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あいねくだら
5 years ago
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1 Euphytica 136: 1 10, MATRA, Deden Derajat 12am111s 植物生産科学専攻 Genetic diversity revealed in the apomictic fruit species Garcinia mangostana L. (mangosteen) Garcinia mangostana L. ( マンゴスチン ) のアポミクシスの熱帯果樹における遺伝的多様性 The novel molecular marker technique Randomly Amplified DNA Fingerprinting (RAF) was used to survey genetic relationships between 37 accessions of the tropical fruit G. mangostana (mangosteen) and among 11 accessions from eight other Garcinia species. Although mangosteen is believed to reproduce exclusively through apomixis, our results show that considerable genetic diversity exists within G. mangostana and between other Garcinia species. Among the 37 G. mangostana accessions examined, nine different genotypes were identified which clustered into three distinct groups based on correspondence analysis (reciprocal averaging). For 26 (70%) of the accessions no marker variation was detected over 530 loci screened. A further eight (22%) accessions exhibited very low levels of variation (0.2 1%) suggesting at least one well conserved mangosteen genotype. The remaining three accessions (8%) showed extensive variation (22 31%) compared with the majority of accessions. The three mangosteen groups were 63 70% dissimilar to the other Garcinia species investigated. The genetic diversity identified in this research will assist in the conservation of Garcinia germplasm and provides a valuable framework for the genetic improvement of mangosteen. Randomly Amplified DNA Fingerprinting (RAF) という新しい分子マーカーによって37の系統種のマンゴスチンおよび8つの Garcinia 種から 11の系統種の遺伝的関係を検討した本研究ではマンゴスチンの種内および他の近縁種の遺伝的多様性を明らかにしたマンゴスチンはアポミクシスという生殖成長を行う 37 系統種のマンゴスチンをコレスポンデンス分析により9つの遺伝子型から明瞭な三つのグループに分類した 26の系統種 (70%) は53 0の遺伝子座を用いて変異性が見つからなかった 8つの系統種 (22%) は変異が非常に小さかった (0.2 1%) このことからマンゴスチンの遺伝子型は保存されていると考えられる逆に3つの系統種 (8%) は変異が大きかった (22 31%) 3つのマンゴスチングループおよび近縁種に対して63 70% ほど遺伝子座が異なる本研究ではマンゴスチンの保管管理および改良のため遺伝的多様性を分析した研究を重視する

2 緒言 Garcinia 属とは Guttiferae (Clusiaceae) 科において比較的大きい属である西アフリカから熱帯アジアのフィジー島へ分布している約 400 種が含まれる常緑樹および低木である (Fairchild, 1930; Corner, 1988) 多くの種は可食でありマンゴスチンは Guttiferae 科において主な果実であるしたがってマンゴスチンは熱帯果物の女王と呼ばれている (Fairchild, 1915; Lim, 1984) マンゴスチンの起原はマレーシアにおいて栽培作物として発見したと考えられる (Verheij, 1991) マンゴスチンはおよそ1000 年前から500 年前において栽培が始まったと考えられる (AJ Richards, いわゆる私信 ) 東南アジアにおいては家庭栽培作物として栽培された前世紀には北側のオーストラリアを含む熱帯地域においてマンゴスチンが分布したマンゴスチンは耐性が低く熱帯地域においてしか栽培されていない (Wieble ら, 1992) マンゴスチンは通常種から繁殖し栄養繁殖 ( 接ぎ木および挿し木 ) ではあまり成長しない (Verheij, 1991) 世界におけるマンゴスチンの収穫量は年間およそ15 万トンであり (Ross 1997) タイが85% の生産量を占めるマレーシアおよびインドネシアも主なマンゴスチンの産地である (Wieble ら, 1992) マンゴスチンは雌雄異株植物だが雄株は正常に機能しないと考えられる (Richards, 1990) そのためマンゴスチンは雌株しか持たないと言えるが雄株が別の近縁種を持つという報告もある雌花は雄蕊が不機能であり (Lim, 1984) 種は不定胚生殖としてアポミクシスを行う (Sprecher, 1919) マンゴスチンはマレーシアの野生種の G. hombroniana (2n=48) および G. malaccensis (2n = 42) とともに交雑することで倍数性植物となり複二倍体と呼ばれる不定胚生殖によって雌株だけで生殖を行い栄養繁殖する (Richards, 1990) マンゴスチンは不定胚生殖を行うので遺伝的変異が小さいマンゴスチンは雌株を持たないので生殖は絶対にアポミクシスによって行われるさらにマンゴスチンの個体群内における遺伝的多様性は低いと考えられる異なる国における定位果樹および果実はほぼ同じであると報告された (Almeyda および Martin, 1976) 変異したマンゴスチンは不成長および異なる樹形の特徴果実の収穫量および大きさの違いおよび幼若木期間の違いが見られると報告されたた (Almeyda および Martin, 1976) 例えばフィリピンのスル島で果皮の薄いものおよび酸っぱい果肉を持つ変異が発見された (Burkill, 1966; Corner, 1988) 多くの熱帯果物の一つであるマンゴスチンは科学的な注目が低く興味を持つ研究者は少ないマンゴスチンの育種改良のため変異したマンゴスチンを保存するマンゴスチン種内および種間および近縁種の遺伝的多様性を調査するために本研究では新しい遺伝子マーカー (Randomly Amplified DNA Fingerprinting (RAF; Waldron ら, 2002) ) を用いてクイーンズランド州のオーストラリアから収集した37のマンゴスチンおよび8つの Garcinia 属の遺伝的変異を分析する材料および方法植物材料クイーンズランド州の13ヶ所の果樹園および4ヶ所の別の場所 ( 森林公園など ) から 48 系統種のマンゴスチンおよび8つの Garcinia 種から葉を収集したサンプルは DNA 抽出するまで 70 0 C で保存した ( 表 1 図 1)

3 DNA 抽出改良した CTAB 法 (Doyle および Dolye 1990) によって冷凍した葉から全ゲノム DNA を抽出するサンプルはコンタミネーションが大きい場合は 7.5 M 酢酸アンモニウム倍量の分量のイソプロパノールを処理し DNA 沈殿は70% エタノールで洗浄し TE バファーを溶かす 300mg の葉をつぶし 1mlCTAB を加え 8000x g で遠心分間 20 0 C を保った 7 0% エタノールで DNA を洗浄し乾燥する図 1 Garcinia のサンプルを収集した地域 (A-L) PCR 条件 μL の TE バファーを溶した 1xTAE バファーの 0.8% ゲールを用いて電気泳動を行いエチブロで染色した DNA 抽出の手順 Waldron ら (2002) の RAF 法による PCR 条件を設定する各サンプル (10μL) は 10 mm Tris ph 8.0, 10 mm KCl, 5 mm MgCl2, 20µM dntps, 1.5 Units Amp- litaql Stoffel Fragment DNA polymerase (Roche Diagnostics Australia, Castle Hill, NSW), 1.0µCi α- labelled 33 P-dATP, 5µM single 10-mer オリゴプライマー (Operon 社 ) 34 個プライマーの検討を行うポリアクリルアミドゲル電気泳動電気泳動のため 10μL の色相 (98% (v/v) formamide, 10 mm EDTA ph 8.0, 0.05% (w/v) Bromophenol Blue, 0.05% (w/v) xylene cyanol) を各サンプルに加える RAF 産物は3 分間 94 0 C で変性し冷やし 1xTBE (90 mm Tris-borate, 2 mm EDTA) の 7.5M urea を含む 4% (v/v) polyacrylamide sequencing gels (Bio-Rad Sequi-Genl GT Sequencing Cell, 50x35cm) に 2 時間 120W でサンプルを流しペパーブロットに移動し乾燥し一晩 X 線 (Kodak Biomax MR) で感光する ( 表 2) データ分析高い純度および必要な濃度を得るため DNA 濃度を検討する確実なバンドを持つ多型は反複によって確認する見られたバンドは遺伝子座によって分け各サンプルに見られたバンドがあれば1を記録しないなら0を記録する Nei & Li s similarity index (1979) によって相似を推定する系統樹分析は unweighted paired-group method using arithmetic means (UPGMA; Sneath and Sokal 1973) 法によって分析する各サンプルにあるクラスターを比較するためコレスポンデンス分析の平均によって分類方法を分析する

4 表 1 検討した Garcinia 種のサンプル (a) 図 1を参照する地図 (b) 同じ苗圃から採集した (c) グループ1と遺伝的に同じ表 2 各 RAF プライマーを用いて Garcinia mangostana を検出したマーカー数 Operon 社によるプライマーのシーケンスおよびデザインを利用する

5 図 2 代表 RAF の PCR 産物の G. mangostana を表すサンプルは4% ポリアクリラミドゲルで BB-18 を用いた PCR 産物である PCR 産物のサイズは bp である 39 および 43 のサンプルは代表的なマンゴスチンのサンプルだが変異が見られない 1 および 2 の列 : 39; 3 および 4 の列 : 43 のサンプル ; 5 および 6 の列 : 41 のサンプル ; 7 および 8 の列 : 42 のサンプル ; 9 および 10 の列 : 44 のサンプル. 結果予備実験では 34 個のプライマーを用い何個かのマンゴスチンのサンプルを検討した 8つのプライマーでは最も多型が見られマーカーが見やすく一致したさらに次回の分析内容を決定した RAF を用いたマンゴスチンの分析は図 2に示すすべての遺伝子座 (550) の中で37サンプルのマンゴスチンを検討し 9つの遺伝子型が判明した 37サンプルを分析したところ26のサンプル (70%) では多型が見られず 8のサンプル (22%) は多型が小さく (0.2-1%) 3つのサンプル (8%) のサンプルが大きい多型を示した (22%) 主な RAF マーカーは反復の DNA サンプルによって非常に再現性が高いしたがって 3つの多型性マーカーを用いたときのサンプルは増幅しないので次回の分析からは除外する UPGMA によるクラスター分析で37サンプルから異なる3つの系統樹を作成したグループ1は34のサンプルから7つの異なる遺伝子型グループ2は1つのサンプルしのみでありグループ3は2つの同じのサンプルを分類した 3つのグループは 23 31% の異なるマーカー値を示したさらにグループ1 内ではコレスポンデンス分析によって細分分析を説明する ( 図 3) 再現性 RAF マーカーで表現は2つの遺伝子型からの各 G. forbesii, G. dulcis, G. warrenii および1つの遺伝子型から G. cambodia, G prainiana, G griffithii および野生種および G. mangostana のグループから1つの例を解析する様々な表現が現れ Garcinia 属の中で遺伝的分けられる 1483マーカーを用いすべての種から解析しすべてのサンプルで 17 個のマーカーしか増幅されていない ( 図 5) 図 3 UPGMA によって RAF マーカーデータによるマンゴスチン種内の変異

6 さらに Garcinia 種内において主な異なる表現型も調査した例えは雌雄同株および雌雄異株の G. forbesii 果肉が甘いか酸っぱいの G. dulcis 栽培種か野生種かの G. warrenii G. mangostana ではクイーンズランド州においてグループ2かグループ3のサンプルから異なる生態のマンゴスチンを調査したグループ2かグループ3のマンゴスチンは正常なマンゴスチンのグループ1と同じ樹姿でも枝が上に向かうなどの変異がみられた調査した時グループ3は果実が出ていなかったいくつかサンプルの変異性表現型をグループ1で調査した 2つのサンプル (30および32) は非常に大きい果実を持つが成長が悪い悪い形の32のサンプルは異なる地域で採集した種子である正常な成長および結実のグループ1(29および31) は同じ果樹園から収集した ( 図 4) 図 4 コレスポンデンス分析によるマンゴスチンのグループ1の解析 2 次元の異なる RAF マーカーのマンゴスチンのグループ1 図の中にある数字はマンゴスチンのサンプル番号である縦軸 1が43,8% であり横軸 2が27,8% である残りが28,4% であり分布した変異性がある 2 次元のブロットはすべての変異性を表す図 5 RAF の PCR 産物の Garcinia サンプルを表すこのサンプルは4% ポリアクリラミドゲルで AB-16 における PCR 産物を表す PCR 産物のサンプルは bp である 1,2,49,50 は代表的なマンゴスチンのサンプルである 1 列 : 1 のサンプル (G. mangostana); 2 列 : 2 のサンプル (G. mangostana); 列 3: 49 のサンプル (G. mangostana); 例 4: 50 のサンプル (G. mangostana); 列 5: 47 のサンプル (G. warrenii); 列 6: 48 のサンプル (G. dulcis); 列 7: 12 のサンプル (G. forbesii); 列 8: 7 のサンプル (G. griffithii); 9 列 : 11 のサンプル (G. sp.); 列 10: 13 のサンプル (G. cambodia); 列 11: 14 のサンプル (G. prainiana); 列 12: 15 のサンプル (G. livingstonei).

7 植物園で栽培される 49 のサンプルおよび 50 のサンプルは結果期が異なる 50 のサンプルは 49 のサンプルよりも 1 のサンプルや 2 のサンプルの方に近い 50 はオーストラリアにおいて 1 や 2 の導入された期間と異なりまた異なる栽培者によって導入されたがおそらく同じ種子と考えられる他のサンプルのグループ 1 内ではすべての表現型が正常である一方いつかのサンプル (18,25,26,27,34) は異なる表現型が見られ遺伝的には変わらない結論本研究ではオーストラリアにおいてそれぞれの異なる遺伝子型および表現型のマンゴスチンが見つかった 4 つの種類の遺伝的変異はすべてのサンプルで検討した並び順番は種間種内マンゴスチン間マンゴスチン内であるすべての遺伝的変異はマンゴスチン内以外主な異なる表現型を明らかにした遺伝子型に対して起原の関係は見つからない 37 のマンゴスチンの持っている遺伝的変異の要因も考察した初めに 3 つのマンゴスチングループの大きな変異はマンゴスチンの起原から自然な交雑によって生まれたマンゴスチンは染色体倍加によって G. hombroniana および G. malaccensis の交雑が生まれたと考えられる (Richards, 1990) 交雑なら他のサンプルも出来る可能性が高く連続した栽培によって保管されるしかしながら本研究では親のサンプルを採集していなかった詳しい研究では G. hombroniana および G. malaccensis の起原をすすめたいこれに 3 つのグループの変異の原因はマンゴスチンと近縁種の雄株と一回以上戻し交雑したことによる (Richards, いわゆる私信 ) マンゴスチンおよび G. hombroniana/g.malaccensis を戻し交雑した結果は失敗だと報告した (Richards, 1990) 図 6UPGMA RAF によってデータを用い Garcinia 種内において系統樹を表す解析したサンプルは系統樹を表す数字であるマンゴスチンのサンプルは 1,2,3 の番号を表す 1483 マーカーのうちに 17 マーカーを共有した last joining value (29.5%) であるゲノムの中に起った突然変異は編制無融合種子形成により徐々にたまっていた (Richards, 1986) マンゴスチンの遺伝的多様性の原因だと考えられる本研究では突然変異が起ったマンゴスチンを明らかにした一般的に突然変異による変異は小さく交雑の方が変異が高いアポミクシスによるマンゴスチンは特異な繁殖である多くのアポミクシスには栄養繁殖および有性繁殖の種類がある本研究では 530 の遺伝子座から分析した 26 のサンプルが同じ遺伝子型であると明らかにしさらに遺伝子型は 1 つの同遺伝子型個体群だと考えられるこのサンプルは異なる収集した場所から取り込むのを報告したおそらく組換え型は非常に低い (Mes, 1998)

図 7 変異性表現型において遺伝的多様性を表すサンプル内を調査した左側の果実はグループ2の代表表現型である右側は正常なマンゴスチンである比較するとグループ2の大きさはグループ1より大きい編制無融合種子形成は絶対に遺伝的組換えがない Limonium cavanillesii の絶対的アポミクシスは RAPD マーカーを用いても多型が見られない (Palacios &

8 図 7 変異性表現型において遺伝的多様性を表すサンプル内を調査した左側の果実はグループ2の代表表現型である右側は正常なマンゴスチンである比較するとグループ2の大きさはグループ1より大きい編制無融合種子形成は絶対に遺伝的組換えがない Limonium cavanillesii の絶対的アポミクシスは RAPD マーカーを用いても多型が見られない (Palacios & González-Candelas, 1997) それでも遺伝的変異はいつか絶対的アポミクシスを行う可能性がある(Richards, 1986) 本研究ではマンゴスチン内での変異性を明らかにしたつまり 3つのグループの原種は3つ以上あると考えられるマンゴスチンは1つのクローンが分布していると仮定したが (Richards, 1990; Verheij, 1991) これは協議中である同じようなマンゴスチンの多様性のレベルを明らかにした研究ではオーストラリアでマンゴー品種内の研究により報告された (Bally ら, 1996) この研究ではアポミクシス繁殖された Kensington pride 品種内で変異が小さいと報告したマンゴーの個体群では環境影響は遺伝子より大きな影響を及ぼすマンゴスチンでも環境影響か栽培技術が表現型に影響を及ぼすと考えられる ( 表 1) 例え 530の遺伝子座で検討したおよび34は遺伝性を同じだが表現型は異なるこれから栽培技術はマンゴスチンの収量および品質にとって重要である栽培管理方法 ( 剪定か遮光など ) も栽培者によってマンゴスチンの改良を進めると報告した Garcinia mangostana は倍数体であり染色体数もまだ明らかにしない異なる染色体 (2n = 76, 96, 88 90, ) を数えたものも報告したが非常に小さい染色体なので信憑性がない (Richards, 1990) これから細胞学的研究も異なるサンプルを調査したいと考えている RAF マーカーは AFLP マーカーおよび RAPD マーカーと同じような優性遺伝子を持つヌル対立遺伝子座は検出できない優性マーカーとして個体群の研究は制限されている Waldron ら (2002) によって小さい割合の RAF マーカーはマカデミアにおける共優性マーカーの一部がある本研究では共優性マーカーとして行わないアポミクシスの Dandelion (Van der Hulst ら, 2000), bahigrass (Liu ら, 1994), dallisgrass (Casa ら, 2002) はこの優性マーカーで遺伝的多様性を解析したマンゴスチンの育種は種間交雑が難しいので新しい技術を開発することが必要である例えば組織培養である (Goh ら, 1994; Normah ら,1995, Te-chato & Lim, 1999, 2000) Carica papaya および近縁種も原形質融合および胚救出を用いた技術が成功したのでマンゴスチンでもこういう研究を進むことと考えられる研究結果はマンゴスチンの改良および保管管理のため遺伝的情報が必要今後の研究では細胞学的分析において他のサンプルを分析し違う起原のマンゴスチンおよび G. hombroniana および G. malaccensis の近縁種も分析する予定である

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Microsoft Word - ２０１２ゼーミ5.docx MATRA, Deden Derajat 12am111s 2013/06/13 核 DNA マーカーにより G. mangostana および近縁類の系統関係を解析 ITS 領域データによるマンゴスチン (Garcinia mangostana) 及び近縁類 (Garcinia sp.) の系統関係の解析要約核リボソーム DNA(nrDNA) の内部転写スペーサー領域 (ITS) による G.