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1 MATRA, Deden Derajat 12am111s 2013/06/13 核 DNA マーカーにより G. mangostana および近縁類の系統関係を解析 ITS 領域データによるマンゴスチン (Garcinia mangostana) 及び近縁類 (Garcinia sp.) の系統関係の解析 要約核リボソーム DNA(nrDNA) の内部転写スペーサー領域 (ITS) による G. mangostana の含まれている17の Garcinia 種の系統関係を解析した Parsimonious 法および neighbor joining(nj) 法によりマンゴスチンの祖先として G. malaccensis と密接に関係がある G. mangostana を解析した G. hombroniana は G. malaccensis よりマンゴスチンと遠いという系統関係を明らかにした G. hombroniana は G.rostrata,G.speciosa,G.sizygiifolia を分類し G. mangostana および G. malaccensis の系統樹を関連した ITS 領域解析により G.atroviridis, G.cowa, G.dulcis, G. malaccensis, G. mangostana, G.rostrata, G.speciosa, G.sizygiifolia は各 ITS 領域における塩基配列 (2つの塩基の異なる同じ塩基の箇所 ) を添加した 祖先と交雑した様々 Garcinia 種の変異の可能性があり 染色体数でもゲノム情報をまだ明らかにしない 背景マンゴスチンは果形および果色 食味のよい熱帯果物としてよく知られ 熱帯果物の女王と呼ばれている マンゴスチンの原産地は東南アジアであると報告されている タイではおよそ22の Garcinia 種があると報告された (Smitinand, 1980) マンゴスチンはデザートとしてよく食べられ 乾燥果皮の中にタンニンおよびキサントンが多く含まれていることから 医療用としてもよく使われている タイでマンゴスチンは経済的果物の1つとして重要である マンゴスチンの生殖器官は雌花しかないことから アポミクシスと呼ばれる Richard(1990b) によりマンゴスチンは G. malaccensis と G. hombroniana が交雑し 異質倍数性である Richard(1990b) により13の形態学的形質として マンゴスチンが祖先の中間であるという仮説がなされた だが その仮説は分子マーカー法の分析でまだ解析されなかった Garcinia 種の遺伝情報および系統関係の研究は限られている 内部転写スペーサー領域 (ITS) とは核リボゾーム DNA である 18S と26S の間に存在する領域であり それぞれが ITS1 および ITS2 と呼ばれている 多くの被子植物で ITS マーカーは属内および属外の系統関係を解析する Coffea spp (Lashermes ら,1998), Glycine spp (Kollipra, 1997), Allium spp (Dubouzet and Shinoda, 1998), Asarum (Kelly ら, 1998), Artemisia (Kornkven ら, 1998), Loasaceae (Moody ら, 2001), Mangifera (Yonemori ら, 2002) では系統関係を解決するため ITS 領域を使った 1

2 材料及び方法タイ インドネシア マレーシア オーストラリアからそれぞれの17の Garcinia 種およびマンゴスチンを収集した ( 表 1) Mammea siamensis と Calophyllum inophylum は外集団として選ばれた CTAB 法 (Doyle and Doyle, 1987) により抽出した DNA を改良した (Schnell ら,1995) ITS-4 および ITS- 5 の ITS プライマー (White ら, 1990) を用いる 5.8S nrdna および ITS1 ITS2 領域を増幅した Spin-Column (Suprec-02 ) を通して PCR 産物を精製し 直接シーケンス法によって ITS 領域を読んだ ITS-2/ITS-5 および ITS-3/ITS-4 のプライマーによりそれぞれの ITS1 および ITS2 の配列を読んだ GENETYX-MAC 7.3 を用いたシーケンスをアライメントし 参考論文 (Baldwin, 1992; Kollipara ら 1997; Lashermes ら 1997) により ITS1 5.8S ITS2 の領域を測定した ( アライメント ) 系統樹の作成はneighbor joining(nj)method(kimura 2- parameter distance calculation) および the heuristic search with TBR- branch swapping saving the multiple tree (MulTrees) によるmaximum parsimony (MP) を適用してPAUP 4.0b10(Swofford, 2002) で行う NJ と MP 解析による系統樹の信頼性は250 回のbootstrap 値 (%) によって判定する (Felsenstein 1985) DrawgramおよびDrawtreeによりNJ 系統樹を作成した 表 1 Garcinia 種及び外集団のリスト 結果 表 2 Garcinia 種の中および 2 つ外集団に関する ITS 領域の特性 2

3 Garcinia 種の ITS 領域は 616 から621bp の間に塩基配列の長さを示した ( 表 2) それぞれ ITS 領域は ITS1 が 254 から 257bp の塩基配列の長さを示し ITS2 が 199 から 202bp の塩基配列の長さを示した ( 表 2) 5.8SrDNA は変異がないので 全種の長さが 163bp を示した 外集団の C.inophyllum および M.siamensis はそれぞれ 593bp, 594bp の ITS 領域の長さを示した Garcinia 種では ITS 領域の GC 含量は 49.59% から 52.51% であった 外集団の ITS 領域の GC 含量は Garcinia 種より 69.13%(C.inophyllum) および 57.74%(M.siamensis) が高かった Garcinia 種の配列を比較すると 11 箇所で挿入欠失変異が見つかった それぞれの変異の個所は ITS1 が 7ヶ所 ITS2 が4ヶ所と示された それぞれの ITS 領域の多型は ITS1 が93ヶ所 ITS2 が83ヶ所 5.8SDNA が3ヶ所と示した 外集団に加えると 変異箇所は ITS1 が S が14 ITS2が 177 である さらに それぞれの種は塩基を挿入した 挿入というのは ITS 領域に2つの異なる塩基が同じ個所に挿入されること (Sang ら, 1995) G. atroviridis, G. vilersiana, G. malaccensis, 1つの G. mangostana では 1 つの塩基を挿入した箇所があった G. rostrata, G. dulcis, G. cowa は2つの塩基を挿入した箇所っもあった G. dulcis, G. hombroniana, G. malaccensis は挿入した塩基の箇所はほぼ同じであった G. mangostana の塩基を挿入した箇所はタイからの遺伝子型が異なった Parsimonious 解析 ( 図 1) による G. hombroniana は G. rostrata, G.speciosa, G. sizgiifolia とともにグループを結成した また このグループは G. mangostana G. malaccensis とともに同じ分岐群を結成した G. costata, G. vilersiana, G. dulcis, G. tinctoria, G. xanthochymus のグループは G. mangostana など分岐群を別れて 外集団は遠く Garcinia 種と離れた C. inophyllum は M. siamensis より G. mangostana とほぼ系統関係が近い NJ 解析の方 ( 図 2) は Parsimonious 解析とほぼ同じ結果を出し G. mangostana および G. malaccensis は系統関係が近く G. hombroniana とともに少し離れた さらに G. costata, G. vilersiana, G. dulcis, G. tinctoria, G. xanthochymus のグループは外集団によって他の Garcinia 種を離れている 様々な Garcinia 種の進化を表すことになった 結論 ( まとめ ) 核ゲノムに存在する ITS 領域 (Yapwattanaphun ら 2004;Nazre ら 2007) または GBSSI 遺伝子 (Sweeney, 2008) および葉緑体ゲノムまたはミトコンドリアゲノムに存在する母性遺伝マーカー (Ruhfel ら 201 1) によって特徴な分岐群を明らかにした G. mangostana は G. malaccensis とともに全てのマーカーにおいて同じ分岐群にまとめされた それぞれの MaximumPersimonious および BayesianPosterior および MaximumLikelihood において分岐群を強い それぞれのマーカーにおいて別の Garcinia 種の G. hombroniana は G. mangostana とともに同じ単系統群にまとめた (Yapwattanaphun ら 2004;Nazre ら 2007; Sweeney, 2008; Ruhfel ら 2011) または G. celebica, G. porrecta (Sweeney, 2008), G. Penangiana (Nazre ら 200 7;Ruhfel ら 2011), G. opaca (Sweeney, 2008; Nazre ら 2007), G. rigida, G. cataractalis (Sweeney, 2008), G. rostrata, G. speciosa, G. sizygiifolia (Yapwattanaphun ら 2004) は G. mangostana とともに同じ単系統群を形成した だが G. porrecta は Yapwattanaphun ら (2004) によって G. mangostana とともに側系統群を形成した Richard (1990) によって G. mangostana は形態学的分析を用いて G. malaccensis および G. hombroniana を交雑した後代と報告した 分子マーカーの解析を用いて他の近縁類は G. mangostana とともに近く系統関係しても 表現型の異なるの割合が高い たとえば G. rostrata は果実が大きく 成熟すると 果色が赤になる G. speciosa は樹高が大きく 果実が小さく 成熟にすると果皮が真っ赤くなる G. mangostana の中で ITS1 および ITS2 領域に存在する変異が見つかった Yapwattanaphun (2004) および Sweeney(2008) にある解析した G. mangostana は1つの個体が異なった BayesianPosterior 法 (Sweeney, 2008) により変異が小さい または Yapwattanaphun (2004) の結果により1つの G. mangostana は ITS1 領域に T/C 塩基を挿入したと報告した G. mangostana は2つの祖先ではなく 他の近縁類も G. malaccensis とともに交雑する可能性がある 3

4 図 1 Unordered-PAUP 解析により系統樹 図 2Phylip v.3.57 を用いる Kimura2-parameter model of Dnadist の遺伝距離により NJ 法の系統樹 4

5 Garcinia 属および近縁類における系統関係及び花模様の多様性を検討 ITS 領域および GBSSI(Granule-bound Starch Synthase I/ 顆粒性澱粉合成酵素 -I の遺伝子 ) によって59 の Garcinia 種を解析した GBSSI はアミロース合成をする遺伝子である ITS 領域は ITS/1 (Urbatsch ら 2000) および ITS-4 (White ら 1990) を用いて ITS1, 5.8S, ITS2 の配列を増幅した Manihot esculenta (X74160), Arabidopsis thaliana (AY123983), Solanum tuberosum (X83220) から開発したプライマーを用いて GBSSI を増幅した ITS 領域および GBSSI 領域から Bayesian 系統樹は maximum parsimony 法 Bayesian-Posterior 法 maximum likelihood 法を基づいた系統樹を作成した 主なグループは Symphoniase Garcinieae 外集団という3 つのグループを分類した Garcinieae グループは9つの分岐群 (Clade) を分類した その中に東南アジアからの G. mangostana および近縁類は分岐群 6 号 (Clade 6) にまとめた 5つの G. mangostana 個体のうち1つは異なった それに G. malaccensis は G. mangostana とともに同じグループをまとまった (BP: 1.0; MP:99; ML:93) G. hombroniana, G. celebica, G. rigida, G. porrecta, G. opaca var. dumosa, G. cataractalis の近縁類も同じ分岐群を示分類した (BP: 1.0; MP: ; ML:79) また 4つの G. hombroniana 個体のうち1つが異なった (BP: 1.0; MP:100; ML:100) 5

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7 栽培された Garcinia 種および近縁類と系統関係の分析 5 つの栽培される Garcinia 種および12の近縁類は ITS 領域に基づいて系統関係を解析した ITS4 および ITS5 のプライマー (White ら 1990) を用いて ITS 領域を増幅した 系統樹はそれぞれの MaximumParsimony 法及び Bayesian-Posterior を用いて作成した G. mangostana およびそれぞれの近縁類とともに Garcinia セクションとして同じ分岐群をまとめた G. mangostana は G. penangiana と同じグループにまとめた (MP: 91; BP:100) G. hombroniana および G. opaca は G. mangostana と同じ分岐群を分類した (MP:100; BP: 100) 7

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