リアルタイムPCRでの 解 析 は 年 々 増 加 ここ 数 年 はRNAi microrna DNAアレイ 解 析 等 での 報 告 が 多 い R

リアルタイムPCRによる 遺 伝 子 発 現 解 析 の 基 本 から 応 用 アプライドバイオシステムズジャパン 株 式 会 社

リアルタイムPCRでの 解 析 は 年 々 増 加 ここ 数 年 はRNAi microrna DNAアレイ 解 析 等 での 報 告 が 多 い 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 16 46 52 72 178 1 995 Real Time PCR microrna 1 996 1 997 1 998 1 999 3002 1841 1023 502 2 6 37 116 2 003 2 002 2 001 2 000 8027 7901 6535 292 536 585 2 006 2 005 2 004 年 年 年 年 年 ( 各 年 間 におけるPubMed でのキーワードサーチの 結 果 ) 年 年 年 年 年 年 1 0 年 ( 月 ) 2 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRで 可 能 なアプリケーション 例 相 対 定 量 : 試 料 間 のターゲットの 発 現 量 の 差 ( 何 倍 )を 比 較 ( 例 ) 目 的 遺 伝 子 の 発 現 変 動 ( 時 間 経 過 ごとでの 変 動 測 定 ) ( 例 ) 薬 剤 投 与 時 の 挙 動 ( 薬 剤 濃 度 に 依 存 した 変 動 の 測 定 ) 絶 対 定 量 : 試 料 中 のターゲットの 絶 対 量 (コピー 数 )を 測 定 ( 例 ) ウイルスなどのコピー 数 の 定 量 ( 例 ) バクテリアや 病 原 微 生 物 の 変 動 測 定 定 性 的 測 定 ( 例 ) SNPs タイピング( 薬 物 代 謝 酵 素 変 異 による 副 作 用 予 測 ) 3 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRによる 遺 伝 子 発 現 の 比 較 とSNPタイピング 300 250 200 150 100 50 0 目 的 遺 伝 子 の 発 現 変 動 測 定 Day 0Day 1Day 2Day 3Day 4Day 5Day 6Day 7Day 8Day 9Day 10 A IL-4 遺 伝 子 A BB TGFβ 遺 伝 子 目 的 の 遺 伝 子 に 対 しての サンプル 間 での 発 現 比 較 薬 物 代 謝 酵 素 のSNPタイピングP450 (CYP2C9*3 ) 4 2006 Applied Biosystems

相 対 定 量 法 の 例 : 各 遺 伝 子 の 時 間 毎 の 経 過 を 観 察 横 軸 : 遺 伝 子 の 種 類 (IL-8 & TGF-β 遺 伝 子 ) 縦 軸 : 発 現 量 比 較 (Logスケールで 表 示 ) 60h 36h 48h 24h 48h 36h 60h 12h 24h 0h 12h 0h 縦 軸 スケール Log 相 対 表 記 5 2006 Applied Biosystems

RNAiでの 遺 伝 子 発 現 抑 制 64 種 類 の 遺 伝 子 に 対 して 356 種 類 の RNAi を 作 成 して 測 定 80% 以 上 の ノックダウンを リアルタイムPCRで 確 認 (Celera Genomics & Applied Biosystems, USA) 6 2006 Applied Biosystems

microrna 検 出 定 量 のデータ mirna profiles classify embryoid bodies ES EBs) cells, and ( differen tissues 一 定 量 発 現 しているmicroRNA (Ct 値 =35 未 満 の)は ES EC 各 組 織 で100 種 類 以 上 ある Data from: Caifu Chen, Applied Biosystems and William M. Strauss, University of Colorado 7 2006 Applied Biosystems

microrna 検 出 定 量 のデータ mirna Expression signature in ) Human tumorsgliobl Data Ridzon from:, Applied Biosystems and 8 Ambros, Dartmouth Medical 2006 School Applied Biosystems Center and the

サンプルの抽出 30分 1時間 サンプルと試薬の混合 リアルタイムPCRでの 分析 30 1.5時間 データの解析 検出 9 2006 Applied Biosystems

遺 伝 子 の 発 現 量 比 較 の 手 技 ノザン 解 析 からリアルタイムPCR 定 量 へ ノザン 解 析 リアルタイムPCR 定 量 p53 1 2 3 4 GAPDH 5 日 間 バンドの 濃 淡 で 遺 伝 子 発 現 量 の 比 較 PCRの 増 幅 曲 線 で 遺 伝 子 発 現 量 の 比 較 (2 倍 差 の 検 出 & 広 いダイナミックレンジ) 10 2006 Applied Biosystems

遺 伝 子 の 発 現 量 の 手 技 の 比 較 所 要 時 間 必 要 なRNA 量 特 徴 ノザンハイブリ RNA 電 気 泳 動 (8 時 間 ) ブロット(8 時 間 ) ハイブリ(2 時 間 ) 洗 い(2 時 間 ) 検 出 解 析 ( 合 計 24 時 間 以 上 ) Total RNA = 10~20μg 程 度 /Well デンシトメーターでの 画 像 解 析 クロスハイブリの 問 題 Total RNA リアルタイムPCR RNA 逆 転 写 (1 時 間 半 ) リアルタイムPCR(1 時 間 半 ) 解 析 解 析 ( 合 計 3 時 間 程 度 ) = 10~100ng 程 度 /Well 2 倍 の 正 確 な 発 現 比 較 が 可 能 大 量 サンプルの 解 析 も 可 能 50 万 種 以 上 のProbe を 提 供 11 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRによる 遺 伝 子 の 発 現 比 較 検 体 からのTotal 回 収 RNA ( 培 養 細 胞 組 織 血 液 等 ) Ambion P/N 1912 RNAqueous Kit 50 purifications 31,000 ( 操 作 時 間 :30 分 程 度 ) cdna 合 成 (mrnaの 逆 転 写 反 応 ) ( 反 応 時 間 :1 時 間 ) リアルタイムPCR 実 験 AppliedBiosystems, P/N N8080234 TaqMan Reverse Transcription Reagents ランダムヘキサマーでの 逆 転 写 を 推 奨 ( 反 応 時 間 :30 分 ~1.5 時 間 ) AppliedBiosystems, P/N4304437 TaqMan Universal PCR Master Mix 解 析 結 果 AppliedBiosystems, P/N 4367659 Power SYBR Green Master Mix 12 2006 Applied Biosystems

理 想 的 なPCR 反 応 は1 回 のサイクルで ターゲットのDNAが2 倍 に 増 幅 する (n 回 PCR 反 応 終 了 時 の)PCR 産 物 量 =テンプレートの 初 期 濃 度 x 2 n L og ( 表 示 ) 増 幅 産 物 量 増 幅 回 数 (サイクル 数 n) 13 2006 Applied Biosystems

実 際 のPCR 反 応 では1 回 のサイクルで DNAが2 倍 に 増 幅 する 領 域 は 限 られる PCR 反 応 の 初 期 は 検 出 限 界 以 下 である PCR 反 応 の 後 期 はプラトー 状 態 になる プラトー L og ( 表 示 ) 検 出 量 増 幅 回 数 (サイクル 数 n) プラトーを 引 き 起 こす 原 因 PCR 産 物 の 基 質 (dntp やフ ライマー )の 枯 渇 酵 素 の 失 活 PCR 阻 害 物 の 蓄 積 など 14 2006 Applied Biosystems

PCRの 各 サイクルで 蛍 光 強 度 から 目 的 遺 伝 子 の 検 出 を 行 う 初 期 濃 度 が2 倍 違 うと 1サイクルずれて 増 幅 曲 線 が 立 ち 上 がる L og ( 表 示 ) 検 出 量 サイクル 数 PCR 終 了 後 にゲル 電 気 泳 動 を 行 っても 定 量 することはできない! 15 2006 Applied Biosystems

各 サイクル 毎 に 蛍 光 を 検 出 すると 増 幅 曲 線 を 作 成 することができる 1サイクルの 差 が2 倍 の 濃 度 の 差 に 相 当 する L og ( 表 示 ) 検 出 量 交 点 (Ct 値 ) 2122232425 サイクル 数 補 助 線 (Threshold )と 増 幅 曲 Line 線 の 交 点 (Ct 値 )をみると 2 倍 の 初 期 濃 度 の 差 は 1サイクルの 差 になる 16 2006 Applied Biosystems

値 ) 交 点 の 値 (Ct 値 )と 濃 度 の 関 係 をプロットすると 検 量 線 を 作 成 することができる ( 交 点 のサイクル 数 :C t 27 26 25 24 23 1,250 2,500 5,000 (Copy 数 ) 10,000 0.0625 0.125 0.5 0.25 ( 希 1釈 率 ) 6.2512.5 25 50 100 ( 相 対 値 %) 1 2 ( 相 4 対 値 ) 複 数 の 未 知 濃 度 のサンプルも 検 量 線 から 算 出 比 較 検 討 ができる 17 2006 Applied Biosystems

例 )ガン 細 胞 と 正 常 細 胞 の 比 較 の 場 合 L og ( 表 示 ) 検 出 量 Ct=21 (ガン 細 胞 由 来 cdna 検 体 ) サイクル 数 Ct=23 ( 正 常 細 胞 由 来 cdna 検 体 ) 検 体 における 遺 伝 子 の 発 現 量 の 違 いを サイクル 数 (Ct 値 )で 示 す 事 が 出 来 る 18 2006 Applied Biosystems

例 )ガン 細 胞 と 正 常 細 胞 の 比 較 の 場 合 サイクル 数 (Ct 値 ) 25 24 正 常 細 胞 由 来 cdna23 22 ガン 細 胞 由 来 cdna21 1 4 82 16 ( 相 対 値 ) 以 上 の 検 量 線 の 比 較 から 目 的 遺 伝 子 は ガン 細 胞 の 相 対 値 :16, 正 常 細 胞 の 相 対 値 : となり 4 ガン 細 胞 では4 倍 の 発 現 量 がある 事 がわかる 19 2006 Applied Biosystems

増 幅 効 率 遺 伝 子 発 現 定 量 に 関 して 重 要 な 要 因 PCR 産 物 の 増 幅 効 率 は 以 下 の 式 で 算 出 できる 増 幅 効 率 e = 10-1/slop 1 例 えば slopの 値 が 3.366の 場 合 e = 10-1/-3.366 1 = 10 0.287 1 = 1.98-1 =0.98 おおよそ 0.98の 割 合 で 増 幅 していることがわかる 20 2006 Applied Biosystems

検 量 線 をかくためのスタンダードカーブ 作 成 用 サンプル 絶 対 定 量 を 行 うとき(ウイルスの 定 量 等 の 場 合 ) 絶 対 値 (コピー 数 )が 既 知 のものを 利 用 PCR 産 物 やVector 等 で 塩 基 数 のサイズや 質 量 がわかっているもの 相 対 定 量 を 行 うとき( 通 常 の 発 現 解 析 の 場 合 ) 数 サンプル 間 での 比 較 を 行 いたい 場 合 目 的 遺 伝 子 が 強 く 発 現 するcDNA 溶 液 を1とし その 段 階 希 釈 をとり それ 以 外 のサンプルが どこに 検 出 されるかによって 判 定 する ( 一 般 的 ) 21 2006 Applied Biosystems

定 量 PCR( 絶 対 定 量 ) コピー 数 への 変 換 ステップ1: 分 子 量 (mw)の 計 算 二 重 鎖 DNAプロダクトの 長 さ(bp) 330 (6630 bp) (330dal 2nt/bp) = 10 4.38 6 dal (g/mole) daltons 2 nt/bp=x daltons (g/mole) ステップ2: 分 子 量 からコピー 数 への 変 換 X g/mole アボガドロ 定 数 (6.023 10 23 molecules/mole )=Y moleclue g/ Y:1 分 子 (コピー)あたりのサンプルDNAの 重 量 (4.38 10 6 g/mole) (6.023 10 molecules/mole)=7.27 10-18 g/molecul プラスミド(6630 bp)dna1 分 子 あたり 7.27 10-18 g すなわち 1pgのプラスミドで 約 13 万 コピーに 相 当 ( 詳 細 はアプライドバイオシステムズのホームページにて) 22 2006 Applied Biosystems

( 例 )ノロウイルスG1 領 域 の 増 幅 曲 線 (1 0 ~10 7 copy の10 倍 希 釈 サンプル) 04copy o py 02cop p y 03c 1 1 1 y p y 7 copy 1 06c 0 1 o py 1 05co 1 copy 1 00co 0 1 23 2006 Applied Biosystems

ノロウイルスG1 領 域 の 検 量 線 1 0 copy 10 1 copy 10 2 copy 10 3 copy 10 4 copy 10 5 copy (1 0 ~10 7 copy の10 倍 希 釈 サンプル) 10 6 copy 10 7 copy 24 2006 Applied Biosystems

検 量 線 を 用 いた 測 定 方 法 1 0 copy 10 1 copy 既 知 濃 度 サンプルのThreshold Li との 交 点 (Ct 値 )から 作 成 した 検 量 線 から サンプルの 交 点 (Ct 値 )を 比 較 10 2 copy 34 10 3 copy Ct 値 10 4 copy 10 5 copy 10 6 copy 19.5 10 7 copy 240 copy 3,800,000 copy 濃 度 (copy 数 ) 25 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRでの 蛍 光 検 出 方 法 PCR 産 物 を 各 サイクルで 検 出 するために TaqMan 法 (5 -Nuclease ) Assay SYBR Green 法 26 2006 Applied Biosystems

TaqMan フ ローブとPrimer の 設 計 のバックグランド 目 的 の 配 列 をはさむ 特 異 性 の 高 い 領 域 でPrimer を 設 計 し TaqMan Probe をその 中 心 に 設 計 する 5 3 Forward Primer R TaqMan Probe Q MGB 5 5 3 5 Reverse Primer 27 2006 Applied Biosystems

Primer とTaqMan フ ローブの 設 計 のガイドライン PCR primer 目 的 配 列 を 含 む150bp 程 度 の 領 域 を 増 幅 するように 設 計 (Tm=58 ~60 ) TaqMan フ ローブ PCR 産 物 のほぼ 中 央 にくるような Oligo の 配 列 を 設 計 (Tm=68 ~70 ) 5 末 端 側 にレポーター 蛍 光 色 素 3 末 端 側 にクエンチャー 蛍 光 色 素 を 付 加 5 R Forward Primer 5 Reverse Primer Q MGB 28 2006 Applied Biosystems

ゲノムのコンタミを 検 出 しないようにTaqMan フ ローブとPrimer を 設 計 する Primer は 可 能 であればIntron を 挟 み 異 なるExon 上 にPrimer を 設 計 する また TaqMan Probe をジャンクション 部 位 に 設 計 する (ゲノムDNAの 誤 検 出 を 防 ぐため) ゲノムDNA Forward Primer Exon1 Reverse Primer Exon2 mrna Forward Primer R Exon1 TaqMan Probe Q MGB Exon2 Reverse Primer 29 2006 Applied Biosystems

単 体 のレポーター 色 素 青 色 光 により 励 起 エネルギーを 蓄 え 発 光 する 特 徴 をもつ R TaqMan Probe の 特 徴 R Q 蛍 光 共 鳴 エネルギー 転 移 現 象 MGB レポーター 色 素 Fluorescein 系 の 蛍 光 色 素 (FAMもしくはVIC) 5 3 クェンチャー レポーター 色 素 の 蛍 光 エネルギーを 消 去 30 2006 Applied Biosystems

特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 PCR 反 応 時 には TaqMan フ ローブが 先 に 特 異 性 の 高 い 遺 伝 子 領 域 に 結 合 する(68-70 付 近 ) 5 3 Forward Primer TaqMan Probe R Q 5 5 3 5 Reverse Primer 31 2006 Applied Biosystems

特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 次 に 目 的 遺 伝 子 特 異 的 なPrimer が 結 合 する(58-60 付 近 ) 5 3 5 Forward Primer TaqMan Probe R Q 5 3 5 Reverse Primer 32 2006 Applied Biosystems

特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 Primer 部 位 にDNAホ リメラーセ が 結 合 して 伸 長 反 応 が 進 む 5 3 Forward Primer R TaqMan プローブが 分 解 され 始 める Q 5 5 3 5 Reverse Primer 33 2006 Applied Biosystems

特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 DNAホ リメラーセ の 伸 長 方 向 にDNAがあると TaqMan プローブが 分 解 される(エクソヌクレアーセ 活 性 ) Q によって 抑 制 されていた Rの 蛍 光 が 生 じる R TaqMan プローブの RとQ の 距 離 が 離 れて Rが 発 光 し 始 める 5 3 5 Q 5 3 5 34 2006 Applied Biosystems

特 定 遺 伝 子 領 域 の 配 列 の 検 出 PCRが 終 了 し 伸 長 反 応 が 終 了 するとTaqMan フ ローブは 分 解 され Rの 蛍 光 が 検 出 を 検 出 することができる R Q 5 3 5 5 3 5 35 2006 Applied Biosystems

PCRが 進 むと TaqMan フ ローブは 分 解 され レポーターの 蛍 光 強 度 が 増 加 する TaqMan -MGBプローブでは レポーターの 蛍 光 色 素 のみを 検 出 できる 蛍 光 強 度 PCRサイクル 数 36 2006 Applied Biosystems

R TaqMan アッセイでの 反 応 組 成 逆 転 写 試 薬 AppliedBiosystems, P/N TaqMan Reverse Transcri マスターミックス AppliedBiosystems, P/N4 TaqMan Universal PCR Ma DNA Template はcDNA を Total での RNA 質 量 を 元 に 利 用 反 応 組 成 の 一 例 /well Final TaqMan Universal PCR Master Mix (2x) 25μL 1x 10μM Forward Primer 4.5μL 900nM 10μM Reverse Primer 4.5μL 900nM 10μM TaqMan Probe 1.25μL 250nM Template (cdna 10ng/μL) 5μL 50ng d3w 12.75μL Total 50μL 37 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRTaqMan ケミストリの 特 徴 TaqMan プローブが 分 解 されることによって 生 じる 蛍 光 を 検 出 するので 蛍 光 量 がPCR 増 幅 を 反 映 する Primer ペアだけの 設 定 よりも 配 列 特 異 性 を 高 める 事 ができる 2 種 類 の 蛍 光 を 用 いて2Probe アッセイを 行 え サンプルの 有 効 利 用 やコストダウンが 可 能 である SNPタイピングが 可 能 である 低 発 現 遺 伝 子 測 定 の 際 のバラツキを 低 減 できる 38 2006 Applied Biosystems

SYBR Green アッセイ I 特 徴 DNAにインターカレートして 蛍 光 を 発 する 蛍 光 物 質 SYBR Green の I 存 在 下 でPCRを 行 い すべての2 本 鎖 DNAを 検 出 する PCR 産 物 の 定 性 的 な 検 知 が 可 能 注 意 PCRPrimer の 配 列 には 充 分 な 注 意 が 必 要 Primer の 濃 度 に 注 意 が 必 要 プライマーダイマー 由 来 の 蛍 光 が 生 じる non-specific アニーリング 由 来 の 蛍 光 が 生 じる 蛍 光 量 と 反 応 産 物 量 の 比 が 必 ずしも1:1ではない 39 2006 Applied Biosystems

PCR 反 応 が 進 み 増 幅 産 物 が 増 えると SYBR Green の 蛍 光 量 も 増 加 する PCR 反 応 スタート PCR 反 応 終 了 40 2006 Applied Biosystems

SYBR Green ケミストリ 使 用 時 には Primerの 設 計 に 注 意 が 必 要 である ATATATAT 1 2 3 4 互 いに 結 合 ATATATAT TATATATA 120bp DNAPolimeraseが 認 識 PCR 反 応 で 増 幅 1 目 的 バンド 2Primerダイマー 3スメアー 4 非 特 異 的 バンド Primer の 設 計 での 注 意 や 反 応 条 件 の 最 適 化 が 必 ず 必 要 41 2006 Applied Biosystems

SYBR Green 反 応 液 組 成 SYBR Green アッセイでの 反 応 組 成 逆 転 写 試 薬 AppliedBiosystems, P/N N80 TaqMan Reverse Transcripti マスターミックス AppliedBiosystems, P/N 436 Power SYBR Green Master Mi DNA Template はcDNA を Total での RNA 質 量 を 元 に 利 用 反 応 組 成 の 一 例 /well Final SYBR Green PCR Master Mix (2x) 25μL 1x 10μM Forward Primer xxμl 50-900nM 10μM Reverse Primer xxμl 50-900nM Template (cdna 10ng/μL) 5μL 50ng d3w xx μl Total 50μL No template control で プライマーダイマーができない 条 件 等 を 複 数 検 討 することが 必 要 です 42 2006 Applied Biosystems

SYBR Green PCR 正 確 Assay な 定 量 結 果 を 得 る 為 に 非 特 異 的 産 物 の 生 成 の 確 認 (Dissociation の 作 成 ) Curve 一 見 高 コピー 領 域 で 定 量 できているように 見 受 けられるが 全 てのサンプルにおいて 非 特 異 的 産 物 が 生 成 している 定 量 性 に 非 常 に 大 きな 疑 問 4 倍 希 釈 (8 段 階 ) 非 特 異 的 産 物? プライマーダイマー? NTC 43 2006 Applied Biosystems

リアルタイム 定 量 PCRの 解 析 法 内 在 性 コントロールによるサンプル 間 の 補 正 検 量 線 を 用 いない 新 しい 比 較 定 量 方 法 44 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRによる 定 量 法 の 例 ( 内 在 性 コントロールで 相 対 値 で 比 較 ) 希 釈 率 で 検 量 線 を 作 成 して 比 較 する 方 法 サンプル 0 hrs 標 的 遺 伝 子 発 現 量 (p53) 0.2 内 在 性 コントロール 標 準 化 比 較 結 果 遺 伝 子 発 現 量 (GAPDH ) (p53/gapdh) (0hrsを1として) 0.1 2 1 12 hrs 1.0 0.25 4 2 24 hrs 2.4 0.3 8 4 36 hrs 3.0 0.3 10 5 p53の 発 現 量 6 5 4 3 p53の 発 現 量 2 1 0 0 hrs 12 hrs 24 hrs 36 hrs 45 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRによる 定 量 法 の 例 ( 比 較 定 量 法 ) 検 量 線 を 作 成 せずに 比 較 定 量 する 方 法 Comparative T 法 C 1サイクルの 検 出 の 違 いで 2 倍 量 の 差 であるという 理 論 を 活 用 して 算 出 する 方 法 2 - CT * 検 量 線 作 成 が 不 要 なので 多 サンプルを 処 理 できる* C T 法 の 成 立 する 条 件 1 ターゲット 遺 伝 子 と 内 在 性 コントロール 遺 伝 子 のPCR 効 率 がほぼ 等 しい 希 釈 によって C T 値 が 変 動 しない= 検 量 線 を 描 いた 時 の 傾 きが 同 じ 2 PCR 効 率 が1に 近 い 設 計 のガイドラインに 基 づくとPCR 効 率 の 良 い 短 いPCR 産 物 のサイズで 設 計 ができる 46 2006 Applied Biosystems

GAPDH 遺 伝 子 を 内 部 標 準 として 用 い Brain でのc-myc 遺 伝 子 の 発 現 量 を 1とした 場 合 の 各 臓 器 におけるc-myc 遺 伝 子 の 発 現 量 を 比 較 標 的 遺 伝 子 参 照 遺 伝 子 Ct 値 Ct 2 - Ct 相 対 比 組 織 Brain ( 脳 ) Kidney 27.0322.6627.03-22.66 4.37-6.86 2 2.5 =5.6 ( 腎 臓 ) Liver 26.2524.6026.25-24.60 1.60-6.86 ( 肝 臓 ) Lung ( 肺 ) c-mycの 平 均 Ct 値 GAPDHの 平 均 Ct 値 (c-myc)ct 値 30.4923.6330.49-23.63 6.86-6.86 2 0 =1 =6.86 =4.37 = -2.5 =1.60= -5.21 25.8323.0125.83-23.01 2.81-6.86 * Ct 値 は 一 定 の 蛍 光 強 度 に 達 したサイクル 数 * 指 数 の 割 り 算 は 乗 数 項 の 引 き 算 - (GAPDH)Ct 値 ( 各 臓 器 の Ct 値 ) =2.81= -4.05 2 5.21 2 4.05 =37 =16.5 c-mycの 発 現 比 較 (GAPDH で 補 正 ) 5.6 16.5 47 2006 Applied Biosystems - (Brain の Ct 値 ) =0 乗 数 項 に 代 入 1 37

Brain でのc-myc 遺 伝 子 の 発 現 量 を1とした 場 合 Kidney では5.6 倍 Liver では37 倍 Lung では16.5 倍 の 発 現 量 があった 組 織 相 対 比 cmyc の 発 現 量 Brain ( 脳 ) 1 40 35 Kidney ( 腎 臓 ) 5.6 30 25 Liver ( 肝 臓 ) 37 20 15 cmyc の 発 現 量 Lung ( 肺 ) 16.5 10 5 0 Brain Kidney Liver Lung 48 2006 Applied Biosystems

内 在 性 コントロール 遺 伝 子 とは? 組 織 や 細 胞 の 個 数 をそろえ 反 応 系 へのcDNA 持 込 量 やRT 効 率 の 差 を 補 正 刺 激 などに 対 して 発 現 量 が 変 化 せず 常 に 一 定 量 発 現 している 遺 伝 子 が 望 ましい 歴 史 的 には ハウスキーピング 遺 伝 子 (GAPDH, β-actin,etc) 18s rrna などが 利 用 されてきた しかし 49 2006 Applied Biosystems

PO IPC (Positive Control) 18S ribosomal RNA PO 複 数 の 臓 器 での 内 在 性 コントロール 検 討 beta-actin CYC GAPDH 18srRNA やβ-Actin GUS TBP 遺 伝 子 は 各 臓 器 間 での 変 動 が 少 なく 各 サンプル 間 での 増 幅 曲 線 が 隣 接 している また GAPDH TfR 遺 伝 子 は 変 動 が 大 きく 各 臓 器 での 増 幅 曲 線 に 変 動 が 見 られる なお 当 実 験 の 結 果 がすべての 実 験 系 に 当 てはまるわけではないので 個 々の 実 験 系 に 応 じて 検 討 する 必 要 がある ß 2 -Microglobulin PGK GUS HPRT TBP TfR 50 2006 Applied Biosystems

異 なる 内 在 性 コントロール 遺 伝 子 を 用 いた 解 析 結 果 の 比 較 Bone Marrow を 基 準 としたIL-10 の 相 対 定 量 結 果 30.0 25.0 18s Normalized IL-10 GAPDH Normalized IL-10.5 8 2 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0.4 5 1.0 2.5 1.6 2.9.0.4 1 1 Bone Marrow Spleen Thymus Lung 51 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRのアッセイ 選 択 52 2006 Applied Biosystems

TaqMan Gene Expression Assays 遺 伝 子 発 現 解 析 用 のTaqMan Gene Expression Assays 条 件 検 討 不 要 論 文 にもそのまま 採 択 高 品 質 なデータを 提 供 Webから 検 索 & 発 注 ( 検 索 のみは 登 録 不 要 ) TaqMan Gene Expression Assays Inventoried Assay: Pre-made デザイン 済 み 在 庫 あり 100 反 応 (50μL 反 応 時 ) 250 反 応 (20μL 反 応 時 ) 28,000- Non-Inventoried Assay: Made-to-Order デザイン 済 み 在 庫 なし 140 反 応 (50μL 反 応 時 ) 360 反 応 (20μL 反 応 時 ) 45,000-53 2006 Applied Biosystems

TaqMan Gene Expression Assays 54 2006 Applied Biosystems

TaqMan Gene Expression 検 索 方 法 Assays 55 2006 Applied Biosystems

TaqMan Gene Expression 検 索 方 法 Assays 56 2006 Applied Biosystems

TaqMan Gene Expression 検 索 方 法 Assays 遺 伝 子 名 やRefSeq 入 力 動 物 種 入 力 検 索 ID 57 2006 Applied Biosystems

TaqMan Gene Expression 検 索 方 法 Assays 検 索 オプションあり 58 2006 Applied Biosystems

Pre-madeとMade to Orderの 違 い 価 格 Pre-made : 28,000-/100 反 応 分 Made to Order : 45,000-/150 反 応 分 納 期 Pre-made : 約 1 週 間 Made to Order : 約 2 週 間 QCチェック(humanのみ) Pre-made : humanのcdnaサンプルを 用 いて 増 幅 確 認 済 み Made to Order : 増 幅 は 未 確 認 特 に 設 計 位 置 の 指 定 がないときにはPre-madeアッセイを 推 奨 します 59 2006 Applied Biosystems

Assay に 含 まれる ID 情 報 Hs00355914_m1 1 2 3 1 生 物 種 : 学 名 の 頭 文 字 の 組 み 合 わせ Hs: H. Sapience Mm: M. musculus Rn: R. norvegicus At: A. thaliana Dm: D. melanogaster 2 プライマー プローブセット 固 有 の 番 号 設 計 した 順 番 に 割 り 当 てられ 数 が 大 きいほど 新 規 に 設 計 3 Genomic 由 来 の DNA 増 幅 m: genomic が 混 入 していても DNA 増 幅 しません s: 同 一 のエキソン 上 にプライマー プローブが 設 計 されているので genomic が 混 入 DNA していたら 増 幅 します g: 染 色 体 上 に 相 同 性 の 高 い 配 列 が 存 在 するため genomic DNA から 増 幅 する 恐 れがあります u: 挟 んであるイントロンサイズが 短 いため genomic から 増 DNA 幅 する 恐 れがあります 3 配 列 の 特 異 性 1: ターゲット 遺 伝 子 特 異 的 に 検 出 することができます H: 相 同 性 が 高 いmRNAからも 若 干 (10-15cycle のずれで) 増 幅 する 可 能 性 あり 60 2006 Applied Biosystems

複 数 のアッセイから 選 択 するときのポイント ~Assay IDでの 判 断 ~ 右 から2 番 目 のアルファベットが m のものを 選 択 genomic DNAからの 増 幅 を 考 慮 する 必 要 がありません 一 番 右 が 1 のものを 選 択 特 異 性 の 高 いセットを 選 択 番 号 が 大 きいものを 選 択 最 新 のデータベース 上 の 転 写 産 物 配 列 情 報 を 元 に 設 計 されているものを 選 択 注 記 : 上 記 は 目 安 です ターゲットとなる 配 列 情 報 も 併 せてご 判 断 いただくことをお 勧 めします 61 2006 Applied Biosystems

Pre-madeアッセイが 沢 山 ある 時 の 例 1 Assay IDの 数 字 が 一 番 大 きい 最 新 のアッセイ 対 象 となる 配 列 数 が 最 も 多 い 網 羅 的 に 検 出 することが 可 能 62 2006 Applied Biosystems

Pre-madeアッセイが 沢 山 ある 時 の 例 2-a Assay IDの 数 字 が 一 番 大 きい 最 新 のアッセイ 対 象 となる 配 列 数 が 最 も 多 い 網 羅 的 に 検 出 することが 可 能 このように 最 新 のアッセイの 対 象 とする 配 列 数 が 多 くない 場 合 全 てのバリアントを 検 出 することができない 可 能 性 が 高 い Map Viewにて 対 象 となるExon 位 置 の 確 認 が 必 要 です 63 2006 Applied Biosystems

Pre-madeアッセイが 沢 山 ある 時 の 例 2-b Map View Hs00249794_m1 : NM_016724のみ 検 出 可 能 Hs00249794_m1 Hs00357143_g1 Hs00357143_g1 : 全 てのSplicing Variantの 検 出 可 能 しかし g なので genomic DNA 由 来 の 増 幅 の 可 能 性 あり Hs00360501_m1 : HM_016724 及 び NM_016730の2つのValiant のみ 検 出 可 能 64 2006 Applied Biosystems

PreAmp Master Mix 65 2006 Applied Biosystems

TaqMan PreAmp Master Mix リアルタイムPCRに 用 いるcDNAを 増 幅 させる 試 薬 TaqMan Gene Expression Assays と 共 に 利 用 SYBRや 自 家 設 計 のPrimerは 非 対 応 最 大 100 遺 伝 子 までをマルチプッレクスPCRで 増 幅 その 後 希 釈 してリアルタイムPCRを 実 施 cdna 足 りていますか? 解 析 するべき 遺 伝 子 が 多 数 あるが cdnaが 足 りない 場 合 に 最 適 臨 床 検 体 レーザーマイクロダイセクションサンプル から 大 量 の 遺 伝 子 解 析 が 可 能 発 現 量 が 少 ない 遺 伝 子 の 増 幅 をさせるものではない 66 2006 Applied Biosystems

通 常 のリアルタイムPCR PreAmpを 用 いたリアルタイムPCR サンプル( 組 織 細 胞 ) RNA 抽 出 RNA 逆 転 写 反 応 (RT) cdna リアルタイムPCR(10ng/tube) 発 現 解 析 結 果 (1 遺 伝 子 ) サンプル( 組 織 細 胞 ) RNA 抽 出 RNA 逆 転 写 反 応 (RT) cdna PreAmp(10もしくは14サイクル (10ng/tube) 希 釈 (5 倍 もしくは20 倍 ) リアルタイムPCR 発 現 解 析 結 果 (50 遺 伝 子 もしくは200 遺 伝 子 解 析 ) 67 2006 Applied Biosystems

TaqMan PreAmp Master Mix 商 品 構 成 (1キットに2 種 類 の 試 薬 を 含 みます) Pre-PCRを 行 いマルチプレックスで 遺 伝 子 増 幅 増 幅 後 に 個 別 のリアルタイムPCRで 検 出 増 幅 させるサンプル 数 :40 検 体 通 常 のTaqMan Universal PCR Master Mix 付 属» 20μLの 反 応 系 (96Wellプレート)で500 反 応 分» 50μLの 反 応 系 (384Wellプレート)で200 反 応 分 68 2006 Applied Biosystems

TaqMan PreAmp Master Mix cdna 足 りていますか? リアルタイムPCRの 場 合 は1サンプルあたり10-100 ngのcdnaが 必 要 サンプルが 微 量 な 場 合 は 解 析 できる 遺 伝 子 が 数 種 類 しか 出 来 ない cdnaが 少 ないので 2 遺 伝 子 しか 研 究 できない cdnaをpreampしたので 20 遺 伝 子 を 研 究 できる! 69 2006 Applied Biosystems

TaqMan PreAmp Master Mix 均 一 にバイアスをかけることなくマルチプレックスPCRを 行 う 最 大 100Plex までPre -PCR 反 応 する 事 ができる 10サイクル:およそ1,000 倍 50 反 応 14サイクル:およそ10,000 倍 200 反 応 RIN9.0 もRIN7.4 も 同 様 の 結 果 を 得 る デグラしたRNAでも 可 能 18s rrna を 含 むPrimer セットではマルチプレックス 不 可 3ng/well cdna で 測 定 時 にCtが35より 早 い 遺 伝 子 に 対 応 CDKN1B 遺 伝 子 をコントロールに 推 奨 70 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRに 用 いる 目 的 のサンプル 数 にあわせてPreAmp 試 薬 での 増 幅 サイクルを10サイクル もしくは14サイクルに 設 定 することにより 必 要 とする サンプル 数 に 対 応 した 溶 液 を 得 ることができます ( 下 図 参 照 ) スタート 時 の cdna 量 PreAmp 試 薬 での 増 幅 サイクル 数 PreAmp 後 の 希 釈 割 合 リアルタイムPCRに 利 用 できるサンプル 数 1-250ng 10 1:5 50 14 1:20 200 通 常 は10サイクルでのPre -PCRを 推 奨 71 2006 Applied Biosystems

PreAmp 試 薬 を 用 いたサイトカイン 関 連 遺 伝 子 の 発 現 解 析 使 用 したサイトカイン 関 連 遺 伝 子 Assay 24 種 類 ( 右 表 参 照 ラボにあるストックを 利 用 ) 15 種 類 : 評 価 可 能 な 発 現 量 あり 9 種 類 : 今 回 用 いたサンプルでは 発 現 なし (Ctが35 以 降 で PreAmpの 評 価 の 対 象 外 ) 内 在 性 コントロール:CDKN1B 使 用 したサンプル(ラボにストックのあるcDNAを 利 用 ) Raji cdna (B-lymphocyte; Burkitt's lymphoma) Universal Human Reference cdna as Control. Total cdna amount: 810ng for No PreAmp Total cdna amount: 125ng for PreAmp Gene Expression CCR1 OK CCR2 OK CCR4 OK CCR5 OK CDK4 OK MDC OK TGF beta OK IFN ganma Not Expressed TNF alfa OK TNF beta Not Expressed MCP-1 OK CD23 OK CD25 Not Expressed CD69 OK IL-2 Not Expressed IL-3 Not Expressed IL-4 OK IL-5 Not Expressed IL-7 OK IL-10 OK IL-13 Not Expressed IL-17 Not Expressed IL-18 Not Expressed CDKN1B OK 72 2006 Applied Biosystems

PreAmp 試 薬 を 用 いたサイトカイン 関 連 遺 伝 子 の 発 現 解 析 (まとめ) PreAmp 前 PreAmp 後 平 均 Ct 値 平 均 Ct 値 平 均 Ct 値 の 差 分 遺 伝 子 No PreAmp PreAmp(No PreAmp) - (PreAm 1 28.4722.11 6.36 2 25.3718.66 6.71 3 22.2915.91 6.39 4 27.8719.63 8.24 5 22.9916.26 6.73 6 24.2017.62 6.57 7 33.8130.23 3.59 8 25.2618.43 6.83 9 26.6719.76 6.92 10 28.3721.39 6.98 11 32.7726.03 6.75 12 24.3617.31 7.05 13 27.4720.88 6.59 14 24.7318.24 6.49 15 26.0719.68 6.39 16 28.4121.76 6.66 17 27.8721.41 6.46 18 23.9617.15 6.82 73 2006 Applied Biosystems

PreAmp 試 薬 を 用 いたサイトカイン 関 連 遺 伝 子 の 発 現 解 析 (まとめ) 31.00 29.00 y = 1.1234x - 9.8823 R 2 = 0.9523 27.00 25.00 23.00 21.00 19.00 17.00 15.00 20.0022.0024.0026.0028.0030.0032.0034.0036.00 74 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRでの RNAi 効 果 の 検 証 75 2006 Applied Biosystems

リアルタイムPCRでのsiRNA 効 果 測 定 HPRT 遺 伝 子 の 発 現 量 1.20 1.00 未 処 理 0.80 0.60 0.40 sirna -HPRT 0.20 18s rrna 遺 伝 子 の 発 現 量 0.00 NC#1 sirna-hprt 未 処 理 sirna -HPRT sirna 処 理 でおよそ2サイクルの 変 化 あり 18s rrna で 発 現 比 較 を 行 ったところ およそ80%のKnock を 確 down 認 76 2006 Applied Biosystems

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. TaqMan MicroRNA Assay: NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE A license to perform the 5' nuclease process for research requires the use of a Licensed 5' Nuclease Kit (containing Licensed Probe), or the combination of an Authorized 5' Nuclease Core Kit plus Licensed Probe, or license rights that may be purchased from Applied Biosystems. This product contains Licensed Probe. Its purchase price includes a limited, non-transferable immunity from suit under U.S. Patents Nos. 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930, 6,030,787, and 6,258,569, and corresponding patent claims outside the United States, owned by the Applera Corporation, and U.S. Patent No. 5,804,375 (claims 1-12 only) and corresponding patent claims outside the United States, owned by Roche Molecular Systems, Inc. or F. Hoffmann-La Roche Ltd ( Roche ), for using only this amount of probe in the practice of the 5 nuclease process solely for the purchaser s own internal research. This product is also a Licensed Probe for use with service sublicenses available from Applied Biosystems. This product conveys no rights under U.S. Patents Nos. 5,210,015 and 5,487,972, or corresponding patent claims outside the United States, which claim 5 nuclease processes, or under U.S. Patents Nos. 5,476,774 and 5,219,727, or corresponding patent claims outside the United States, which claim quantification methodology, expressly, by implication, or by estoppel. No right under any other patent claims (such as apparatus or system claims) and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is hereby granted expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses require a separate license from Roche. Notice to Purchaser: Disclaimer of License The TaqMan MicroRNA Assay is optimized for use in the polymerase chain reaction (PCR) covered by patents owned by Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffmann-La Roche Ltd. No license under these patents to use the PCR Process is conveyed expressly or by implication to the purchaser by the purchase of these products. A license to use the PCR Process for the purchaser's own internal research accompanies the purchase of certain Applied Biosystems reagents when used in conjunction with an authorized thermal cycler, or is available from Applied Biosystems. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Dr., Foster City, California 94404, USA. The SYBR Green dye is sold pursuant to a limited license from Molecular Probes, Inc. Applied Biosystems is a registered trademark and AB (Design) and Applera are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries. AmpliTaq Gold and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. SYBR is a register trademark of Molecular Probes, Inc. Copyright 2005. Applied Biosystems. All rights reserved. 77 2006 Applied Biosystems