第 17 回バイオ治療法研究会 発育鶏卵を用いた 5-Aminolevulinic acid および Tin Chlorin e6 の薬物動態と超音波増感活性の評価 宇都義浩 1, 玉谷大 1, 水木佑輔 1, 遠藤良夫 2, 大久保敬 3, 中西郁夫 4, 石塚昌宏 5, 田中徹 5, 口池大輔 1,6, 久保健太郎 6, 乾利夫 1,6, 堀均 1 1 徳島大学大学院 STS 研究部 2 金沢大学がん進展制御研究所 3 大阪大学大学院工学研究科 4 放射線医学総合研究所 5 SBI ファーマ 6 医療法人再生未来
超音波療法 (SDT) と超音波増感剤 Canaparo R, et al., Anticancer Res. 26(5A), 3337-42, 26. Ohmura T, et al., Anticancer Res. 31(7):2527-33, 211. DEG ATX-7 Tsuru H, et al., Free Radic. Biol. Med. 53(3), 464-72, 212. ALA PpIX サン クロレラ HP より Chlorin e6 derivatives Yumita N, et al., Anticancer Res. 31(2), 51-6, 211.
SDT 免疫併用療法 ( 医療法人再生未来での実施例 ) 5-ALA (1 g/ 経口 ) ACT4211 (SF1, 25-1 mg/ 点滴 ) Wang X, et al., Integr. Cancer Ther. 7(2), 96-12, 28. Wang X, et al., Integr. Cancer Ther. 8(3):283-7, 29. Zhou S, et al., Cell Signal. 2(4), 695-74, 28.
胃がん 1! ALA と ACT4211 による PDT 抗腫瘍効果の違い 1! Inhibition ratio (%) 75! 5! 25! MKN-45 5-ALA! NUGC-4 5-ALA! Nakajima 5-ALA! BOSC23 5-ALA! Inhibition ratio (%) 75! 5! 25! MKN-45 TCE6! NUGC-4 TCE6! Nakajima TCE6! BOSC23 TCE6!! 乳がん Inhibition ratio (%) 1! 75! 5! 25!! 31.3! 62.5! 125! 25! 5! 1! 5-ALA (µm) MCF-7 5-ALA! MDA-MB-231 5-ALA! BT549 5-ALA! Hs578T 5-ALA! Inhibition ratio (%)! 1! 75! 5! 25!! 3.1! 6.3! 13! 25! 5! 1! 2! ACT4211 (µm) MCF-7 TCe6! MDA-MB-231 TCe6! BT-549 TCe6! Hs578T TCe6!!! 31.3! 62.5! 125! 25! 5! 1!!! 3.1! 6.3! 13! 25! 5! 1! 2! 5-ALA (µm) 213718!5x1^3/well in 19 µl! 213719!Added 1 µ L ALA or ACT4211!!4-h incubation!!mc to growth medium 2 µl!!5-min PDT! V!72-h incubation! 213722!WST-8 MTT! ACT4211 (µm)
目的 ALA および Tin Chlorin e6 の超音波増感剤としての可能性を検証するために 動物モデルである発育鶏卵を用いて両薬剤の薬物動態と超音波増感による in vivo 抗腫瘍活性を評価した
EMT6/KU 細胞に対する 5-ALA&Tin Chlorin e6 の取込量の経時変化 PpIX (pmol) 14 12 1 8 6 4 Tin Chlorin e6 (pmol) 7 6 5 4 3 2 2 1 1 min 1 h 3 h 5 h 7 h 15 h 1 min 3min 1h 3h 5h 7h Incubation Time Incubation Time 1) 7.5 1 4 cells を φ6 シャーレに播種し 24 h 培養 2) 24 h 培養後 (3. 1 6 cells) ALA (1 mm, 5 µmol) または Tin Chlorin e6(1 μm,.5 µmol) を添加 3) PBS で洗浄し 2%- Triton X- 1 で細胞をホモジナイズして薬剤を抽出 4) 15,rpm, 1min で遠心分離を行い上清 (1 μl) を蛍光測定 (excitajon : 41 nm emission : 63 nm) ALA PpIX Tin Chlorin e6
ALA および Tin Chlorin e6 の超音波増感による抗腫瘍活性 1.2 * ** 1.2 * * * 1. 1. Surviving Fraction.8.6.4 Surviving Fraction.8.6.4.2.2..3.6.9 ulsのみ output(w) 5- ALA + ULS 1) 96well プレートに 2.5 1 2 cells/well の EMT6/KU 細胞を播種 2) 5 h 培養後 生食もしくは 5- ALA (1 mm) を添加 3) 5 h 培養後 PBS で wash し遠赤外光で保温しながら超音波を照射 4) 72 h 培養後 WST- 1 試薬を添加し 1.5 h 反応させて吸光度測定..3.6.9 ulsのみ output(w) Tin Chlorin e6 + ULS 1) 96well プレートに 1. 1 3 cells/well の EMT6/KU 細胞を播種 2) 24 h 培養後 メイロンもしくは Tin Chlorin e6 (.5 mm) を添加 3) 3 h 培養後 PBS で wash し遠赤外光で保温しながら超音波を照射 4) 24 h 培養後 WST- 1 試薬を添加し 3 h 反応させて吸光度測定 ALA PpIX Probe: 6mm (.184cm 2 ) Frequency: 986 khz Duty Cycle: 2% Irradiation time: 1 min Tin Chlorin e6
腫瘍移植鶏卵モデルによる薬物動態解析 Day15 の腫瘍移植鶏卵に ALAorTCe6 (1 mg/egg) を静注 検出装置 光源 摘出した腫瘍に 2% Triton X-1 in DW を添加 ホモジナイズして抽出 光源 :LLS-45 VIS LED 光源 (BAS 社 ) 検出装置 :SEC2-VIS/NIR スペクトロメーター SLIT2 蛍光測定装置 (BAS 社 ) 15, rpm で 15 分間遠心 上清 4 µl を蛍光強度の測定に使用
6 ALA 投与後の肝臓 血中 腫瘍内 PpIX 量の経時変化 肝臓血清 1 PpIX (pmol)/mg wet tissue 5 4 3 2 1 PpIX (µm) 8 6 4 2 1 min 1 h 3 h 5 h 7 h 24 h Incubation Time 1 min 1 h 3 h 5 h 7 h 24 h Incubation Time 6 腫瘍 PpIX (pmol)/mg wet tissue 5 4 3 2 1 1 min 1 h 3 h 5 h 7 h 24 h Incubation Time PpIX
肝臓 血中 腫瘍内の Tin chlorin e6 量の経時変化 TCe6 (pmol)/mg wet tissue 6 5 4 3 2 1 肝臓 TCe6 (µm) 1,2 1, 8 6 4 2 血清 1 min 3 min 1 h 1.5 h 2 h 5 h 24h 1 min 3 min 1 h 1.5 h 2 h 5 h 24h Incubation Time Incubation Time 2 腫瘍 TCe6 (pmol)/mg wet tissue 175 15 125 1 75 5 25 投与 24 時間後の鶏卵漿尿膜 Tin Chlorin e6 (TCe6) 1 min 3 min 1 h 1.5 h 2 h 5 h 24h Incubation Time
腫瘍移植鶏卵を用いた超音波増感活性の評価法 Day1: 孵卵開始 (37 ) A D Day11: EMT6/KU 細胞添加 (2.5 1 5 cells) B Day13: リング外し C Day15:ALA (1 mg/egg) を静注して 3 時間後超音波照射 E Day18: 腫瘍摘出
ALA の超音波増感による in vivo 抗腫瘍活性 3 * ** 25 2 ns control ALA ULS 15 ALA+ULS 1 5 control ALA (1 mg/egg) ULS ALA+ULS ALA PpIX Power: 2.5 W; Frequency: 986 khz; Duty Cycle: 8%; Irradiation time: 1 min
DPBF 法による一重項酸素の検出 1.2 1 in acetonitrile.8 1,3-Diphenylisobenzofurane (DPBF) Absorbance.6.4.2 PpIX (2 μm) 41 DPBF (5 μm) 35 4 45 5 Wavelength (nm) M. A. Caine, et al., Dyes and Pigments, 52, 55 65, 22. DPBF は一重項酸素と選択的に反応して酸化分解されることで 41 nm の吸光度が低下する
PpIX&Tin Chlorin e6 の超音波照射による一重項酸素の生成 1.2 未照射 (PpIX+DPBF) 1.2 照射 (DPBF) 1.2 照射 (PpIX+DPBF) 1 Abs 1.8.6.4.2 41 2 4 6 8 1 (min) 35 4 45 5 Wavelength(nm) Abs 1.8.6.4.2 41 35 4 45 5 Wavelength(nm) 1 2 4 6 8 1 (min) Abs 1.8.6.4.2 41 2 4 6 8 1 (min) 35 4 45 Wavelength(nm) 5 吸光度の減少率 (%) 5 未照射 (PpⅨ+DPBF) 照射 (DPBF のみ ) 照射 (PpⅨ+DPBF) 5 未照射 (TCe6+DPBF) 照射 (DPBF のみ ) 照射 (TCe6+DPBF) 2 4 6 8 1 超音波の照射時間 (min) Power: 2.5 W Frequency: 986 khz Duty Cycle: 8% 2 4 6 8 1 超音波の照射時間 (min)
近赤外発光法による一重項酸素の検出 3 PpIX Me 25 Tin Chlorin e6 Me Emission Intensity (cps) 2 15 1 5 TCe6 Me PpIX Me 近赤外分光測光装置 ( 浜松ホトニクス社 ) 123 124 125 126 127 128 129 13 131 132 Wavelength (nm) Power:.283 W; Frequency: 986 khz; Duty Cycle: 1% Kikuchi A, et al., J. Phys. Chem. A, 117, 1413-7, 213. PpIX Me (2.25 mm/benzene-d 6 ) Tin Chlorin e6 Me (4.22 mm/benzene-d 6 )
まとめ ALA および Tin Chlorin e6 は超音波との併用により有意な in vitro 抗腫瘍活性を示した また 腫瘍細胞への取込については ALA は EMT6/KU 細胞への取込効率が低いか もしくは PpIX の排出作用により Tin Chlorin e6 に比べて 3 オーダー低い取込率を示した 一方 腫瘍移植鶏卵モデルにおいては ALA は Tin Chlorin e6 と比較して約 1/2 の腫瘍への取込量であり 腫瘍血管への集積が示唆された 超音波増感による in vivo 抗腫瘍活性については 超音波単独群および ALA+ 超音波群が有意な抗腫瘍活性を示したが ALA による増感作用は認められなかった なお PpIX および Tin Chlorin e6 は超音波照射による一重項酸素の生成が DPBF 法によって示唆されたが 1,27 nm 付近の発光スペクトルは検出されなかった 以上の結果より 発育鶏卵を用いた in vivo 評価系は超音波増感剤の薬物動態と抗腫瘍活性の評価に有用であることが示された ただし ALA および Tin Chlorin e6 は全く異なる細胞内取込および薬物動態を有するため 腫瘍細胞の選択が大変重要である