研 究 成 果 報 告 書 事 業 名 ( 補 助 金 名 ) : 基 盤 的 研 究 開 発 育 成 事 業 ( 研 究 開 発 シーズ 育 成 補 助 金 ) 研 究 開 発 テーマ 名 : エノキ 水 溶 性 画 分 からのβ グルカンを 中 心 とした 医 薬 品 素 材 の 生 産 開 発 研 究 代 表 者 名 : 櫛 泰 典 帯 広 畜 産 大 学 / 教 授 共 同 研 究 者 名 : 石 井 達 帯 広 畜 産 大 学 / 教 授 大 庭 潔 戝 団 法 人 十 勝 圏 振 興 機 構 食 品 技 術 センター/ 課 長 小 林 洋 一 コスモ 食 品 株 式 会 社 / 部 長 外 部 協 力 者 名 : 杉 田 睦 海 滋 賀 大 学 教 育 学 部 / 教 授 糸 乗 前 滋 賀 大 学 教 育 学 部 / 助 教 授 1. 背 景 目 的 十 勝 圏 では 茸 類 の 栽 培 が 比 較 的 大 規 模 に 行 われ 食 用 にする 以 外 に 石 附 部 と 呼 ばれる 柄 の 部 分 が 大 量 に 生 じ そのまま 廃 棄 されているのが 現 状 であった 私 達 帯 広 畜 産 大 学 等 が 中 心 となり 茸 類 の 大 量 に 廃 棄 されている 未 利 用 資 源 から 極 めて 高 い 付 加 価 値 を 生 み 出 す 機 能 性 食 品 或 いは 医 薬 品 素 材 の 原 料 を 一 貫 して 生 産 する 拠 点 を 生 み 出 し 残 さを 全 て 有 効 活 用 する 多 品 種 請 高 付 加 価 値 の 研 究 開 発 に2 年 前 から 取 組 んでいる その 結 果 有 効 活 用 の 大 筋 の 目 処 において 目 的 が 達 成 された 更 に 企 業 レベルでの 生 産 開 発 を 目 的 として その 現 実 的 な 対 応 を 迫 られている 本 研 究 では エノキに 絞 り 水 溶 性 画 分 を 用 いて β グルカンをカラムで 精 製 を 進 め 化 学 構 造 の 詳 細 を 明 らかにし 今 まで 確 認 されている 生 理 作 用 の 検 証 を 行 ない その 生 産 開 発 を 企 業 レベルで 開 発 でき る 段 階 にすることを 目 的 とする 2. 内 容 方 法 本 研 究 ではエノキ 由 来 の 水 溶 性 画 分 に 的 を 絞 って 以 下 の 研 究 開 発 を 押 し 進 める 大 きく 分 けて2つの 点 で 検 討 を 行 なう 1; 今 まで 開 発 研 究 で 確 立 されたβ グルカンの 生 理 作 用 を 最 大 限 引 き 出 すための 化 学 構 造 の 解 析 を 徹 底 して 行 なう その 強 化 のための 誘 導 体 化 も 含 む 2; 企 業 レベルでの 事 業 化 を 視 野 に 入 れ コスト 製 品 化 のプロセスを 詳 細 に 検 討 する 1についての 研 究 開 発 1 エノキからの 水 溶 性 画 分 の 化 学 構 造 ;エノキ 水 溶 液 画 分 のβ グルカンの 含 量 及 び 回 収 率 は 既 に 把 握 しているので この 画 分 からイオン 交 換 クロマトグラフィーにより 結 合 しなかった 多 糖 画 分 を 精 製 す る これを 用 いて 更 にゲルろ 過 を 行 ない β グルカン 画 分 を4つに 分 画 する これらの4つの 分 画 の 詳 細 な 化 学 構 造 をMS,NMR,メチル 化 分 析 により 把 握 する β 位 の 位 置 の 割 合 数 を 求 め 分 岐 度 を 求 め 分 子 量 毎 の 詳 細 な 化 学 構 造 を 把 握 する 21の 化 学 構 造 に 基 づく 生 理 作 用 の 検 証 ; 既 にマウスマクロファージ 系 細 胞 株 (RAW-264)を 用 いてその 効 果 をサイトカインの 一 種 TNF-αの 分 泌 量 を 指 標 にin vitro 系 で 確 立 しているので 基 本 的 にはこの 系 で 化 学 構 造 と 生 理 作 用 の 相 関 関 係 の 確 立 を 目 指 す また マウスによるin vivo の 効 果 も サルコーマ180による 腫 瘍 細 胞 の 増 殖 に 対 する 抗 腫 瘍 効 果 を 適 時 導 入 し 化 学 構 造 と の 差 を 検 討 する 3 水 溶 性 画 分 はβ グルカン 以 外 に 有 用 なペプチド 核 酸 も 多 量 に 含 まれているので イオン 交 換 クロマトグラフィーにより 結 合 した 画 分 についても 新 たな 生 理 作 用 血 圧 低 下 血 糖 低 下 及 び 抗 アレルギー 性 のアッセイの 検 討 を 行 なう 2についての 研 究 開 発 β グルカンの 各 画 分 と 生 理 作 用 と 化 学 構 造 の 相 関 性 が 合 致 したものについて その 後 の 製 品 化 につ なげた 場 合 の 効 率 コストの 計 算 を 含 めて 企 業 レベルで 事 業 価 値 を 充 分 に 検 討 する
3. 結 果 成 果 3 1; 今 までの 成 果 (in vivo の 抗 腫 瘍 性 と 細 胞 を 用 いた in vitro 系 のアッセイ) マウスマクロファージ 系 細 胞 株 (RAW 264 )を 用 いて 食 用 茸 類 から 得 られた 水 溶 性 画 分 (β グル カンを 約 10% 含 む )を 用 いて 細 胞 と 共 培 養 する 系 で 72 時 間 培 養 後 培 地 中 に 分 泌 される TNFαをサンドイッチ 法 の ELISA を 用 いることにより このサイトカインが 有 意 に 上 昇 することを 再 現 性 を 持 って 確 認 できることを 確 立 している また 同 時 に ICR マウスに 同 系 統 由 来 の 乳 癌 細 胞 株 (ザルコーマ 180)を 移 植 し この 系 に 同 様 に 食 用 茸 類 から 得 られた 水 溶 性 画 分 (β グルカン)を 用 いることにより in vivo の 抗 腫 瘍 性 の 系 を 確 立 している これらの 系 を 用 いて 更 に 茸 特 にエノキ 由 来 のβ グルカン 画 分 の 構 造 と 活 性 の 相 関 性 を 解 析 するためには β グルカンの 詳 細 な 構 造 解 析 が 必 要 である そこでこの 画 分 を 更 にクロマトグラフィーで 分 離 することにより 解 析 を 行 った β グルカンの 大 まかな 構 造 とその 他 の 高 分 子 多 糖 の 構 造 比 較 は 図 1に 示 されている また RAW 264 細 胞 を 用 いた 場 合 のβ グルカン TNF-α 分 泌 と 関 連 細 胞 の 関 わりを 図 2に 示 す 図 1 β グルカンの 構 造 図 2 β グルカンの 抗 腫 瘍 作 用 機 構 3 2;ゲルクロマトグラフィー エノキ 水 溶 性 画 分 をイオン 交 換 クロマトグラフィーで 核 酸 アミノ 酸 系 の 物 質 を 除 いた 後 セファロー ス4B のゲルクロマトグラフィーに 供 した 横 軸 は 分 画 したフラクションの 偶 数 番 号 一 方 縦 軸 は 各 試 験 管 の 糖 含 量 をフェノール 硫 酸 法 で 測 定 し 其 の 結 果 を 図 -3に 示 した 20 30 番 に 大 きなピークが 検 出 された 他 は なだらかな 溶 出 が 観 察 された この 分 離 された 各 フラクションを10 本 ずつ 一 緒 にして 透 析 及 び 凍 結 乾 燥 を 行 い その 後 の in vivo の 抗 腫 瘍 性 と 細 胞 を 用 いた in vitro 系 のアッセイに 供 した
グルコース 含 有 量 (フェノール 硫 酸 法 )50μ g/ml 100 50 0 1 フラクション 番 号 図 -3 エノキ 水 溶 性 画 分 由 来 β-グルカンのゲル 濾 過 クロマトグラフィー 3 3;マウスよる 抗 腫 瘍 性 の 検 討 ゲルクロマトグラフィーで 分 離 された 各 フラクションを 画 分 1 5とした これをマウス1 匹 あたり2 0ug を 投 与 した マウスは 予 め ザルコーマ 180 細 胞 を 移 植 しておき その 系 において 抗 腫 瘍 効 果 が 得 られるか 検 討 を 行 った 其 の 結 果 を 表 1に 示 す コント ルとして 用 いた 生 理 食 塩 水 では 腫 瘍 重 量 が 平 均 4 20g であったのに 対 し ゲルクロマトで 分 離 する 前 の 画 分 では0 26g と 有 意 に 抗 腫 瘍 活 性 がこ とを 確 認 できている この 画 分 を 更 に 画 分 1から5に 分 離 し その 各 々を 同 様 に 投 与 すると 画 分 によ り 差 が 観 察 された 即 ち 画 分 2と3では 顕 著 に 抗 腫 瘍 効 果 が 観 察 され 完 全 縮 退 率 もかなりの 割 合 で 観 察 できた 表 1 エノキタケのゲルクロマト 画 分 のザルコーマ 180 に 対 する 抗 腫 瘍 効 果 処 置 腫 瘍 重 量 (g) 抗 腫 瘍 効 果 (%) 完 全 退 縮 率 ( 匹 ) 生 理 食 塩 水 コントロール 4.20 ± 1.62 0.0 0/6 クロマト 前 の 水 溶 性 画 分 0.26 ± 1.82 93.8 5/6 画 分 1 2.60 ± 0.26 38.0 3/5 画 分 2 0.62 ± 0.43 85.2 4/6 画 分 3 0.83 ± 0.83 80.2 4/6 画 分 4 3.00 ± 1.03 28.5 2/6 画 分 5 3.96 ± 1.87 5.7 0/6 抗 腫 瘍 効 果 は(コントロール 腫 瘍 平 均 重 量 - 検 体 投 与 腫 瘍 平 均 重 量 ) コントロール 腫 瘍 平 均 重 量 100 という 式 から 求 めた 完 全 退 縮 率 は 腫 瘍 がまったくなくなってしまったマウスの 数 を 指 している 使 用 したマウスは 各 群 6 匹 を 用 いた
3 4; 細 胞 を 用 いた in vitro 系 のアッセイ この 画 分 を 用 いて 細 胞 を 用 いた in vitro 系 のアッセイを 行 った 細 胞 はマウスマクロファージ 系 由 来 の 細 胞 株 を 用 いてその 活 性 化 能 を 各 画 分 を 細 胞 と24 時 間 共 培 養 行 うことにより サイトカインの1 種 である TNF-αが 培 地 中 に 分 泌 される 量 をこのサイトカインに 対 する 抗 体 を 結 合 させたサンドイッチの ELISA 法 を 用 いることにより 測 定 した この 方 法 の 概 略 は 図 4で 示 した 図 5に in vitro 系 のアッセ イの 結 果 を 示 した クロマト 前 の 水 溶 性 画 分 では 添 加 量 1 10ug で TNF-αの 分 泌 量 が5ng/ml であ ったのに 対 して 画 分 2 3では 約 30ng/ml の 値 を 示 し マクロファージ 系 細 胞 の 活 性 化 がより 多 く 生 じていることを 示 している 更 に 添 加 量 を 増 やすと 培 地 中 へのサイトカインの 分 泌 量 は 上 昇 し 添 加 量 5 0ug では 初 期 の 数 倍 の 分 泌 量 を 示 した このことは 画 分 2 3は 他 の 画 分 に 比 べて in vitro 及 び in vivo の 両 方 で 他 の 画 分 と 比 べて β グルカンの 活 性 が 高 いことを 示 唆 している また 図 6に 平 成 16 年 度 の 地 域 コンソの 際 得 られた 結 果 を 同 様 に 示 すが 図 の 中 に 示 されたエノキタケ 生 成 物 が 今 回 のイオ ン 交 換 カラムに 供 する 前 の 試 料 である ほぼ 同 程 度 の 量 で TNF-α 分 泌 が 検 出 できる 図 4 TNF α 産 生 によるマクロファージ 活 性 化 能 の 測 定 60 培 養 液 中 のTNF-α 濃 度 (ng/nl) 50 40 30 20 10 0 未 分 画 分 画 1 分 画 2 分 画 3 1 4 10 40 100 添 加 重 量 (μg) 図 5 各 画 分 の TNF α 産 生 の 比 較
図 6 精 製 高 分 子 糖 質 画 分 と 熱 水 抽 出 物 との 比 較 ( 平 成 16 年 度 地 域 コンソ 報 告 書 より) 3 5; 画 分 による 構 造 の 違 いについて 表 1と 図 5で 示 された 画 分 毎 の 活 性 の 差 が 何 に 起 因 するのか 興 味 深 い そこで 各 画 分 をフェノ ル 硫 酸 法 を 用 いて 糖 含 量 を 測 定 した グルコース 含 量 として 測 定 すると 各 画 分 で 殆 ど 差 は 見 られず 65 76%のグルコース 含 量 であった また 塩 酸 メタノ ルによる 処 理 を 行 い 更 に TMS 化 を 行 い 各 分 画 に 含 まれる 糖 組 成 の 違 いをガクロマトグラフィーで 分 析 した 表 2にその 結 果 を 示 した 画 分 2で 若 干 キシロースの 量 が 他 の 画 分 と 比 べて 少 ない 以 外 は 差 が 検 出 できなかった 更 にこれらの 画 分 をメチル 化 アルジトールアセテートとして 同 様 に GC 分 析 あるいは GC/MS 分 析 を 行 うと 若 干 の 違 いを 検 出 することができた 即 ち in vivo の 抗 腫 瘍 性 と in vitro のアッセイで 共 通 に 活 性 を 有 した 画 分 2と3では 水 溶 性 画 分 と 同 様 グルコ スの 含 量 が 他 の 画 分 に 比 べて 高 く 糖 鎖 の 結 合 様 式 では1 3グルコース 1 6グルコースが 比 較 的 高 く 活 性 の 本 体 とされている1 3 結 合 1 6 結 合 の 割 合 が 高 いと 考 えられた しかしながらガラクトースやマンノースを 含 有 する 割 合 に 差 があるが 共 通 して 含 まれることから 活 性 本 体 とマンナン ガラクタンがどのように 影 響 するかはここでは 明 らか にできなかった 現 在 画 分 2と3について NMR 測 定 を 行 っている 表 2 構 成 糖 分 析 (エノキ) 水 溶 性 画 分 画 分 1 画 分 2 画 分 3 画 分 4 画 分 5 糖 含 量 (%as Glc) 77.2 70.6 65.8 72.8 65.7 73.4 Fuc 0.2 0.8 0.4 0.8 0.2 0.4 Xyl 8.4 16.3 2.3 8.0 4.7 10.1 Glc 64.3 69.2 72.5 69.2 64.3 62.3 Man 10.2 4.5 6.3 5.1 20.6 25.2 Gal 16.9 10.2 18.5 16.9 10.2 2.0 *Fuc,フユース;Xyl,キシロース;Glc,グルコース;Man,マンノース;Gal,ガラクトース
表 3 糖 鎖 結 合 様 式 水 溶 性 画 分 画 分 1 画 分 2 画 分 3 画 分 4 画 分 5 1,4Xyl 12.3 20.3 11.2 14.2 12.7 12.2 1Glc 15.0 12.0 10.3 12.6 14.0 13.0 1,3Glc 20.3 11.0 19.5 22.3 19.7 21.0 1,4Glc;1,3Man;1,4Gal 4.5 6.2 6.5 8.1 4.1 8.0 1,6Glc:1,6Man:1,3Gal 15.2 15.2 18.2 20.3 15.2 15.6 1,6Gal 13.8 13.0 10.2 14.9 19.9 13.2 1,3,6Hex 13.6 16.2 21.7 1.0 14.1 11.1 1,2,6Hex 5.3 6.1 2.4 6.6 0.3 5.9 *Hex,ヘキソース 3 6 企 業 化 についての 研 究 開 発 ゲルクロマトグラフィーで 他 の 画 分 と 比 較 して in vivo の 抗 腫 瘍 性 と in vitro 系 のアッセイで 共 通 に 活 性 を 有 した 画 分 2と3を 精 製 するための コスト 及 び 企 業 レベルでの 事 業 価 値 について 検 討 を 進 め ている 現 在 の 段 階 では コスト 面 からカラムを 用 いた 精 製 を 加 えることで そうでない 場 合 とでは 約 2 5 倍 の 費 用 がかかることが 明 らかになった 4. 今 後 の 展 開 (250 字 程 度 ) エノキ 水 溶 性 画 分 をイオン 交 換 クロマトグラフィーでアミノ 酸 及 び 核 酸 関 連 の 物 質 をほぼ 完 全 に 除 く ことにより 高 分 子 グルコース 画 分 をえることができた 更 にこの 画 分 をゲルクロマトにより 分 子 量 毎 に 分 離 することにより 活 性 ( in vivo の 抗 腫 瘍 性 と in vitro 系 )で 差 があることが 明 らかにな った この 差 は 糖 鎖 の 構 造 と 分 岐 度 の 程 度 に 由 来 していると 思 われるが 完 全 な 解 析 までにはまだ 至 っ ていない しかしながら ゲルクロマトを 用 いることで 活 性 を 有 する 物 質 と 比 較 的 有 しない 物 質 を 大 ま かに 分 離 できたことは 今 後 の 研 究 開 発 に 大 きな 力 になると 考 えられる また 今 回 の 研 究 開 発 ではエノキ 以 外 の 詳 細 なβ グルカンについては 検 討 できなかったが 茸 の 種 類 により 特 有 な 構 造 を 有 すること が 示 唆 され 今 後 の 研 究 開 発 が 望 まれる また 水 溶 性 画 分 はβ グルカン 以 外 に 有 用 なペプチド 核 酸 も 多 量 に 含 まれているので イオン 交 換 クロマトグラフィーにより 結 合 した 画 分 についても 新 たな 生 理 作 用 血 圧 低 下 血 糖 低 下 及 び 抗 アレルギー 性 のアッセイの 検 討 を 行 なうことも 茸 の 活 用 として 今 後 有 望 である 本 事 業 においては 茸 類 特 にその 廃 棄 物 の 有 効 利 用 ということで そのリサイクルシステムの 構 築 が ベースになっている 今 後 十 勝 圏 における 様 々な 一 次 産 品 の 廃 棄 物 を 有 効 利 用 する 上 で この 技 術 シーズは 新 たな 地 域 ニーズの 掘 り 起 こしに 役 立 つばかりでなく 様 々な 産 業 界 に 貢 献 することが 可 能 と なると 考 えられる 5.その 他 なし