTION 1 APROG assay APPEND Standby END.. このプログラムは R2A1 という 固 定 の 位 置 にサンプルを 1 個 置 いた 場 合 のプロ グラムであるが 通 常 の 実 験 では サンプルは 複 数 個 あり サンプルのポジシ ョンが 毎 回 変 わってくることになる 次 に 3 つのサンプルを 同 じプログラムで 測 定 するプログラムを 作 成 してみる 下 のプログラムの 場 合 サンプルは R2A1 R2A2 R2A3 にある DEFINE APROG assay PARAM %pos FLOW 20 FLOWPATH 1 INJECT %pos 40 END MAIN END DETECTION 1 APROG assay APROG assay APROG assay APPEND Standby R2A1 R2A2 R2A3

8. プログラムの 説 明 83 BIACORE のプログラムでは パラメーターは%で 表 示 する この 場 合 には サン プルのポジションが 毎 回 異 なるので INJECT %pos と 入 力 する パラメータ ーとして%pos があるので PARAM %pos と 入 力 する MAIN ボックスに APROG assay があるので APROG assay が 実 行 されるが APROG assay R2A1 と 入 力 す ると R2A1 がサンプル 位 置 (%POS)になり 2 回 目 は R2A2 3 回 目 は R2A3 がサンプル 位 置 になる このようなプログラムを 作 成 すると サンプル 位 置 が 異 なる 分 析 を 行 うことができる さらにサンプル 数 を 増 やしたい 場 合 には APROG assay サンプル 位 置 をコピー/ペーストして 増 やし ポジションを 変 更 していく 通 常 の 相 互 作 用 の 検 討 の 場 合 には アナライト 結 合 後 再 生 溶 液 で 再 生 を 行 う ので 以 下 のようなプログラムになる DEFINE APROG assay PARAM %pos FLOW 20 FLOWPATH 1 * INJECT %pos 40-0:10 RPOINT baseline b 2:20 RPOINT bound * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT regeneration END MAIN END DETECTION 1 APROG assay R2A1 APROG assay R2A2 APROG assay R2A3 APPEND Standby

84 8. プログラムの 説 明 ( 変 数 が 2 つ 以 上 ある 場 合 のプログラムの 作 成 ) プログラムの 中 に 変 数 ( 毎 回 変 化 するもの)が 2 つ 以 上 ある 場 合 でも 基 本 的 に 同 じ 方 法 をとる 例 えば サンプルのポジションとインジェクト 容 量 の 2 個 の パラメーターが 毎 回 変 化 する 場 合 のプログラムは 以 下 のようになる サンプルは R2A1 R2A2 R2A3 の 3 つのサンプルで それぞれを 10 μl 20 μl 30 μl と 異 なった 量 をインジェクトするとする DEFINE APROG assay PARAM %pos %vol FLOW 20 FLOWPATH 1 * INJECT %pos %vol -0:10 RPOINT baseline b 2:20 RPOINT bound * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT regeneration MAIN DETECTION 1 APROG assay R2A1 10 APROG assay R2A2 20 APROG assay R2A3 30 APPEND Standby END この 場 合 には 変 数 が% pos と% vol と 2 個 になる PARAM % pos % vol となり INJECT % pos % vol と 入 力 する さらに MAIN ボックス 中 の APROG assay の 後 に PARAM % pos % vol の 順 番 でそれぞれを 入 力 する つまり 1 回 目 は R2A1 のポジションで 10 μl( APROG assay R2A1 10) 2 回 目 は R2A2 のポジションで 20 μl( APROG assay R2A2 20) 3 回 目 は R2A3 のポジションで 30 μl( APROG assay R2A3 30) と 入 力 する APROG の 後 は PRAM で 設 定 した 変 数 内 容 の 順 番 で 入 力 する

8. プログラムの 説 明 85 ( 相 互 作 用 の 検 出 のための 基 本 的 なプログラム) 実 際 に 相 互 作 用 を 分 析 する 有 効 なプログラムを 作 成 してみる 実 験 のモデルとして 以 下 の 条 件 を 想 定 する フローセル 1 :コントロール フローセル 2 : 抗 体 固 定 化 フローセル アナライト : 抗 原 (2 種 類 2 濃 度 ) (サンプル) 1 Antigen_1 2 Antigen_1 3 Antigen_2 4 Antigen_2 25 μg/ml 12.5 μg/ml 25 μg/ml 12.5 μg/ml DEFINE APROG assay PARAM %pos %ID %conc CAPTION Binding of %ID(%conc) to immobilized antibody FLOW 20 FLOWPATH 1,2 * KINJECT %pos 60 180-0:10 RPOINT Baseline -b 3:20 RPOINT bound * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT regeneration END MAIN DETECTION 2-1 APROG assay R2A1 antigen_1 25ug/ml APROG assay R2A2 antigen_1 12.5ug/ml APROG assay R2A3 antigen_2 25ug/ml APROG assay R2A4 antigen_2 12.5ug/ml APPEND Standby END

86 8. プログラムの 説 明 このプログラムでは プログラム 上 で 変 数 となるのは サンプル 位 置 のみであ るが % ID(サンプルの 種 類 )および% conc(サンプル 濃 度 )と 変 数 として 入 力 することで 各 サンプルポジションにおけるサンプル 名 および 濃 度 を 具 体 的 に 入 力 して 表 示 し 記 録 することができる CAPTION Binding of % ID(%conc) to immobilized antibody を 記 載 しておくと センサーグラムのタイトルに%ID と% conc がそのまま 代 入 され 1 つめのサンプルでは タイトルが Binding of Antigen_1(25 ug/ml) to immobilized antibody となり 2 つめのサンプルでは Binding of Antigen_1(12.5 ug/ml) to immobilized antibody となって センサーグラムグラフのタイトルを 見 るだけでどのようなサンプル を 使 用 した 場 合 か 簡 単 に 分 かって 非 常 に 便 利 である 通 常 は このプログラムを 使 用 して( 必 要 があればインジェクト 容 量 などを 変 化 した) 測 定 すればよい このプログラムでは 変 数 がサンプル 位 置 だけなので タイトル 表 示 やサンプ ルの 記 載 等 を 必 要 としない 場 合 には 下 のような 簡 単 なプログラムを 作 成 して 実 験 を 行 ってもよい DEFINE APROG assay PARAM %pos FLOW 20 FLOWPATH 1,2 * INJECT %pos 40-0:10 RPOINT baseline b 2:20 RPOINT bound * INJECT R2F3 20 2:00 RPOINT regeneration MAIN DETECTION 2-1 APROG assay R2A1 APROG assay R2A2 APROG assay R2A3 APPEND Standby END

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 87 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 汎 用 性 の 高 い 実 験 方 法 に 関 して Wizard が 設 定 されており これを 使 用 するこ とにより 簡 単 に 実 験 を 進 めることができる 予 備 実 験 から 対 照 実 験 結 果 の 評 価 までの 一 連 の 流 れを 手 助 けしてくれる Application wizard には 以 下 のものがある Surface preparation Binding analysis Kinetic analysis Customized Application 9-1.Surface preparation 9-1-1. Immobilization ph scouting 固 定 化 する 際 のリガンド 希 釈 液 の 選 択 を 行 うためのスカウティング 操 作 9-1-2. Immobilization 固 定 化 操 作 の Wizard 固 定 化 量 の 調 節 等 が 簡 単 にできる 9-1-3. Regeneration scouting アナライトの 再 生 条 件 を 確 立 するための 再 生 溶 液 スカウティング 操 作 9-1-4. Surface performance test 再 生 溶 液 条 件 によるリガンドの 安 定 性 試 験 9-2.Binding analysis 固 定 化 終 了 後 に 各 種 アナライトの 結 合 の 有 無 を 調 べたい 場 合 に 使 用 する スクリーニングに 使 用 すると 便 利 である

88 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-3.Kinetic analysis 9-3-1. Concentration series 各 種 のアナライト 濃 度 のサンプルを 用 意 し 全 自 動 でおおよその 結 合 速 度 定 数 (k a 単 位 M -1 s -1 )および 解 離 速 度 定 数 (k d 単 位 s -1 )を 算 出 させる Wizard で ある 得 られるデータを BIAevaluation3.0 で 解 析 することもできる 9-3-2. Control experiments( 各 種 のコントロール 実 験 ) 1) Mass transfer control: リガンドの 固 定 化 量 が 多 すぎて マストランスポートリミテッド 状 態 になっ ているかどうかを 調 べるものである 2) Linked reaction: 固 定 化 したリガンドとアナライトが 1:1 の 反 応 なの か 複 雑 な 反 応 様 式 なのかを 調 べるものである 9-4.Customized Application 任 意 に 実 験 を 組 み 立 てるための Wizard である かなり 複 雑 な 操 作 を 簡 単 に 設 定 することができる 以 下 これらの Wizard を 説 明 する

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 89 9-1.Surface preparations 9-1-1.pH スカウティング 固 定 化 したいリガンドの 等 電 点 が 不 明 な 場 合 には 各 種 の ph の 10mM 酢 酸 緩 衝 液 に 希 釈 した 同 一 濃 度 のリガンド 溶 液 をセンサー 表 面 にインジェクトし デキ ストランへの 濃 縮 の 程 度 を 見 ることができる リガンド(5~100μg/ml 10mM 酢 酸 緩 衝 液 ph4~6) 洗 浄 溶 液 (50mM NaOH) Run Run Application Wizard をクリックする Surface Preparation を 選 択 し Start をクリックする

90 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Immobilization ph Scouting を 選 択 し Next>をクリックする 使 用 する ph の 酢 酸 緩 衝 液 にチェックを 入 れ Next>をクリックする 濃 縮 効 果 が 見 られる ph は ph5~4 の 範 囲 にある 場 合 が 多 い また ph3.5 以 下 の 緩 衝 液 は 使 用 しない 表 示 された 緩 衝 液 以 外 を 使 用 する 場 合 には Add をクリックして 設 定 する リガンド 名 インジェクト 時 間 ( 分 ) 流 速 (μl/min) 使 用 するセルを 選 択 し Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 91 ph スカウティング 終 了 後 非 特 異 的 に 結 合 したリガンドを 洗 浄 溶 液 で 洗 浄 する 2 段 階 (2 種 類 の 洗 浄 溶 液 )を 使 用 する 場 合 には Wash Method の Two Injections をクリックする 洗 浄 溶 液 名 および 条 件 を 入 力 し Next>をクリックする 洗 浄 溶 液 は 最 後 のリガンドを 添 加 した 後 に 添 加 される それぞれの ph のリ ガンドを 添 加 した 際 には 洗 浄 操 作 は 行 われない 洗 浄 溶 液 は 高 イオン 強 度 あるいは 高 い ph の 溶 液 での 洗 浄 を 推 奨 する(た とえば 3M NaCl,50mM NaOH, 1M Etnaolamine-HCl,pH8.5 等 )

92 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプルの 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し(101 ページ 参 照 ) Next>をクリックす る

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 93 サンプルの 位 置 容 量 を 再 度 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 実 験 がスタートする

94 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ( 実 験 結 果 の 表 示 ) 実 験 が 終 了 すると 以 下 のような 結 果 が 表 示 される さらに 以 下 のようなレポートも 表 示 される

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 95 上 記 の 結 果 から 使 用 する ph を 決 める ( 結 果 の 評 価 ) 一 般 的 には 濃 縮 効 果 が 得 られる 最 も 高 い ph の 条 件 を 用 いて 固 定 化 する 濃 縮 効 果 および 使 用 しているリガンドの 安 定 性 等 を 考 慮 して 最 終 的 に 決 定 する 基 本 的 に 濃 縮 効 果 が 得 られる 条 件 では 固 定 化 が 可 能 である

96 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-1-2.Immobilization( 固 定 化 操 作 ) ~アミンカップリングによる 固 定 化 方 法 この 方 法 は アミンカップリングによりリガンドを 固 定 化 する 方 法 である そ の 他 の 固 定 化 方 法 (チオールカップリング アルデヒドカップリング)につい ては Wizard Template(172 ページ)を 参 照 すること Run Run Application Wizard をクリックする Surface Preparation を 選 択 し Start をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 97 Immobilization を 選 択 し Next>をクリックする センサーチップ(CM5)および 固 定 化 方 法 (Amine Coupling)を 選 択 し Next> をクリックする

98 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Aim for Immobilized Level(99 ページ 参 照 ) 目 的 の 固 定 化 量 に 調 節 したい 場 合 に 使 用 Specify Flow Rate and Injection Time(107 ページ 参 照 ) 決 められた 条 件 (リガンドインジェクト 時 の 流 速 とインジェクト 時 間 の み 設 定 )で 行 う 場 合 に 選 択 する いずれかを 選 択 し Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 99 1 Aim for Immobilized Level あらかじめ 目 的 の 固 定 化 量 を 設 定 して 固 定 化 操 作 を 行 う 場 合 に 使 用 する Wizard である 流 速 は 5μl/min NHS 活 性 化 時 間 エタノールアミン 不 活 性 化 時 間 はそれ ぞれ 7 分 間 に 固 定 化 されており 変 更 はできない Aim for Immobilized Level 選 択 し を Next>をクリックする 固 定 化 したいリガンド 名 を 固 定 化 するフローセルに 入 力 し 目 的 の 固 定 化 量 (RU) 洗 浄 溶 液 を 入 力 し Next>をクリックする

100 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ( 補 足 ) 1 複 数 の 固 定 化 を 同 時 に 行 うこともできる この 場 合 には それぞれのフローセルに 同 様 にリガンド 名 固 定 化 量 を 入 力 する 2フローセル 1 および 3 をブランクコントロールとして 使 用 することができる この 場 合 には Blank にマーク( )を 入 力 すると NHS 活 性 化 後 そのままエタノールアミンで ブロッキングしたセルを 作 製 する 3 何 も 処 理 していないフローセルをコントロールにしたい 場 合 には この 画 面 上 では 処 理 を 行 わない 4ブランクコントロールのセルは フローセル 1 および 3 にすると 後 の 実 験 に 便 利 であ る

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 101 リガンドや 試 薬 のバイアルのセット 位 置 がラックベース 上 に 表 示 される バイアルのセット 位 置 を 変 更 する 場 合 には ラック 上 のバイアルにカーソル を 移 動 し ドラッグして 好 きな 場 所 に 移 動 することができる その 場 合 には 上 部 表 中 のサンプル 位 置 も 自 動 的 に 変 更 される サンプル 位 置 の 変 更 にとも ない バイアルの 大 きさが 変 わる 場 合 には サンプル 必 要 量 も 変 更 されるの で 注 意 すること

102 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 (サンプル 位 置 の 変 更 例 ) 毎 回 同 じ 設 定 で 固 定 化 したい 場 合 には この 設 定 を 保 存 することもできる Menu Template Save As で 保 存 する Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 103 バイアル 位 置 およびサンプル 容 量 に 間 違 いがないことを 確 認 して Start をクリッ クする 保 存 先 のフォルダーを 選 択 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 固 定 化 操 作 が 開 始 される

104 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 固 定 化 が 終 了 すると 上 記 の 様 なレポートが 表 示 される Response 1. リガンド 添 加 の 前 後 でのレスポンスの 比 較 Response 2. NHS 活 性 前 とエタノールアミン 添 加 後 のレスポンスの 比 較 固 定 化 量 が 少 ない 場 合 (1000RU 以 下 )には Response 1.を 参 考 にする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 105 ( 補 足 ) この Wizard では 固 定 化 操 作 に 入 る 前 に リガンド 溶 液 をフローセルにテストインジェク トし プレコンセントレーション 効 果 がえられるか?また 目 的 の 固 定 化 量 に 固 定 化 できる 条 件 であるかを 機 械 的 に 判 断 する セットしたリガンド 溶 液 に 問 題 がある 場 合 には この 時 点 でプログラムが 自 動 的 に 終 了 す る この 場 合 フローセルにはリガンドは 固 定 化 されていないので リガンド 溶 液 を 調 製 しなおして 同 じフローセルに 再 度 固 定 化 操 作 を 試 みる リガンド 溶 液 に 問 題 がある 場 合 には 以 下 のような 表 示 が 出 る 1プレコンセントレーション 効 果 が 少 なすぎる 場 合 テストインジェクトにおいてリガンドの 濃 縮 が 観 察 されなかった 場 合 もしくはあまりに も 濃 縮 がゆっくりしているため 添 加 時 間 を 長 くしても 目 標 のレベルまで 固 定 化 できそう もない と 判 断 される 場 合 は 上 のようなメッセージが 表 示 され 固 定 化 操 作 が 中 止 される この 場 合 には 希 釈 緩 衝 液 の ph を 下 げるか リガンド 濃 度 を 上 げて プレコンセントレ ーション 効 果 を 上 げて 固 定 化 操 作 をやり 直 す

106 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 2プレコンセントレーション 効 果 が 高 すぎる 場 合 テストインジェクトにおいてリガンドの 濃 縮 が 高 すぎて 添 加 時 間 を 短 くしても 目 標 のレ ベル 以 上 に 固 定 化 されてしまうと 判 断 される 場 合 は 上 のようなメッセージが 表 示 され 固 定 化 操 作 が 中 止 される この 場 合 には 希 釈 緩 衝 液 の ph を 上 げるか リガンド 濃 度 を 下 げて プレコンセントレ ーション 効 果 を 下 げて 固 定 化 操 作 をやり 直 す

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 107 2 Specify Flow Rate and Injection Time リガンドのインジェクトの 際 の 流 速 およびインジェクト 時 間 だけを 設 定 して 固 定 化 を 行 う Wizard である 決 められた 固 定 化 方 法 を 繰 り 返 すような 場 合 に 簡 単 で 便 利 である 実 験 条 件 流 速 時 間 NHS 活 性 化 5μl/min 7 分 間 リガンドインジェクト 自 由 に 設 定 自 由 に 設 定 エタノールアミン 不 活 性 化 5μl/min 7 分 間 Specify Flow Rate and Injection Time を 選 択 し Next>をクリックする

108 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 使 用 するフローセルに 固 定 化 するリガンドの 名 前 を 入 力 し リガンドインジェ クト 時 間 および 流 速 を 設 定 し Next>をクリックする サンプルのポジションが 表 示 されるので 指 示 どおりにサンプルをセットする か もしくはサンプルの 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 (101 ページ 参 照 )し Next >をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 109 サンプルの 位 置 および 容 量 を 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 固 定 化 操 作 が 開 始 される

110 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 さらに 固 定 化 量 が 下 のように 表 示 される Response 1 および 2 についての 解 説 は 104 ページ 参 照 のこと

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 111 9-1-3. Regeneration scouting ( 再 生 条 件 検 討 実 験 ) 固 定 化 操 作 を 終 了 後 アナライトとの 相 互 作 用 を 分 析 するにあたって アナラ イトの 再 生 条 件 を 検 討 する 必 要 がある 再 生 条 件 として 以 下 を 満 たす 必 要 がある 1 結 合 したアナライトを 完 全 に 再 生 できること 2 固 定 化 したリガンドが 失 活 しないこと 3リガンドが デキストランから 脱 落 しないこと 再 生 条 件 検 討 のための Wizard が Regeneration scouting である Regeneration scouting を 選 択 し Next>をクリックする

112 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 アナライトの 名 前 インジェクト 時 間 および 流 速 を 入 力 し 使 用 するフロー セルを 設 定 し Next>をクリックする 指 定 された 場 所 にアナライトを 置 くか 位 置 を 変 更 し Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 113 サンプル 位 置 および 容 量 を 再 度 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 開 き ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 実 験 が 開 始 される

114 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 RU 16000 Regeneration Scouting 15800 15600 15400 Re s p ons e 15200 15000 14800 14600 14400 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Time s センサーグラムがスタートし アナライトがインジェクトされる 上 のようなボックスが 開 いたら Regeneration をクリックする (アナライトの 結 合 量 が 少 ない 場 合 には Add Analyte をクリックすると ア ナライトを 再 度 添 加 できる)

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 115 使 用 する 再 生 溶 液 を 選 択 し インジェクト 時 間 流 速 バイアル 位 置 を 設 定 し Start をクリックする 再 生 溶 液 の 1 回 のインジェクトは 30 秒 ~1 分 間 程 度 とし 再 生 が 不 充 分 な 場 合 には この 短 いインジェクトを 複 数 回 繰 り 返 すようにする ボックスの 中 に 使 用 したい 再 生 溶 液 がない 場 合 には Add をクリックして 溶 液 名 を 入 力 し OK をクリックし 再 生 溶 液 を 追 加 する RU 16000 Regeneration Scouting 15800 15600 15400 Response 15200 15000 14800 14600 14400 14200 14000 0 100 200 300 400 500 600 700 Time s

116 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 1 つ 目 の 再 生 溶 液 がインジェクトされ 再 生 状 況 がモニターできる さらに 異 なる 再 生 溶 液 を 試 みる 場 合 には Regeneration をクリックし その 他 の 再 生 溶 液 の 効 果 を 見 ていく RU 16000 Regeneration Scouting Re s ponse 15700 15400 15100 14800 14500 14200 13900 13600 13300 13000 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time s 終 了 する 場 合 には Finish をクリックする ( 結 果 の 評 価 ) 再 生 効 率 が 20%よりも 少 ない(Analyte が 80% 以 上 残 る) 場 合 には 再 生 溶 液 の 条 件 を 厳 しくする (ph を 低 くする イオン 強 度 を 上 げる 等 ) 再 生 効 率 が 20~80%の(Analyte が 80~20% 残 る) 場 合 には 繰 り 返 し 同 じ 再 生 溶 液 を 2 回 添 加 してみる 最 初 の 添 加 で 再 生 効 率 が 90%もしくはそれ 以 上 の 場 合 (=ほとんど 再 生 さ れる 場 合 )には もう 少 しマイルドな 条 件 の 再 生 溶 液 を 使 える 可 能 性 がある

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 117 9-1-4.Surface Performance Test ph Scouting Wizard 等 で 決 めた 再 生 条 件 について この 条 件 が 適 している 条 件 で あるかをテストするものである ここでは 次 のような 項 目 を 確 認 する 1 同 一 濃 度 のアナライト 結 合 量 が 各 サイクルで 変 化 がないか(リガンド の 失 活 は 起 きていないか) 2 再 生 が 各 サイクルで 十 分 できているか 3 ベースラインが 各 サイクルで 変 化 しないか Surface Preparation Test を 選 択 し Next>をクリックする アナライト 名 を 入 力 し インジェクト 時 間 ( 分 ) 流 速 (μl/min) 分 析 回 数 お よび 使 用 フローセルを 指 定 し Next>をクリックする

118 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 再 生 溶 液 を 入 力 し 再 生 回 数 再 生 時 間 等 を 入 力 し Next>をクリックする ( 注 意 ) 再 生 条 件 は 以 下 の3つのうちから 選 ぶことができる バッファーによる 解 離 ランニング 緩 衝 液 のみを 流 してアナライトを 解 離 させる ( 解 離 速 度 が 非 常 に 速 いアナライトのみに 使 用 可 能 ) シングルインジェクション 再 生 溶 液 を 1 回 添 加 する ( 最 も 一 般 的 な 方 法 ) ツーインジェクション 再 生 溶 液 を 2 回 添 加 する ( 上 の2つで 再 生 できないような 場 合 に 有 効 なことがある)

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 119 サンプル 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする

120 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプル 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Start>をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 再 生 条 件 の 検 討 を 開 始 する

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 121 ( 再 生 条 件 の 評 価 ) Baseline Level および Response Level が 表 示 される Baseline Level は 各 サイクルのベースラインレベルの 変 化 Response Level は 各 サ イクルの 同 一 濃 度 のアナライトの 結 合 量 の 変 化 を 表 している はっきりとした 傾 向 がなく 変 動 の 幅 が 小 さい 場 合 は 無 視 することができる しかし ベースラインが 上 昇 していく 傾 向 があるときは 一 般 的 に 再 生 が 不 充 分 でアナライトが 蓄 積 していることが 考 えられる レスポンスの 変 動 がなく 一 定 の 場 合 には ベースラインが 幾 分 か 減 少 しても あまり 問 題 にはならない しかしベースラインの 減 少 とともにレスポンスの 減 少 が 見 られる 場 合 は 再 生 操 作 中 にリガンドがセンサーチップから 外 れている 可 能 性 が 考 えられるので 注 意 が 必 要 である 一 方 Response Level が 減 少 しているときは 再 生 によりリガンドがダメージを 受 けていることが 考 えられる また アナライトが 蓄 積 していくと アナライ トが 結 合 できるキャパシティーを 減 少 することもあるので 注 意 が 必 要 である 以 上 をまとめて 下 に 表 示 すると ベースラインおよびアナライトのレスポンス に 明 らかな 変 動 がある 場 合 1Baseline Level 低 下 ()および Response Level 低 下 ()の 場 合 再 生 操 作 によりリガンドが 遊 離 していることが 考 えられる 2Baseline Level 不 変 ( )および Response Level 低 下 ()の 場 合 再 生 操 作 によりリガンドが 失 活 していることが 考 えられる 3Baseline Level 上 昇 ( )および Response Level 低 下 ()の 場 合 再 生 操 作 によってもアナライトが 完 全 に 遊 離 していないことが 考 えられる

122 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-2.Binding analysis( 特 異 的 結 合 実 験 ) 各 種 アナライトの 結 合 の 有 無 を 調 べたい 場 合 に 使 用 する Wizard である スクリーニング 等 の 多 検 体 の 分 析 に 使 用 する Run Application Wizard をクリックする Binding Analysis を 選 択 し Start をクリックする Direct Binding を 選 択 し Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 123 使 用 するフローセル 流 速 サンプルインジェクト 回 数 ( 同 一 サンプルのイン ジェクション 回 数 )およびインジェクション 時 間 ( 分 )を 入 力 し Next> をクリックする Wait After Injection: はそのままにしておく 多 段 階 の 反 応 を 見 る 場 合 には Number of Sample Injections:の 数 字 を 増 加 させる Response (RU) 16000 2サンプル 目 3サンプル 目 14000 12000 1サンプル 目 10000 8000 6000 0 200 400 600 800 1000 Time (seconds)

124 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Sample にサンプル 名 を Repl.に 同 一 サンプルの 繰 り 返 し 回 数 を 入 力 する As Entered をクリックすると 入 力 したサンプルの 分 析 順 を 指 定 することがで きる Next>をクリックする Random : 入 力 したサンプルをランダムに 実 行 As Entered : 入 力 した 順 番 で 実 行 Step :サンプルの 種 類 ごとで 分 析

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 125 再 生 条 件 を 設 定 し(111 ページ 参 照 ) Next>をクリックする バイアルのポジションを 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする

126 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 バイアル 位 置 容 量 を 再 度 確 認 後 Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 後 Save をクリックする プログラムが 動 き 出 す ( 実 験 結 果 の 表 示 ) 実 験 が 終 了 すると 以 下 のような 実 験 結 果 が 表 示 される

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 127 結 合 量 のグラフも 同 時 に 表 示 される 各 サンプルの 結 合 量 が 表 示 される

128 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-3. Kinetic analysis 9-3-1.Concentration series 結 合 速 度 定 数 (k a )あるいは 解 離 速 度 定 数 (k d )を 算 出 する 場 合 には Application Wizard を 使 用 して 実 験 を 行 うと 便 利 である Run Run Application Wizard をクリックする Kinetic Analysis を 選 択 し Start をクリックする Concentration Series を 選 択 し Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 129 Control Experiments は 実 験 条 件 の 検 討 の 項 目 である 1 Mass Transfer マストランスファー リミット 効 果 が 現 れているか 調 べるもの 2 Linked Reactions 反 応 が 1:1 の 単 純 な 反 応 か 調 べるもの 目 的 により 選 択 する Direct Binding もしくは Binding Using Capturing Molecule を 選 択 する ここでは Direct Binding を 選 択 し Next>をクリックする 使 用 するフローセル 流 速 (μl/min) インジェクト 時 間 ( 分 ) 解 離 時 間 ( 分 )

130 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 アナライト 名 アナライトの 分 子 量 サンプルの 繰 り 返 し 測 定 回 数 濃 度 を 入 力 し Next>をクリックする 注 意 次 のメッセージが 出 てくる 場 合 がある これは アナライトの 濃 度 を 5 段 階 以 上 で 行 うことを 勧 めるものである 必 要 がない 場 合 には Ignore をクリックする これは アナライトの 同 一 濃 度 のサンプルを 複 数 回 分 析 することを 勧 めるもの である 必 要 がない 場 合 には Ignore をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 131 サンプルの 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする

132 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 バイアルの 位 置 等 を 再 度 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 後 ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする プログラムが 動 き 出 す

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 133 ( 実 験 結 果 の 表 示 ) 実 験 が 終 了 すると 以 下 のような 実 験 結 果 が 表 示 される 同 時 に 得 られたセンサープラムからおよその 各 種 反 応 速 度 定 数 が 計 算 される k a : 結 合 速 度 定 数 (1/Ms) k d : 解 離 速 度 定 数 (1/s) K A : 親 和 定 数 (1/M) K D : 解 離 定 数 (M) Rmax:アナライトの 最 大 結 合 量 (RU) Baseline Level をクリックすると 各 サンプルのベースラインの 変 動 を 表 示 するこ とができる

134 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 135 9-3-2. Control experiments( 各 種 のコンロトール 実 験 ) 1)Mass transfer control 現 在 の 実 験 条 件 で マストランスポート リミテーション 効 果 が 現 れているか 調 べることができる この 効 果 は リガンドの 固 定 化 量 が 多 すぎるときに 発 生 する 効 果 であり 結 合 領 域 においては センサー 表 面 デキストラン 内 のアナライトの 濃 度 が 低 くなり また 解 離 領 域 においては 一 度 解 離 したアナライトが さらにリガンドに 再 結 合 する(Rebinding)ことにより 正 しい 反 応 速 度 定 数 を 算 出 することができ なくなる この Wizard では 同 一 アナライトを 同 一 濃 度 で 使 用 し 流 速 を 変 化 させてイン ジェクトする マストランスポート リミテーション 条 件 下 では それぞれの 流 速 でレスポンス( 結 合 量 )に 変 化 が 生 じる マストランスポート リミテー ション 条 件 下 で 実 験 を 行 った 場 合 には 正 しい 反 応 速 度 定 数 の 算 出 は 困 難 であ り 結 合 速 度 定 数 (k a )および 解 離 速 度 定 数 (k d )は 誤 って 算 出 されることがあ るので 十 分 注 意 が 必 要 である この 場 合 には 固 定 化 量 を 減 少 させて 実 験 をや り 直 すか BIAevaluation 3.0 での 解 析 の 際 に MODEL を 1:1(Langmuir) with mass transfer を 選 択 する Run Run Application Wizard をクリックし Kinetic Analysis をクリックする Mass Transfer を 選 択 し Next>をクリックする

136 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Direct Binding を 選 択 し Next>をクリックする 使 用 するフローセル サンプル 名 等 を 入 力 し Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 137 再 生 条 件 を 設 定 し Next>クリックする

138 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプル 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 実 験 が 開 始 される

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 139 上 記 な 実 験 結 果 が 示 される 実 験 結 果 の 評 価 理 想 的 な 実 験 条 件 では 固 定 化 したリガンドとインジェクトしたアナライトと の 間 の 相 互 作 用 ( 結 合 および 解 離 両 速 度 )には 流 速 は 全 く 影 響 しない しかし マストランスファー リミテーション 条 件 下 では 相 互 作 用 反 応 は 流 速 によって 大 きく 変 化 することになる 表 示 された 重 ね 書 きのセンサーグラム の 結 合 量 (レスポンス)に 違 いがあれば マストランスファー リミテーショ ン 条 件 下 であると 判 断 することができる この 場 合 には リガンドの 固 定 化 量 を 減 少 させて 実 験 をやり 直 すか BIAevaluation 3.0 での 解 析 の 際 に MODEL に 1:1(Langmuir) with mass transfer を 選 択 する

140 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 2)Linked Reaction のチェック リガンドとアナライトとの 反 応 が 1:1 なのか あるいはより 複 雑 な 反 応 かを Wizard を 使 って 調 べることができる この 実 験 では 同 一 アナライトを 同 一 濃 度 ( 平 衡 に 達 するに 十 分 な 濃 度 )で インジェクト 時 間 を 変 化 させて 分 析 し 解 離 領 域 のセンサーグラムから 反 応 が 1:1 であるかを 判 断 する 1:1 の 反 応 の 場 合 アナライトの 添 加 時 間 が 変 化 しても 解 離 の 仕 方 に 変 化 は なく 複 雑 な 反 応 系 の 場 合 解 離 の 仕 方 に 変 化 が 現 れる アナライト 濃 度 は 速 やか(2~3 分 間 )に 平 衡 に 達 するに 十 分 な 濃 度 のアナライ トを 用 意 する 必 要 がある Run Run Application Wizard をクリックし Kinetic Analysis をクリックする Linked Reaction を 選 択 し Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 141 Direct Binding を 選 択 し Next>をクリックする 使 用 するフローセルおよびアナライト 名 等 を 入 力 し Next>をクリックする

142 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 再 生 条 件 を 入 力 し Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 143 サンプル 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 し Next>をクリックする サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 し Start をクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 して ファイル 名 を 入 力 し Save をクリックする 実 験 が 開 始 される

144 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ( 実 験 結 果 の 評 価 ) 相 互 作 用 が 1:1 の 反 応 の 場 合 サンプルの 添 加 時 間 に 関 係 なく 解 離 のし 方 は 一 定 となるはずである 解 離 のし 方 に 差 がある 場 合 には 反 応 は 1:1 でなく よ り 複 雑 な 反 応 系 の 場 合 が 多 い また アナライトが 1 量 体 や 2 量 体 の 混 合 物 で あったりした 場 合 にも このような 現 象 が 起 こる 場 合 がある このような 場 合 に 1:1 の 反 応 系 で 分 析 を 行 うと 実 際 の 速 度 定 数 と 異 なる 値 として 算 出 される 場 合 があるので 注 意 が 必 要 である

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 145 9-4.Customized Application プログラムを 自 分 で 自 由 に 組 み 立 てるたるための Wizard である サンプルのインジェクト 再 生 溶 液 のインジェクト レポートポイントの 作 成 等 の 条 件 を 含 むプログラムを 簡 単 に 作 成 することができる Run Run Application Wizard をクリックする Customer Applicationを 指 定 し Start をクリックする アイコンを 使 用 し 操 作 を 入 力 し 実 験 を 組 み 立 てる

146 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-4-1.アイコンの 説 明 1 DETECTION モード 検 出 セルおよび 測 定 温 度 を 設 定 する 2 Keyword レポートポイントテーブル 中 にサンプル 名 濃 度 等 の 任 意 のコメントを 表 示 させるコマンド 3 流 速 の 設 定 流 速 の 設 定 を 行 うコマンド 4 インジェクト 試 料 のインジェクトを 行 うコマンド 5 レポートポイント センサーグラム 上 の 任 意 の 点 のデータをレポー の 作 成 トポートポイントテーブル 上 に 表 示 させるコマ ンド 6 Transfer サンプルをバイアル 間 で 移 動 させるためのコマ ンド 7 Mix バイアル 中 の 試 料 を 混 合 するコマンド 通 常 は Transfer とセットで 使 用 する 8 Wash ニードルや IFC をランニング 緩 衝 液 で 洗 浄 する コマンド 9 Wait ランニング 緩 衝 液 を 流 した 状 態 で 待 機 させるコ マンド 秒 単 位 で 待 機 させることができる 10 Comment プログラム 画 面 中 にコメントを 入 力 するための コマンド!より 右 側 の 言 語 は コメントとし て 操 作 に 関 係 ないものと 認 識 する 11 If/Then 途 中 の 実 験 結 果 から 以 降 の 操 作 を 選 択 するため のコマンド 例 えば 一 定 量 の 結 合 量 がない 場 合 には 再 生 操 作 を 行 わずに 次 のサイクルに 移 動 する 場 合 等 に 利 用 する 結 合 物 質 のスクリ ーニング 等 に 有 効 である

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 147 9-4-2. 基 本 操 作 ここでは 基 本 的 な Wizard 作 成 方 法 を 習 得 することを 目 的 に ステップを 踏 ん で 説 明 する ステップ 1.1 個 のアナライトについての 分 析 以 下 の 実 験 を 行 う 場 合 を 想 定 する リガンド :Protein A(フローセル 2 に 固 定 化 済 み) 測 定 温 度 :25 流 速 :20μl/min Detection モード :2-1 (フローセル 1 はリファレンスとして 使 用 ) アナライト :IgG(1 濃 度 ) アナライト 位 置 :R2A1 インジェクト : INJECT 使 用 40μl(2 分 間 ) 再 生 溶 液 :10mM Gly-HCl(pH2) 20μl(1 分 間 ) 再 生 溶 液 位 置 :R2F3 レポートポイント :IgG 添 加 10 秒 前 IgG 添 加 後 20 秒 後 再 生 溶 液 添 加 後 60 秒 後 Run Run Application Wizard をクリックする Customized Applicationを 選 択 し Start をクリックする

148 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 通 常 流 速 を 20μl/min で 実 験 を 行 うように 設 定 されている をクリックし Detection モードおよび 測 定 温 度 を 設 定 する ( 検 出 モードの 設 定 ) Detectionを 選 択 する 以 下 から 選 択 することができる Fc1 Fc2 Fc3 Fc4 Fc1,2 Ref 2-1 Fc3,4 Ref 4-3 Fc1,2 Fc3,4 Fc1,2,3,4 Fc1,2,3,4 Ref 2-1,4-3 Fc1,2,3,4 Ref 2-1,3-1,4-1

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 149 ここでは Fc1,2 Ref 2-1 を 設 定 する (リファレンス 差 し 引 き 機 能 については 46 ページ 参 照 ) ( 測 定 温 度 の 設 定 ) 検 出 部 位 の 温 度 を 設 定 する 4~40 の 範 囲 で 設 定 できる Set Temperatureにマークをいれ 温 度 を 入 力 する 設 定 後 OK をクリックする 以 下 のように 設 定 される ( 流 速 の 変 更 ) をダブルクリックする 流 速 を 入 力 し OK をクリックする

150 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 (アナライトのインジェクト) をクリックする アナライト(この 場 合 には IgG)の 名 前 およびインジェクト 容 量 を 入 力 し OK をクリックする Injection Mode:の をクリックすると インジェクトモードを 変 更 することがで きる インジェクトモードについては 42 ページ 参 照 ( 注 意 )コマンドを 入 力 するときは 入 力 したい 位 置 をハイライトにする 必 要 が ある この 場 合 インジェクトコマンドは FLOW 20 の 後 に 入 力 したいので FLOW 20 の 後 をハイライトにする ここをハイライトにする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 151 ( 再 生 溶 液 のインジェクト) インジェクトしたい 位 置 をハイライトにする をクリックする 再 生 溶 液 の 名 前 およびインジェクト 容 量 を 入 力 し OK をクリックする

152 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 (レポートポイントの 作 成 ) アナライトのインジェクトによるレスポンス 上 昇 分 を 結 合 量 としてレポート ポイントテーブルに 表 示 させる(レポートポイントについては 14 ページ 参 照 ) 通 常 はアナライトインジェクトの 約 10 秒 前 をベースラインとして 取 り さらに インジェクト 終 了 後 10~30 秒 後 のレスポンスを 結 合 量 として 取 る リファレン ス 差 し 引 き 機 能 を 使 用 している 場 合 には インジェクト 終 了 直 前 のレスポンス を 結 合 量 として 使 用 する 場 合 もある 1アナライトインジェクト 前 のベースライン INJECT IgG 40 をクリックし ハイライトにする をクリックする Beforeにマークをいれ 10 秒 前 に 設 定 する Idにコメント(ここではbaseline)を 入 力 する このときのレスポンスをベースラインとする 場 合 には Baselineにマークをいれ OKをクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 153 2アナライトインジェクト 終 了 後 の 結 合 量 INJECT END(アナライトインジェクト 終 了 )をクリックし ハイライトにする をクリックする Afterにマークをいれ Idにコメントを 入 力 し OKをクリックする 3 再 生 後 のレポートポイント INJECT END( 再 生 溶 液 インジェクト 終 了 )をクリックしハイライトにする をクリックする

154 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 必 要 事 項 を 入 力 し OK をクリックする 一 連 の 実 験 操 作 ができあがる Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 155 実 験 の 繰 り 返 し 回 数 を 入 力 し(この 場 合 には 1 回 )し Next>をクリックする サンプル 位 置 と 容 量 を 確 認 する 位 置 を 変 更 する 場 合 には ラック 上 の 変 更 し たいサンプルをマウスで 移 動 先 までドラッグすると 変 更 できる

156 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 もう 一 度 サンプル 位 置 と 容 量 を 確 認 後 Startをクリックする ファイルの 保 存 先 を 指 定 し ファイル 名 を 入 力 後 Saveをクリックする 実 験 がスタートする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 157 RU IgG 14900 14800 Response 14700 14600 14500 14400 0 100 200 300 400 500 600 Time s ( 入 力 したコマンドの 消 去 ) 消 去 したいコマンドをクリックし ハイライトにする マウスの 右 ボタンをクリックすると 以 下 のプルダウンメニューが 表 示 される プルダウンメニュー 一 番 下 のDelete Commandをクリックすると 消 去 できる

158 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ステップ 2. 複 数 個 のアナライトについての 分 析 以 下 の 条 件 で 実 験 を 行 う Wizard を 作 成 する リガンド :Protein A(フローセル 2 に 固 定 化 済 み) 測 定 温 度 :25 流 速 :20μl/min Detection モード :2-1 (フローセル 1 はリファレンスとして 使 用 ) アナライト :IgG(5 濃 度 ) アナライト 位 置 :R2A1 R2A2 R2A3 R2A4 R2A5 インジェクト :KINJECT 使 用 40μl(2 分 間 ) 解 離 時 間 :120 秒 間 再 生 溶 液 :10mM Gly-HCl(pH2) 20μl(1 分 間 ) 再 生 溶 液 位 置 :R2F3 レポートポイント :IgG 添 加 10 秒 前 IgG 添 加 後 20 秒 後 再 生 溶 液 添 加 後 60 秒 後 ステップ 1 の Wizard 作 成 法 にしたがって 作 成 する アナライトのインジェクトの 段 階 で 以 下 のように 作 成 する KINJECT を 使 用 の 際 には 解 離 時 間 も 入 力 する

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 159 サンプル 位 置 が 毎 回 異 なるので Vary by Cycle にマークをいれる 一 連 の 操 作 を 表 示 すると 以 下 のようになる Next>をクリックする

160 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Sample_ID に 5 種 類 のアナライトの 名 前 や 濃 度 を 入 力 する Repl は 同 一 サンプルの 繰 り 返 し 測 定 回 数 である この 場 合 には 1 を 入 力 する Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 161 サンプル 位 置 容 量 の 確 認 および 変 更 を 行 い Next>をクリックする 再 度 サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 後 Startをクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 後 Saveをクリックする 実 験 が 開 始 される

162 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ステップ 3.If/Then を 使 用 した 再 生 の 操 作 省 略 If/Then 機 能 を 使 用 することで アナライトの 結 合 が 見 られなかった 場 合 に 再 生 操 作 を 省 略 することができる 再 生 操 作 の 省 略 は 測 定 時 間 の 短 縮 やリガン ドの 安 定 性 保 持 につながる 結 合 物 質 のスクリーニング 等 の 実 験 に 有 効 である ステップ 2 の Wizard において 再 生 溶 液 インジェクトの 手 前 のコマンドをクリックしハイライトにする をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 163 ここでは 結 合 量 (bound)が 50RU より 少 ない 場 合 に 再 生 溶 液 の 添 加 を 削 除 し 次 のサイクルに 行 くように 作 成 する 上 記 ボックスの 選 択 項 目 を 以 下 に 設 定 後 OK をクリックする IF( 何 が) : RelResp For Report Point(どの 値 が) : bound In Flowcell(どのセルで) : 2-1 Comparison(どうならば) : Is less Than Value(どの 値 ならば) : 50 THEN(どうする?) : Exit Cycle このように 設 定 すると アナライトの 結 合 量 が 50RU より 少 ない 場 合 には 再 生 操 作 を 行 わず 次 のサイクル( 次 のアナライトの 分 析 )に 移 行 することができ る

164 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ステップ 4. 実 験 途 中 で 流 路 (FLOWPATH)や 流 速 を 変 更 する (FLOWPATH の 変 更 ) 実 験 途 中 で FLOWPATH を 自 由 に 変 更 することができる をクリックする 目 的 の FLOWPATH を 選 択 し OK をクリックする サンプル 等 をインジェクトする さらに FLOWPATH を 実 験 途 中 で 変 更 する 場 合 には 同 様 の 操 作 を 行 う

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 165 ( 流 速 の 変 更 ) 変 更 したい 位 置 をハイライトにし をクリックする 流 速 を 入 力 し OK をクリックする

166 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 ステップ 5. 濃 度 測 定 のための Wizard 濃 度 測 定 を 行 う 場 合 には Keyword 機 能 を 利 用 すると 便 利 である Keywordとは レポートポイントテーブル 中 にサンプル 名 あるいは 濃 度 等 の 任 意 のコメントを 表 示 させるために 追 加 するカラム 名 である Keywordに 入 力 したものが レポートポイントテーブルに 表 示 される 以 下 のサンプルの 濃 度 測 定 を 例 に 説 明 する リガンド :Protein A(フローセル 2 に 固 定 化 済 み) 測 定 温 度 :25 流 速 :10μl/min Detectionモード :1-2 (フローセル 1 はリファレンスとして 使 用 ) アナライト :スタンダード IgG (5 段 階 の 既 知 濃 度 サンプル) 未 知 濃 度 サンプル(5 種 類 ) インジェクト : INJECT 使 用 40μl 再 生 溶 液 :10mM Gly-HCl, ph 2 再 生 溶 液 位 置 :R2F3 レポートポイント :IgG 添 加 10 秒 前 IgG 添 加 後 20 秒 再 生 溶 液 添 加 後 60 秒

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 167 今 までのステップで 説 明 したように DETECTION モード 流 速 あるいはサンプ ルインジェクションを 入 力 する アナライトは 複 数 個 存 在 するので インジェ クション 時 Vary by Cycle を 利 用 する レポートポイントテーブルにアナライト 名 および 濃 度 を 追 加 するためのカラム を 作 成 する をクリックする Keyword:にAnalyteと 入 力 し OKをクリックする 同 様 にConc( 濃 度 )もKeywordに 入 力 し OKをクリックする をクリックする

168 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Vary by Cycleにマークをいれ Solution:にKeywordで 入 力 したAnalyteと 入 力 す る レポートポイントおよび 再 生 溶 液 の 添 加 は ステップ 4 と 同 様 に 設 定 する

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 169 Next>をクリックする Repl に 同 一 サンプルの 繰 り 返 し 回 数 Analyte にはサンプル 名 および Conc に 濃 度 を 入 力 する ( 注 意 )Conc には μg/ml などの 単 位 を 入 力 することもできるが Concentration Evaluation で 解 析 を 行 う 場 合 には 単 位 をいれないほうが 便 利 である Next>をクリックする

170 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプル 位 置 および 容 量 の 確 認 および 変 更 を 行 い(101 ページ 参 照 ) Next>を クリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 171 再 度 サンプル 位 置 および 容 量 の 確 認 を 再 度 行 い Startをクリックする 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Saveをクリックする 実 験 が 開 始 される

172 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 9-5.Wizard Templateについて Biacore 3000 では あらかじめ 重 要 な Wizard Template が 保 存 されている アルデヒドカップリング 法 濃 度 分 析 HPAセンサーチップカップリング 法 リガンドチオールカップリング 法 競 合 反 応 法 再 生 条 件 検 討 法 ポジティブコントロール 5 サイクル 毎 のポジティブコントロール NTA センサーチップカップリング 法 NTA センサーチップ 前 処 理 法 SA センサーチップ 前 処 理 法 表 面 チオールカップリング 法 これらの 方 法 を 用 いて 実 験 を 行 うときには Template を 利 用 すると 非 常 に 便 利 である 次 に アルデヒドカップリング 法 HPA センサーチップカップリング 法 リガ ンドチオールカップリング 法 についての Wizard を 説 明 する

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 173 1アルデヒドカップリング 法 糖 タンパク 質 の 糖 鎖 を 介 して 固 定 化 する 方 法 である あらかじめ 糖 タンパク 質 をメタ 過 ヨウ 素 酸 で 還 元 し 糖 鎖 の 非 還 元 末 端 を 開 裂 (ホルミル 基 に)させた ものを 作 成 する また センサーチップ 表 面 は ヒドラジン 等 でアミノ 基 末 端 を 作 成 する メタ 過 ヨウ 素 酸 処 理 済 リガンドをインジェクトし シッフ 塩 基 で 固 定 化 後 還 元 して(アマドイ 転 移 ) 共 有 結 合 化 させる 方 法 である 詳 しくは BIAapplication Handbook を 参 照 すること ( 準 備 するもの) 5mM ヒドラジン 溶 液 メタ 過 よう 素 酸 処 理 糖 タンパク 質 (BIAapplication Handbook を 参 照 ) 0.1M Na-cyanoborohydride in 10mM Acetate buffer (ph4) 再 生 溶 液 ( 例 10mM Gly-HCl, ph2) ( 方 法 ) Run Run Application Wizard をクリックする Open Template をクリックする C:\Program Files\BIACORE 3000\Guide\Methods\Wizard Template を 開 き Aldehyde Coupling.blw を 選 択 する

174 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Edit をクリックする 一 連 の 操 作 の Wizard Template が 表 示 される

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 175 Next>をクリックする Number of Cycle of Runに 測 定 繰 り 返 し 回 数 1 を 入 力 し Next>をクリックする 使 用 するフローセルを 選 択 し Next>をクリックする

176 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 試 料 を 指 定 された 位 置 を 確 認 あるいは 変 更 した 後 Next>をクリックする ( 上 記 の 場 合 のセット 位 置 例 ) R2A1:リガンド 希 釈 液 (バイアルの 8 分 目 までいれたもの リガンドイン ジェクト 前 のニードル 洗 浄 に 使 用 ) R2A2:リガンド(~50μg/ml) R2B1:0.1M Na-cyanoborohydride/ 0.1M Na-acetatebuffer (ph4) R2E1:EDC R2E2:NHS R2E3: 混 合 用 空 容 器 R2E4:1M エタノールアミン 塩 酸, ph 8.5 R2F1:5mM ヒドラジン 溶 液 (バイアルに 8 分 目 までいれたもの ヒドラジ ンインジェクト 前 のニードル 洗 浄 に 使 用 ) R2F2:5mM ヒドラジン

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 177 サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 後 Startをクリックする 続 いて Save Wizard Results Asのボックスが 開 いてくるので 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイ ル 名 を 入 力 してSaveをクリックする

178 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 2HPA センサーチップカップリング 法 この Wizard では HPA センサーチップを 使 用 して 糖 脂 質 やリン 脂 質 を 含 むリ ポソームをインジェクトし 脂 質 の 一 重 膜 として 固 定 化 する 方 法 である 詳 しくは センサーチップ 添 付 の 資 料 を 参 照 のこと ( 準 備 するもの) Liposome( 通 常 は 0.5mM ランニング 緩 衝 液 で 希 釈 したもの) Detergent(20mM Chaps あるいは 40mM Octylglicoside 等 ) BSA 溶 液 (0.1mg/ml ランニング 緩 衝 液 で 希 釈 したもの) 50mM NaOH 水 溶 液 Open Template をクリックする C:\Program Files\BIACORE 3000\Guide\Methods\Wizard Template を 開 き HPA Chip Coupling.blw をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 179 Edit をクリックする 一 連 の 実 験 の Wizard Template が 表 示 される 必 要 により 内 容 を 変 更 し Next>をクリックする

180 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Number of Cycle to Run:に 測 定 繰 り 返 し 回 数 1 を 入 力 し Next>をクリックす る 使 用 するフローセルを 選 択 後 Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 181 表 示 の 位 置 に 試 料 をセットするか 変 更 して Next>をクリックする (サンプル 位 置 の 例 ) R2A1:Detergent R2B1:Liposome 溶 液 R2C1:BSA 溶 液 R2F3:50mM NaOH

182 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 し Startをクリックする 続 いて Save Wizard Results Asボックスが 開 いてくるので 保 存 先 のフォルダーを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 し Saveをクリックすると 実 験 が 開 始 される

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 183 3リガンドチオールカップリング 法 リガンド 表 面 にある 遊 離 のチオール 基 を 介 して 固 定 化 する 方 法 である ( 準 備 するもの) リガンド(プレコンセントレーション 効 果 のある 緩 衝 液 に 希 釈 したもの 21,89 ページ 参 照 ) NHS EDC 80mM PDEA in 0.1M Borate buffer(ph8.5) 50mM l-cysteine-1m NaCl in 0.1M Formate buffer(ph4.3) Open Template をクリックする C:\Program Files\BIACORE 3000\Guide\Method\Wizard Template を 開 き Ligand Thiol Coupling.blw をクリックする

184 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 Edit をクリックする 一 連 の 実 験 の Wizard Template が 表 示 される 必 要 により 内 容 を 変 更 し Next>をクリックする

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 185 Number of Cycle to Run:に 繰 り 返 し 測 定 回 数 1 を 入 力 し Next>をクリックす る 使 用 するフローセルを 選 択 後 Next>をクリックする

186 9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 表 示 の 位 置 にサンプルをセットするか 変 更 して Next>をクリックする (セット 位 置 の 例 ) R2A1:PDEA(4.5mg in 250μl 100mM Borate buffer, ph 8.5 ) R2B1:リガンド 希 釈 液 (バイアルの 8 分 目 にいれたもの リガンドインジ ェクト 前 のニードル 洗 浄 用 ) R2B2:リガンド(プレコンセントレーション 効 果 のある 緩 衝 液 に 希 釈 した もの ) R2C1:L-cystein(1.5mg)/NaCl(14mg) in 250μl 0.1M Sodium formate buffer(ph 4.5) R2E1:EDC R2E2:NHS R2E3:NHS/EDC 混 合 用 空 バイアル

9.Application Wizard を 使 用 した 実 験 方 法 187 サンプル 位 置 および 容 量 を 確 認 後 Startをクリックする 続 いて Save Wizard Results Asボックスが 開 いてくるので 保 存 先 のフォルダを 指 定 し ファイル 名 を 入 力 してSaveをクリックする

索 引 [あ] アスタリスクマーク 70 アナライト 40 アプリケーション ウイザード 87 アミンカップリング 18,19,24,96,107 アミンカップリングキット 19 アルデヒドカップリング 18,173 インジェクト 11,42,48 インジェクトの 拡 張 機 能 48 インジェクトの 中 止 48 ウイザード テンプレート 172 エアの 除 去 57 エクストラクリーンアップ 48 温 度 設 定 9 [か] 核 酸 の 固 定 化 19 カップリング 緩 衝 液 21,89 基 本 操 作 11 緊 急 停 止 31 固 定 化 プログラム 25,75 固 定 化 量 の 調 節 35 コントロールウエアソフトの 起 動 2 [さ] 再 生 溶 液 40,45 サニタイズ 57

サンプルの 調 整 20,47 システムチェック 59 システムの 初 期 化 3 シャットダウン 54 スタンバイ 54 センサーグラムの 表 示 47 センサーチップ 4 センサーチップの 挿 入 3 センサーチップの 抜 き 取 り 55 センサーチップの 保 存 55 相 互 作 用 の 検 討 (マニュアル 操 作 ) 41 相 互 作 用 の 検 討 (プログラム 操 作 ) 50 相 互 作 用 のプログラム 50,82 装 置 の 配 置 1 ソフトウエアの 起 動 2 [た] チオールカップリング 18,183 低 分 子 物 質 の 固 定 化 20 データの 管 理 62 電 源 の 立 ち 上 げ 1 [な] ノーマライズ 10 濃 度 測 定 (Wizard) 166 [は] パイオニアセンサーチップ 4

ファイルの 保 存 19 ファイルの 保 存 様 式 53 フローパス 46,72 プライム 5,56 フラッシュ 56 プレコンセントレーション 21,89 プレラン 28 プログラムの 実 行 30 プログラムの 終 了 32 プログラムの 説 明 64 プログラムによる 相 互 作 用 の 検 討 50 ベースラインの 取 り 方 15,71 ペプチドの 固 定 化 20 [ま] マニュアルインジェクト 35 メインボックス 64 メソッドの 編 集 28 メンテナンス 56 [ら] ラックベース 7,8 リガンド 18 リガンド 希 釈 液 20 リガンドチオールカップリング 18,183 リガンドの 固 定 化 18,24,96,107 リファレンスライン 14 リンス 56 レポートポイント 14,68 流 路 の 設 定 41,46 流 路 の 詰 まりのある 時 58

INDEX [A] Aim for immobilization level(wizard) 98,99 Application Wizard 87 Aprog ボックス 65 [B] BIGINJECT 42 Binding Analysis 87,122 B1 チップ 4 [C] Close 54 CM5 チップ 4 COINJECT 42 Command Queue 49 Control Experiments(Wizard) 88 Customized Application Wizard 88,145 C1 チップ 4 [D] Desorb 56 DETECTION の 設 定 51,72 DNA の 固 定 化 19 Dock 3 [E] Extra Cleanup 48 [F] F1 チップ 4 FLOWPATH 46,72 FLUSH 56 [H] HPA チップ 4 HPA センサーチップカップリング 法 178

[I] If/Then(Wizard) 162 Immobilizatin(Wizard) 87,96 Immobilization ph scouting(wizard) 87,89 INJECT 11,42,48 [K] Kinetics analysis(wizard) 88,128 KINJECT 42 [L] Linked Reaction(Wizard) 88,140 L1 チップ 4 [M] Main ボックス 4 Mass Transfer Control(Wizard) 88,135 Method の 編 集 28 [N] Normalize 10 NTA チップ 4 [P] Prerun Method 28 PRIME 5,56 [Q] QUICKINJECT 42 [R] Regeneration Scouting(Wiazard) 87,111 Rinse 56 [S] SA チップ 4 Sanitize 57 Specify Flow Rate and Injection Time(Wizard) 98,107

Standby 54 Surface Preparation(Wizard) 87,89 Surface Performance Test(Wizard) 87,117 [U] Unclogging 58 Undock 55 [W] Wizard Template 172

60

OFF TEL : 03-5331-9336 9 : 00 17 : 30

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